Quantificação de Parâmetros Vasculares em Retinas inteiras de Camundongos com Retinopatias Não Proliferativas e Proliferativas
12 de março de 2022
Este artigo descreve um ensaio bem estabelecido e reprodutível de manchas de lectina para toda a preparação da retina do montagem e os protocolos necessários para a medição quantitativa dos parâmetros vasculares frequentemente alterados em retinopatias proliferativas e não proliferativas.
Nas retinopatias, alterações vasculares são o primeiro sinal a ser detectado pelos médicos. Eles acompanham a progressão da doença, e escolhem um tratamento de acordo com essas mudanças. Vários modelos animais foram desenvolvidos para estudar diferentes estágios da patologia.
Neste trabalho, vamos mostrar como medir diferentes alterações vasculares. Para isso, vamos empregar dois modelos animais. Um deles é o modelo de rato de Retinopatia Induzida por Oxigênio, que reproduz a retinopatia da prematuridade e alguns aspectos da retinopatia diabética proliferativa.
Aqui, vamos medir áreas avasculares, áreas neovasculares, e a dilatação e tortuosidade das artérias. Em nosso laboratório, foi desenvolvido um modelo de camundongos com síndrome metabólica, que induz uma retinopatia não proliferativa. A densidade vascular e a ramificação foram avaliadas neste trabalho.
Após o sacrifício de ratos, enucleatize com uma tesoura. Fixar olhos enucleados com paraformaldeído recém-preparado por uma hora à temperatura ambiente. Sob o microscópio dissecando, remova as córneas com tesouras cortando ao longo do limbus e dissecando toda a retina.
Descarte o segmento anterior do olho e, em seguida, separe a retina do RPE-coroide. Coloque as retinas em tubos de 200 microliter. Em seguida, bloqueie e permeabilize as retinas em 100 microliters de TBS contendo 5% de sérico bovino albumin Triton durante seis horas a quatro graus com agitação suave em shaker.
Em seguida, inverta o tubo para colocar a retina no copo e remova a solução de bloqueio com pipeta. Adicione 100 soluçãos de microliter contendo isolectina. Enrole os tubos com papel alumínio para proteger as amostras da luz.
Incubar as retinas com solução de lectina durante a noite a quatro graus com agitação suave no shaker. Lave as retinas com 100 microliters de TBS-Triton por 20 minutos com suave agitação no shaker. Repita este passo três vezes.
Coloque a retina em um slide e adicione uma gota de PBS. Sob microscópio dissecado, realize quatro cortes igualmente distantes das bordas da retina em direção ao nervo óptico. Para desdobrar as pétalas da retina, use fórceps ou pequenos pedaços de papel filtro.
Certifique-se de que o lado do fotorreceptor está virado para baixo. Remova o PBS restante do slide com papel filtro. Em seguida, adicione uma mediana de montagem e deslizamento de cobertura.
Deixe secar por uma hora em temperatura ambiente. Armazene slides a quatro graus protegidos contra a luz. No microscópio confocal, coloque o slide na placa de frente para baixo.
Concentre o plexo superior da vasculatura da retina e selecione uma área para iniciar a aquisição da imagem. Defina parâmetros de laser gerais no software. Coloque as coordenadas nos eixos X, Y e Z.
Inicialize a varredura. Uma vez concluída a varredura do processo, abra a imagem e salve-a com uma extensão preferida. No software ImageJ FIJI, vá para a Barra de Menu e clique em Arquivo, Abra.
Selecione a imagem para processar. Na janela Opção de Importação de Formatos Biológicos, selecione Metadados de exibição OME-XML e clique OK.In janela OME Metadados, procure informações sobre o tamanho do pixel. Copie esses dados.
Para calibração de imagem, vá para a Barra de Menu e selecione Propriedades de imagem. Copie as informações e clique em OK. Atribua uma lut preferencial à imagem. Para visualizar tudo em pilha em uma única imagem, vá até a Barra de Menu e selecione Imagem, Pilhas, Projeto Z.
Na janela de projeção exibida, selecione todas as pilhas onde os vasos são visualizados. No Tipo de Projeção, escolha intensidade média e clique em OK. Vá para a Barra de Menu, Imagem, Ajuste, Brilho/Contraste. Clique em Aplicar e salvar alterações.
Copie os parâmetros selecionados para brilho e contraste. Devem ser idênticas para todas as imagens. Na Barra de Menu, escolha a ferramenta Varinha.
Selecione a área de retina que não tem vasos formados. Pressione T no teclado para gravar as áreas selecionadas no ROI Manager. Clique em Medir no Gerenciador de ROI para obter as informações da área avascular.
Repita estas etapas para medir a área total da retina. Na Barra de Menu, escolha a ferramenta Varinha. Amplie a imagem para visualizar melhor os neovexes.
Selecione os neovessels um a um com a ferramenta Varinha. Pressione a letra T no teclado para gravar a área selecionada no ROI Manager. Clique em Medir no Gerenciador de ROI para obter os dados da área.
Na Barra de Menu, selecione a ferramenta Linha Reta. Amplie a imagem para visualizar melhor a parede do vaso. Realize três linhas transversais para o navio principal antes do primeiro ramo.
Pressione T no teclado para gravar as áreas selecionadas no ROI Manager. Clique em Medir no Gerenciador de ROI para obter os dados de distância. Na Barra de Menu, clique no ícone da linha reta com o botão direito do mouse e selecione Linha Segmentada.
Desenhe uma linha dentro do vaso do nervo óptico até a primeira ramificação do vaso, seguindo a forma vascular. Pressione a letra T no teclado para gravar a área selecionada no ROI Manager. Na Barra de Menu, selecione a ferramenta Linha Reta.
Desenhe uma linha do nervo óptico até a primeira ramificação do vaso. Pressione a letra T no teclado para gravar a área selecionada no ROI Manager. Clique em Medir no Gerenciador de ROI para obter os dados de distâncias.
Com a ferramenta Oval da Barra de Menus, defina uma área aplicada igualmente a todas as condições experimentais. A área selecionada deve ser um círculo concêntrico desenhado em torno do nervo óptico. Pressione a letra T no teclado para gravar a área selecionada no ROI Manager.
Manualmente, conte o número de ramos primários decorrentes de vasos principais dentro da área de seleção. Transforme a imagem no modo de 8 bits. Vá para Plugins na Barra de Menu, selecione Análise de Vasos, Densidade Vascular.
Defina uma área com a ferramenta Quadrado da Barra de Menu onde você deseja medir a densidade do vaso. Clique ok. O programa exibirá uma nova janela com as informações necessárias. No primeiro exemplo experimental, o modelo de rato de retinopatia induzida por oxigênio foi empregado.
Injeções intravitárias foram realizadas no pós-natal dia 12 para determinar a eficácia de uma droga como antiangiogênico. Ratos injetados com veículo foram empregados como controle. As áreas avasculares são definidas como as zonas que carecem de vasos sanguíneos da retina.
A partir das imagens adquiridas, as áreas avasculares podem ser quantificadas como a soma das regiões sem vasos divididos a área total da retina. Áreas com danos mecânicos também mostram ausência de embarcações. Para identificar áreas danificadas, analise a integridade das camadas neuronais com a mancha de Hoechst.
Neovessels são embarcações de pequeno calibre que se originam de vasos pré-existentes do plexo vascular superior. Calculamos a área ocupada pelos tufos dos neovessels quantificando a área neovascular da retina ocupada pela área total da retina. Como a forma e o tamanho dos neovexes são variáveis, ocasionalmente, eles podem parecer semelhantes a detritos e artefatos.
Para distinguir neovexes, verifique se o tufo cresce de um vaso maduro. Para a análise da dilatação, medimos o diâmetro principal do vaso em três alturas antes do primeiro ramo. Os pesquisadores devem definir uma distância predeterminada para medir o diâmetro do vaso, a fim de reduzir a variabilidade entre os resultados.
Idealmente, o ponto mais distante do nervo óptico deve ser em torno de 300 micrômetros. Sugerimos realizar a análise e, posteriormente, uma média de pelo menos seis animais por condição. Quanto à tortuosidade, medimos a distância percorrida pelo vaso principal seguindo sua forma, respeito à distância em linha reta entre o nervo óptico e o primeiro ponto de ramificação.
Como podemos ver na imagem, há heterogeneidade na sinuosidade dos principais vasos. Para obter um resultado representativo, não é necessário quantificar não menos que seis camundongos por condição. Os parâmetros mais recentes, ramificação vascular e densidade, foram analisados em um modelo de síndrome metabólica que apresenta retinopatia não proliferativa.
Para a medição da ramificação vascular, definimos a área de quantificação desenhando um círculo concêntrico, e então contamos, um a um, os ramos primários decorrentes de um vaso central principal. A partir das imagens adquiridas, a densidade vascular foi quantificada como área ocupada por vasos divididos pela área do ROI, que foi posicionada em diferentes locais em cada microfotografia. Evite quantificar áreas com danos mecânicos.
Se houver mais de duas áreas com punções, a retina deve ser descartada. Em resumo, neste artigo, temos mostrado técnicas clássicas, bem estabelecidas e reprodutíveis para quantificar alguns dos parâmetros mais relevantes que tomam conta da prática clínica.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um ensaio de coloração com lectina projetado para preparações retinianas em montagem inteira, com o objetivo de medir quantitativamente parâmetros vasculares associados às retinopatias. O estudo utiliza dois modelos animais: camundongos com retinopatia induzida por oxigênio e um modelo de camundongo com síndrome metabólica, concentrando-se nas alterações vasculares fundamentais na progressão das retinopatias.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Retinopatia
- Biologia Vascular
Contexto
- Alterações vasculares são indicadores precoces na progressão das retinopatias.
- Modelos animais são fundamentais para estudar diferentes estágios das patologias retinianas.
- O ensaio foca na medição da densidade vascular, áreas avasculares e neovascularização.
Objetivo do Estudo
- Detalhar um método reprodutível para analisar alterações vasculares em preparações retinianas.
- Investigar parâmetros vasculares específicos relacionados às retinopatias proliferativas e não proliferativas.
- Apoiar a identificação da eficácia do tratamento com base em alterações vasculares.
Métodos Utilizados
- As avaliações vasculares foram realizadas utilizando preparações de retina inteira de camundongos.
- O estudo empregou o modelo de retinopatia induzida por oxigênio em camundongos e um modelo de síndrome metabólica.
- As retinas foram coradas com isolectina e analisadas por microscopia confocal.
- Os passos principais incluíram fixação, coloração e diversas técnicas de imagem para análise quantitativa.
Resultados Principais
- O estudo quantificou com sucesso áreas avasculares e neovasculares, bem como características dos vasos, como dilatação e tortuosidade.
- Os resultados oferecem insights sobre a dinâmica vascular relacionada a diferentes tipos de retinopatias.
- O ensaio permite a medição consistente de parâmetros vasculares críticos na pesquisa retiniana.
Conclusões
- Este estudo demonstra um método eficaz para investigar alterações vasculares em patologias retinianas.
- Os achados aprimoram a compreensão dos mecanismos da doença e podem orientar possíveis intervenções terapêuticas.
- O protocolo enriquece o conjunto de ferramentas para pesquisadores que estudam a dinâmica vascular da retina.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação quantitativa de parâmetros vasculares da retina permite a redução de riscos mecanicistas em modelos pré-clínicos de retinopatia, apoiando a validação de alvos e a clarificação de vias. O método fornece confiança preditiva para a avaliação de intervenções antiangiogênicas por meio da medição de áreas avasculares e neovasculares, diâmetro dos vasos, tortuosidade e ramificação. Isso posiciona o ensaio como uma ferramenta de biomarcador translacional para descoberta precoce e triagem de portfólio no desenvolvimento de medicamentos oftálmicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas mediante a quantificação de alterações vasculares em modelos de retinopatia induzida por oxigênio e de retinopatia associada à síndrome metabólica.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da medição padronizada de tuftes neovasculares e zonas avasculares.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao fornecer limiares quantitativos de desregulação vascular associados à progressão da doença.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas de retina em montagem inteira validados para triagem de compostos subsequentes com coloração vascular baseada em isolectina.
- Valor Operacional: Garante a padronização do ensaio por meio de protocolos fixos de coloração, imagem confocal e fluxos de trabalho de quantificação com ImageJ FIJI.
- Escalabilidade: Permite medições reprodutíveis de densidade, diâmetro e tortuosidade dos vasos em diferentes condições experimentais para avaliação confiável de compostos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta métricas vasculares da fase de descoberta à validação pré-clínica por meio da quantificação relevante para a doença de áreas avasculares e neovasculares.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Reduz a ambiguidade na modulação da via de angiogênese ao fornecer leituras diretas de ramificação e dilatação vascular.
- Confiabilidade Preditiva: Alinha-se a desfechos clínicos ao reproduzir parâmetros vasculares utilizados para classificar retinopatias não proliferativas e proliferativas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta, desde a verificação da hipótese do alvo até a identificação de compostos promissores, permitindo a fenotipagem vascular quantitativa antes dos estudos de eficácia pré-clínicos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a medição da densidade vascular e da ramificação em modelos de síndrome metabólica e retinopatia induzida por oxigênio.
- Triagem: Garante prontidão para ensaios por meio da coloração padronizada com isolectina, aquisição confocal e quantificação baseada em regiões de interesse (ROI) de parâmetros vasculares.
- Análises: Fornece métricas quantitativas, incluindo a razão da área avascular, a fração da área neovascular, o diâmetro dos vasos, o índice de tortuosidade e a contagem de ramificações primárias, para comparação entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona fenótipos vasculares ao estágio da doença ao quantificar parâmetros que distinguem retinopatia não proliferativa de retinopatia proliferativa.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de fenotipagem vascular aplicável a modelos genéticos, farmacológicos e ambientais de retinopatia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva no engajamento do alvo ao quantificar saídas vasculares funcionais em sistemas relevantes para a doença.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de procedimentos padronizados de fixação, bloqueio, incubação com lectina, lavagem e montagem.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao fornecer limiares vasculares quantitativos que reduzem riscos biológicos em estágios avançados em programas oftálmicos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco com base em alterações mensuráveis nas zonas avasculares, tufores neovasculares e patologia arteriolar.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação retiniana, preparação de montagem inteira e microscopia confocal.
- Depende da infraestrutura de microscopia de fluorescência e do ImageJ FIJI com plugins de análise vascular.
- Necessita padronização na seleção de região de interesse (ROI), configurações de brilho/contraste e profundidade de amostragem entre laboratórios.
- Deve levar em conta a variabilidade biológica, fazendo a média dos dados de pelo menos seis animais por condição.
- Limita-se à distinção qualitativa entre neovasos e artefatos, exigindo verificação da origem dos tufo a partir de vasos maduros.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:13
Introduction
1:19
Fluorescent Lectin Statining
3:31
Confocal Microscopy Visualization and Microphotograph Acquisition
4:14
Image Processing
5:31
Quantification of Avascular Areas
6:01
Quantification of Neovascular Areas
6:27
Quantification of Vessel Diameter
6:57
Quantification of Vessel Tortuosity
7:44
Quantification of Vascular Branching
8:16
Quantification of Vascular Density
8:43
Results
12:00
Conclusion
