Name: Imagem ao vivo e quantificação da infecção viral em K18 hACE2 Camundongos transgênicos usando o recombinante SARS-CoV-2 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprenda a realizar imagem ao vivo e quantificação da infecção viral em camundongos transgênicos K18 hACE2 usando SARS-CoV-2 recombinante. Este método permite avaliar terapêuticas contra a COVID-19.

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Gostaríamos de agradecer aos membros do nosso instituto (Texas Biomedical Research Institute) por seus esforços em manter nossas instalações totalmente operacionais e seguras durante a pandemia COVID-19. Gostaríamos também de agradecer ao nosso Comitê de Biossegurança Institucional (IBC) e ao Feitiço (IACUC) por revisar nossos protocolos de forma eficiente. Agradecemos ao Dr. Thomas Moran da Escola de Medicina Icahn do Monte Sinai por fornecer o anticorpo monoclonal de proteína sars-CoV 1C7C7 (N) proteína. A pesquisa SARS-CoV-2 no laboratório de Martinez-Sobrido é atualmente apoiada pelas bolsas NIAID/NIH RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 e R43AI165089-01; o Departamento de Defesa (DoD) concede W81XWH2110095 e W81XWH2110103; a Parceria de San Antonio para a Precision Therapeutic; o Fórum do Instituto de Pesquisa Biomédica do Texas; o Centro de Ciência da Saúde da Universidade do Texas em San Antonio; a Fundação Médica de San Antonio; e pelo Centro de Pesquisa em Patogênese e Transmissão da Influenza (CRIPT), um Centro de Excelência para Pesquisa e Resposta à Influenza (CEIRR, contrato nº 75N93021C00014).

Protocolos envolvendo camundongos transgênicos K18 hACE2 foram aprovados pelo Comitê de Biossegurança Institucional (IBC) do Texas Biomedical Research Institute (TBRI) e pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC). Todos os experimentos seguem as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Conselho Nacional de Pesquisa40. Os EPI (Personal Protection Equipment, equipamento de proteção individual) apropriados para trabalhar com camundongos.
1. Uso de camundongos transgênicos K18 hACE2
<ol><li>Compre e mantenha camundongos B6.Cg-Tg femininos de 4-6 semanas de idade (K18-ACE2)2Prlmn/J (camundongos transgênicos K18 hACE2) em um nível de biossegurança (BSL)-2 unidade de cuidados com animais em condições específicas sem patógenos.<ol>
<li>Após a chegada às instalações do BSL2, permitem que os animais se aclimatrem por 7 dias e transfiram para a instalação de animais BSL-3 para infecções e outros procedimentos experimentais.</li>
		<li>Seguindo os protocolos da IACUC, coloque 4 ratos por gaiola. Para garantir que o animal esteja morto, após infecção por camundongos com ressonância magnética rSARS-CoV-2 e in vivo , eutanize os animais com uma dose letal de Fatal-Plus (>100 mg/kg).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Biossegurança
NOTA: Neste manuscrito, o rSARS-CoV-2 é gerado utilizando os sistemas genéticos reversos baseados em BAC para a cepa SARS-CoV-2 USA-WA1/2020, como descrito anteriormente37. Todos os procedimentos in vivo envolvendo as infecções por rSARS-CoV-2/Nluc ou rSARS-CoV-2/Venus devem ser realizados em um gabinete de segurança biológica sob condições BSL-3.
<ol><li>Limpe o armário de biossegurança com 2% de Wexicide e 70% desinfetante de etanol sequencialmente antes e depois de realizar todos os procedimentos experimentais descritos neste artigo.</li>
	<li>Esterilizar todo o material de dissecção (tesoura, dissecando fórceps, etc.) e o homogeneizador antes e depois de cada uso.</li>
	<li>Limpe a câmara de isolamento e desinfete usando comprimidos MB10 antes e depois de cada uso de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Descarte todo o material biológico produzido durante os procedimentos seguindo as diretrizes do IBC e do IACUC.</li>
</ol>3. Caracterização in vivo do rSARS-CoV-2
<ol><li>Infecções de camundongos<ol>
<li>Coloque camundongos transgênicos K18 hACE2 fêmeas de 4-6 semanas em gaiolas rotuladas, identifique os ratos em cada gaiola usando um código de perfuração de ouvido e coloque 4 ratos por gaiola. Use um grupo de camundongos para peso corporal e sobrevivência e outro grupo de animais para titulação viral e imagem.</li>
		<li>Antes da infecção, raspe o peito de camundongos no lado ventral do mamilo peitoral até a área do mamilo inguinal para facilitar o sinal de bioluminescência.</li>
		<li>Prepare o inóculo rSARS-CoV-2 com 105 unidades formadoras de placas (PFU)/mouse em condições estéreis em um volume total de 50 μL usando soro fisco tampão de fosfato estéril de 1x (PBS). NOTA: Calcule a quantidade de rSARS-CoV-2 a ser usada na diluição viral com a fórmula: vírus necessário = (105 PFU por mouse / 50 μL) x volume final) / título viral de estoque.</li>
		<li>Mantenha o vírus inóculo refrigerado no gelo.</li>
		<li>Use os camundongos infectados por simulação (1x PBS) e os camundongos infectados por RSARS-CoV-2/WT como controles internos. Coloque os camundongos infectados por simulação em uma gaiola separada do que os camundongos infectados por RSARS-CoV-2.</li>
		<li>Anestesiar os camundongos usando sedação gasosa isoflurane de 5% em uma câmara de anestesia e manter com 3% de isoflurane.</li>
		<li>Uma vez confirmada a reação postural e o reflexo de redocimento, coloque o rato na posição de recumbência dorsal.</li>
		<li>Esmague o pescoço do rato entre o dedo indicador e o polegar e segure a cauda contra a palma da mão com o dedo mindinho para segurar o animal em uma posição dorsal.</li>
		<li>Coloque a ponta da pipeta contendo 50 μL do vírus inóculo na narina e ejete lentamente a solução. Certifique-se de que o vírus inóculo é inalado e não há refluxo observando a queda do inóculo desaparecendo.</li>
	</ol></li>
	<li>Bioluminescência monitorando camundongos transgênicos K18 hACE2 infectados com rSARS-CoV-2/Nluc (Figura 1 e Figura 2) NOTA: Este experimento segue a representação esquemática e usa os vírus exibidos na Figura 1. Um acessório de anestesia isoflurano é necessário para o sistema de imagem in vivo (IVIS). Consulte Tabela de Materiais para obter detalhes dos instrumentos e sistemas necessários.<ol>
<li>Inicie o software de imagem e configure os parâmetros, clique no modo de imagem para Bioluminescência, abra o filtro e defina o tempo de exposição para auto.</li>
		<li>Ao inicializar a máquina IVIS, coloque os ratos na câmara de isolamento enquanto ainda estiver dentro do armário de biossegurança. Induzir camundongos com isoflurane a uma concentração de 5%. Uma vez confirmada a perda da reação postural e o reflexo de redocimento, mantenha-se com 3% de isoflurane.</li>
		<li>Uma vez que os ratos sejam anestesiados, remova-os da câmara de isolamento e administre retro-orbitalmente o substrato luciferase diluído 1:10 em 1x PBS (volume final 100 μL/mouse) com uma agulha de 25 G.</li>
		<li>Após a administração do substrato da luciferase, coloque os ratos de volta na câmara de isolamento com os peitos voltados para cima e cavidade nasal dentro do cone coletor para manter o animal anestesiado durante o procedimento de imagem.</li>
		<li>Transfira a câmara de isolamento para a máquina IVIS e, instantaneamente, após o fechamento da porta do imager IVIS, selecione Adquirir no programa de software para inicializar (Figura 2A).</li>
		<li>Para analisar as imagens de bioluminescência adquiridas, utilize a ferramenta ROI (região de interesse) no software para designar o sinal preciso e medir o fluxo (Figura 2B).</li>
		<li>Clique em Medir e deixe que o sistema comece a avaliar a bioluminescência em fótons para fornecer a emissão absoluta de fótons comparável às medições de saída fornecidas pelos vários parâmetros.</li>
		<li>Ratos de imagem em 1-, 2-, 4 e 6 dias após a infecção.</li>
		<li>Depois de imagens coloque os ratos de volta na gaiola.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise de fluorescência em camundongos transgênicos K18 hACE2 infectados com rSARS-CoV-2/Vênus (Figura 3 e Figura 4) NOTA: Este experimento segue a representação esquemática e o rSARS-CoV-2 mostrado na Figura 3. Consulte Tabela de Materiais para obter detalhes dos instrumentos e sistemas necessários.<ol>
<li>Inicie o software de imagem e configure os parâmetros, defina excitação (500 nm) e filtros de emissão (530 nm), clique no modo de imagem para Fluorescência e defina o tempo de exposição para auto.</li>
		<li>Eutanizar intraperitoneally os camundongos usando uma dose letal de Fatal-Plus (>100 mg/kg). Após a eutanásia, desinfete o local da incisão com 70% de etanol.</li>
		<li>Usando pinças, puxe a pele, faça uma incisão do esterno para o abdômen e corte a incisão dos lados com uma tesoura. Corte a veia hepática para minimizar a quantidade de sangue nos pulmões e evite sinais de fundo elevados durante a imagem.</li>
		<li>Usando uma tesoura, corte o esterno e abra a caixa torácica. Em seguida, corte a extremidade da traqueia com uma tesoura e remova os pulmões com pinças.</li>
		<li>Coloque os pulmões excisados em uma placa de 6 poços contendo 2 mL de PBS 1x e enxágue para remover o excesso de sangue. Minimizar a possibilidade de contaminação entre amostras por desinfecção e limpeza de ferramentas cirúrgicas entre amostras utilizando 70% de etanol.</li>
		<li>Depois de inicializar a máquina IVIS, coloque os pulmões em uma bandeja preta e separe os tecidos uns dos outros.</li>
		<li>Coloque a bandeja dentro da câmara de isolamento dentro do armário de biossegurança e, em seguida, transfira a câmara de isolamento para o IVIS. Feche a porta e clique em Adquirir para iniciar o sistema de imagem (Figura 4A).</li>
		<li>Para analisar a fluorescência, utilize a ferramenta ROI e desenhe ROIs em torno de cada um dos pulmões individuais. Meça cada ROI manualmente e, em seguida, use os valores médios de eficiência radiante dados e subtrai-se dos ratos infectados por simulação (Figura 4B).</li>
		<li>Uma vez que a imagem esteja completa, coloque os tecidos no gelo para análise no mesmo dia ou em um criobotube para congelamento de gelo seco para armazenar a -80 °C para processamento posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagem de campo brilhante pulmonar e pontuação patológica de camundongos transgênicos K18 hACE2 infectados com rSARS-CoV-2/Nluc (Figura 2A-C) e rSARS-CoV-2/Venus (Figura 4A-C)<ol>
<li>Após a bioluminescência de imagem de camundongos infectados com rSARS-CoV-2/Nluc, rSARS-CoV-2/WT e simulados infectados, devolva os ratos para suas gaiolas. Prossiga com eutanásia e a imagem de campo ex vivo brilhante de pulmões de camundongos (Figura 2A).</li>
		<li>Após a imagem ex vivo fluorescência de pulmões de camundongos infectados, pegue imagens de campo brilhante dos pulmões (Figura 4A).</li>
		<li>Analisar as lesões brutas na superfície do pulmão usando ImageJ (Figuras 2C e 4C).</li>
		<li>Abra a imagem pulmonar a ser analisada no ImageJ.</li>
		<li>Calcule a razão entre pixel e cm, use a ferramenta Reta e meça o comprimento real da imagem.</li>
		<li>Após a seleção, clique em Analisar > Medida para calcular o comprimento dos pixels para o comprimento.</li>
		<li>Clique em Análise > Escala de Conjunto e insira os números calculados a partir da etapa anterior.</li>
		<li>Use a ferramenta Seleções à Mão Livre e selecione toda a superfície pulmonar. Clique em Analisar > Medida para medir a área pulmonar total.</li>
		<li>Clique em Editar > Seleção > Fazer Inverso para selecionar o resto da área pulmonar e pressione excluir ou voltar ao espaço para remover o fundo.</li>
		<li>Remova a área selecionada e clique em Imagem > Ajuste > limite de cores.</li>
		<li>Para selecionar a área da lesão patológica, ajuste o brilho para um mínimo (entre 1 a 50) e um máximo (entre 50 a 200), dependendo dos níveis de congestionamento e hemorragias presentes.</li>
		<li>Uma vez selecionadas lesões patológicas, clique em Selecionar na parte inferior do painel de cores limiar e clique em Analisar > Medida para medir áreas patológicas.</li>
		<li>Calcular o percentual de lesões brutas com a fórmula: % de área patológica = (medição da área patológica/superfície pulmonar total) x 100.</li>
	</ol></li>
	<li>Titulações virais (Figura 2D e Figura 4D)<ol>
<li>Ao fotografar, complete a eutanásia dos camundongos e colete pulmões, cérebro e mucosa nasal.</li>
		<li>Coloque os pulmões, cérebro e mucosa nasal em homogeneizadores de tecido estéril separados e adicione 1 mL de PBS frio 1x.</li>
		<li>Homogeneize as amostras por centrifugação a 21.500 x g por 10 minutos para detritos celulares de pelotas. Colete e transfira os supernantes em um novo tubo estéril e descarte a pelota.</li>
		<li>Se as titulações virais forem realizadas no mesmo dia, armazene os supernantes a 4 °C. Alternativamente, congele o sobrenante das amostras homogeneizadas a -80 °C até ser avaliado posteriormente.</li>
		<li>Utilizando os supernacantes obtidos a partir dos homogeneizadores teciduais fazem diluições seriais de 10 vezes e infectam monocamadas confluentes de células Vero E6 com 1 mL de cada diluição do supernacido (formato de placa de 6 poços, 1,2 × 106 células/bem, triplicados).</li>
		<li>Deixe o adsorb do vírus por 1 h a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de CO2 .</li>
		<li>Após adsorção viral, lave as células com 1 mL de 1x PBS e incuba em 2 mL de mídia pós-infecção contendo 1% de Ágar na incubadora de CO2 umidificada a 37 °C por 72 h.</li>
		<li>Após a incubação, inative as placas em formalina tamponada 10% neutra por 24 h a 4 °C, certifique-se de que toda a placa esteja submersa.</li>
		<li>Tire as placas de BSL3 e lave as células três vezes com 1 mL de 1x PBS e permeabilize com 1 mL de 0,5% Triton X-100 por 10 min à temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Bloqueie as células com 1 mL de 2,5% de albumina de soro bovino (BSA) em 1x PBS por 1 h a 37 °C, seguido pela incubação em 1 mL de 1 μg/mL do anticorpo monoclonal transativo de proteína SARS-CoV (N) (1C7C7), diluído em 2,5% BSA por 1 h a 37 °C.</li>
		<li>Lave as células três vezes com 1 mL de PBS 1x e desenvolva as placas usando o kit ABC e o kit substrato DAB Peroxidase de acordo com as instruções dos fabricantes.</li>
		<li>Calcule os títulos virais como PFU/mL. NOTA: Calcular com a fórmula PFU/mL = fator de diluição x número de placas x (volume de 1 mL/inóculo).</li>
	</ol></li>
	<li>Atividade de NICus em tecidos de camundongos transgênicos K18 hACE2 infectados com rSARS-CoV-2/Nluc (Figura 2E)<ol>
<li>Quantifique a presença de Niuc nos camundongos transgênicos simulados, rSARS-CoV-2/WT e rSARS-CoV-2/Nluc infectados K18 hACE2 camundongos transgênicos usando um ensaio de luciferase seguindo as instruções dos fabricantes.</li>
	</ol></li>
	<li>Avaliação da morbidade e mortalidade (Figura 2F, G e Figura 4E, F)<ol>
<li>Infectar camundongos transgênicos K18 hACE2 fêmeas de 4-6 semanas com 105 PFU de rSARS-CoV-2/WT, rSARS-CoV-2/Venus, rSARS-CoV-2/Nluc, ou simulado infectado como descrito na seção 3.1.</li>
		<li>Monitore e pese os camundongos ao longo de 12 dias ao mesmo tempo para minimizar a variação de peso devido à ingestão alimentar. Eutanize os camundongos que perdem 25% de seu peso corporal inicial desde que atingiram um ponto final humano e notam esses camundongos como sucumbindo à infecção viral.</li>
		<li>Após 12 dias, eutanize os camundongos que sobrevivem à infecção viral e calculam a % de mudança de peso corporal e sobrevivência.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Oliver, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advisory+committee+on+immunization+practices%27+interim+recommendation+for+use+of+Pfizer-BioNTech+COVID-19+vaccine+-+United+States%2C+December+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Report%22%5BJournal%5D)">The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine - United States, December 2020.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).</li>
<li>Oliver, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advisory+committee+on+immunization+practices%27+interim+recommendation+for+use+of+Janssen+COVID-19+vaccine+-+United+States%2C+February+2021%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Report%22%5BJournal%5D)">The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine - United States, February 2021.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).</li>
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<li>Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+stable+luciferase+dengue+virus+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening.</a> Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).</li>
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<li>Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+recombinant+Zika+virus+from+a+bacterial+artificial+chromosome+cDNA+clone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537(2019).</li>
<li>Chiem, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bifluorescent-based+assay+for+the+identification+of+neutralizing+antibodies+against+SARS-CoV-2+variants+of+concern+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo.</a> Journal of Virology. , (2021).</li>
<li>Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals.+8th+edn%5BTitle%5D)+AND+%22National+Research+Council+%28US%29%22%5BJournal%5D)">Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn.</a> National Research Council (US). , National Academies Press. (2011).</li>
<li>Ye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+SARS-CoV-2+infection+dynamic+in+vivo+using+reporter-expressing+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).</li>
</ol>

Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de qualquer conflito comercial, financeiro e não financeiro ou pessoal de interesse em relação ao trabalho descrito.

Este protocolo demonstra a viabilidade do uso desses rSARS-CoV-2 expressando genes repórteres para monitorar infecções virais in vivo. Ambos os vírus recombinantes que expressam repórteres fornecem uma excelente ferramenta para estudar infecções pelo SARS-CoV-2 in vivo. Os sistemas de imagem ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) e in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) representam uma excelente opção para entender a dinâmica da infecção pelo SARS-CoV-2, a patogênese viral e identificar células/órgãos infect...

Síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) é um vírus RNA envolto, de sentido positivo e de uma única cadeia que pertence à linhagem Betacoronavírus na família Coronaviridae 1. Esta família viral é dividida em Alpha-, Beta-, Gamma-, e Delta-coronavirus1. Alfa e Betacoronavírus infectam principalmente mamíferos, enquanto Gamma e Deltacoronavirus infectam quase exclusivamente aves2. Até o momento, sete coronavírus (CoV) cruzaram barreiras de espécies e emergiram como coronavírus humanos (HCoV): dois alfa-CoVs (HCoV-229E e HCoV-NL63) e cinco beta-CoVs (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, Síndrome Respiratória do Oriente Médio coronavírus [MERS-CoV], e SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV e SARS-CoV-2 são altamente patogênicos, causando infecção grave do trato respiratório inferior7. Antes do surgimento do SARS-CoV-2, houve dois surtos epidêmicos causados por CoVs: SARS-CoV em Guangdong Providence, China, de 2002 a 2003, com uma taxa de letalidade por casos (CFR) de cerca de 9,7%; e MERS-CoV no Oriente Médio de 2012 até hoje, com uma CFR de cerca de 34%7,8. O SARS-CoV-2 possui uma CFR global entre 3,4%-49%, com condições subjacentes contribuindo para uma CFR mais altade 8,9. Desde sua descoberta em dezembro de 2019, em Wuhan, China, o SARS-CoV-2 foi responsável por mais de 242 milhões de infecções humanas e mais de 4,9 milhões de mortes humanas em todo o mundo, 7,10,11,12. Notavelmente, desde o final de 2020, novas variantes sars-CoV-2 de preocupação (VoC) e variantes de interesse (VoI) têm impactado características do vírus, incluindo transmissão e antigenicidade 9,13, e a direção geral da pandemia COVID-19. Para o tratamento de infecções por SARS-CoV-2, atualmente existe apenas um Estados Unidos (EUA) Food and Drug Administration (FDA) antiviral (remdesivir) e um medicamento de Autorização de Uso de Emergência (EUA) (baricitinib, a ser administrado em combinação com remdesivir)14. Há também 6 anticorpos monoclonais EUA aprovados: REGEN-COV (casirivimab e imdevimab, administrados juntos), sotrovimab, tocilizumabe, e bamlanivimab e etesevimab administrados juntos 15,16,17,18,19. Atualmente, apenas uma vacina profilática aprovada pela FDA, a Pfizer-BioNTech, e duas outras vacinas profiláticas (Moderna e Janssen) foram aprovadas pela EUA 20,21,22,23,24. No entanto, com a taxa de infecção descontrolada e o surgimento de VoC e VoI, o SARS-CoV-2 ainda representa uma ameaça à saúde humana. Portanto, novas abordagens são urgentemente necessárias para identificar profiláticas eficientes e terapêuticas para controlar a infecção pelo SARS-CoV-2 e a pandemia COVID-19 ainda em curso.
Estudar o SARS-CoV-2 requer técnicas laboriosas e abordagens secundárias para identificar a presença do vírus em células infectadas e/ou modelos animais validados de infecção. O uso da genética reversa permitiu que a geração de vírus recombinantes respondesse a questões importantes na biologia das infecções virais. Por exemplo, técnicas de genética reversa forneceram meios para descobrir e entender os mecanismos de infecção viral, patogênese e doenças. Da mesma forma, abordagens genéticas reversas abriram caminho para projetar vírus recombinantes sem proteínas virais para entender sua contribuição na patogênese viral. Além disso, técnicas de genética reversa têm sido utilizadas para gerar vírus recombinantes expressando genes repórteres para aplicações in vitro e in vivo, incluindo a identificação de abordagens profiláticas e/ou terapêuticas para o tratamento de infecções virais. Proteínas fluorescentes e bioluminescentes são os genes repórteres mais comumente usados devido à sua sensibilidade, estabilidade e fácil detecção com base na melhoria das novas tecnologias25,26. In vitro, as proteínas fluorescentes têm sido mostradas como uma melhor opção para a localização de vírus em células infectadas, enquanto as luciferases são mais convenientes para estudos de quantificação 27,28,29. In vivo, as luciferases são preferidas em vez de proteínas fluorescentes para imagens animais inteiras, enquanto as proteínas fluorescentes são preferidas para a identificação de células infectadas ou ex vivo imaging 30,31,32. O uso de vírus recombinantes que expressam repórteres tem servido como uma poderosa ferramenta para o estudo de vírus em muitas famílias, incluindo, entre outros, flavivírus, enterovírus, alfavírus, lentivírus, arenavírus e vírus da gripe 28,33,34,35,36.
Para superar a necessidade de abordagens secundárias para estudar SARS-CoV-2 e caracterizar a infecção em tempo real sars-CoV-2 in vivo, geramos recombinação competente para replicação (r)SARS-CoV-2 que expressa proteínas bioluminescentes (nanoluciferase, Nluc) ou fluorescentes (Vênus) usando nossas genéticas reversas baseadas em cromossomos artificiais bacterianos (BAC), que são mantidas como uma única cópia em E. a fim de minimizar a toxicidade das sequências de vírus durante sua propagação em bactérias37,38. Notavelmente, rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus mostraram patogenicidade em forma de rSARS-CoV-2/WT in vivo. O alto nível de expressão de Vênus a partir de rSARS-CoV-2/Vênus permitiu detectar infecção viral nos pulmões de camundongos transgênicos K18 hACE2 infectados usando um sistema de imagem in vivo (IVIS)39. Os níveis de expressão de Vênus correlacionavam-se bem com os títulos virais detectados nos pulmões, demonstrando a viabilidade de usar a expressão de Vênus como um substituto válido da infecção por SARS-CoV-2. Utilizando a infecção rSARS-CoV-2/Nluc, pudemos rastrear a dinâmica da infecção viral em tempo real e avaliar longitudinalmente a infecção pelo SARS-CoV-2 in vivo usando a mesma abordagem IVIS em camundongos transgênicos K18 hACE2.

<table><tbody><tr><td>0,5% Triton X-100</td><td>J.T.Baker</td><td>X198-07</td><td>Armazenar em temperatura ambiente (RT)</td></tr> <tr><td>1% DEAE-Dextran</td><td>MP Biomedicals</td><td>195133</td><td></td></tr><tr><td>10% Solução de formalina, tamponado neutro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Oxoid</td><td>LP0028</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 24 poços</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>5% de bicarbonato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 6 poços</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células de 96 poços</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>Células epiteliais de rim de macaco verde africano (Vero E6)</td> <td>ATCC</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr><tr><td>Ami HT</td><td>Spectral Instruments Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aura Software de imagem 3.2.0</td><td>Spectral Instruments Software</td><td>de análise de imagem</td>de imagem <td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA), 35%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>Armazenar em 4 &deg; </td></tr><tr><td>C Água de grau de cultura de células</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia modificada' s médio (DMEM)</td> <td>Corning Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td>Loja em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Máquina de gás de anestesia</td><td>Sistemas de anestesia veterinária, Inc.</td><td>VAS 2001R</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Soro Bovino (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-050</td><td>Armazenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Camundongos transgênicos K18-hACE2 fêmeas de quatro a seis semanas de idade</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism Versão 9.1.0</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td>Loja na RT</td></tr><tr><td>Software de Análise de Dados MARS</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MB10 tablets</td><td>QUIP Laboratories</td><td>MBTAB1.5</td><td>Loja na RT</td></tr><tr>Reagente <td>Promega</td><td>N1110</td> <td>do ensaio de Nano-Glo Luciferase</td><td>Este reagente é usado para medir a atividade de Nluc. Armazene a -20 > C</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell MicroWell 96-Well Microplates</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina/L-Glutamina (PSG) 100x</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>Armazene em -20 &deg; C</td></tr><tr><td>PHERAstar FSX</td><td>BMG LABTECH</td><td>PHERAstar FSX</td><td></td></tr><tr><td>Precelleys Evolution homogeneizador</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000062-PEVO0-A</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneização de tecidos moles CK14 - 7 mL</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000940-LYSK0-A</td><td></td></tr><tr><td>T75 EasYFlask</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase</td><td>Kit Vector Laboratories</td><td>PK-4002</td><td>ABC e kit de substrato de peroxidase DAB</td></tr></tbody></table>

imagem ao vivo e quantificação da infecção viral em k18 hace2 camundongos transgênicos usando o recombinante sars-cov-2

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

A pandemia da doença coronavírus 2019 (COVID-19) foi causada por síndrome respiratória aguda grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Até o momento, o SARS-CoV-2 foi responsável por mais de 242 milhões de infecções e mais de 4,9 milhões de mortes em todo o mundo. Semelhante a outros vírus, estudar o SARS-CoV-2 requer o uso de métodos experimentais para detectar a presença de vírus em células infectadas e/ou em modelos animais. Para superar essa limitação, geramos proteínas recombinantes competentes para replicação (r)SARS-CoV-2 que expressa proteínas bioluminescentes (nanoluciferase, Nluc) ou fluorescentes (Vênus). Estes rSARS-CoV-2 que expressam repórteres permitem rastrear infecções virais in vitro e in vivo com base na expressão dos genes de repórteres de Nluc e Vênus. Aqui, o estudo descreve o uso de rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus para detectar e rastrear a infecção pelo SARS-CoV-2 no modelo de infecção transgênica K18(IVIS) da enzima de conversão de angiotensina humana anteriormente descrita. Este rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus mostram rSARS-CoV-2/WT-like patogenicidade e replicação viral in vivo. É importante ressaltar que a expressão de Niuc e Vênus nos permite rastrear diretamente infecções virais in vivo e ex vivo, em camundongos infectados. Estes rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus representam uma excelente opção para estudar a biologia do SARS-CoV-2 in vivo, para entender a infecção viral e a doença COVID-19 associada, e identificar tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos eficazes para combater a infecção pelo SARS-CoV-2.

rSARS-CoV-2/Infecção por Niuc em camundongos transgênicos K18 hACE2 (Figuras 1 e 2) A Figura 1A mostra uma representação esquemática do rSARS-CoV-2/WT (superior) e rSARS-CoV-2/Nluc (inferior) utilizado para avaliar infecções in vivo. A Figura 1B mostra o fluxograma esquemático aplicado para avaliar a dinâmica da infecção rSARS-CoV-2/Nluc em camundongos transgênicos K18 hACE2. Camundongos...

Este protocolo descreve a dinâmica das infecções virais usando recombinação expressante (r)SARS-CoV-2 e um sistema de imagem in vivo (IVIS) em camundongos transgênicos K18 hACE2 para superar a necessidade de abordagens secundárias necessárias para estudar infecções sars-cov-2 in vivo.

Imagem ao vivo e quantificação da infecção viral em K18 hACE2 Camundongos transgênicos usando o recombinante SARS-CoV-2

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Nosso protocolo descreveu o uso de SARS-CoV-2 recombinante fluorescente ou luminescente para detecção viral in vivo e ex vivo e rastreamento viral no modelo de camundongo transgênico ACE2 humano K18 da infecção sars-CoV-2. A principal vantagem dessa técnica é a aplicação e viabilidade da detecção e rastreamento viral para estudos in vivo e ex vivo de SARS-CoV-2 no modelo de camundongo transgênico ACE2 humano K18. O uso da imagem in vivo do SARS-CoV-2 no modelo de camundongo transgênico humano ACE2 K18 representa uma excelente opção para avaliar a terapêutica para o tratamento da infecção por SARS-CoV-2 in vivo.A implementação dos repórteres SARS-CoV-2 representa uma excelente opção para avaliar patogenicidade, replicação viral e trofema in vivo. Para estudos in vivo com luciferase expressando SARS-CoV-2, raspar os camundongos e prontas imagens após a injeção de substrato é recomendado para melhorar o sinal de bioluminescência. Inicie o monitoramento da bioluminescência iniciando o sistema de imagem in vivo, ou IVIS, e configurando os parâmetros, clique no modo de imagem para Bioluminescência e abra o filtro e defina o tempo de exposição ao Auto.Em seguida, remova um rato já raspado e anestesiado da câmara de isolamento e use uma agulha de calibre 25 para administrar retro-orbitalmente 100 microliters do substrato de luciferase diluído de 1 a 10 em PBS para o mouse. Em seguida, coloque o mouse de volta para a câmara de isolamento, transfira a câmara de isolamento para a máquina IVIS, que é equipada com um componente de aquecimento para evitar hipotermia, e feche a porta do imager IVIS para inicializar a imagem selecionando a Acquire no programa de software. Para analisar as imagens adquiridas de bioluminescência, utilize o ROI ou a ferramenta região de interesse no software para designar o sinal preciso e medir o fluxo.Inicie o software de imagem e configure os parâmetros. Clique no modo de imagem para Fluorescência, defina excitação em 500 nanômetros e filtros de emissão em 530 nanômetros e ajuste o tempo de exposição a Auto. Realize necroscopia e excise pulmões de camundongos.Coloque os pulmões excisados em uma placa de 6 poços contendo dois mililitros de 1X PBS e enxágue para remover o excesso de sangue. Desinfeta e ferramentas de cirurgia limpa entre as amostras usando 70% de etanol. Depois de inicializar a máquina IVIS, coloque os pulmões em uma folha preta e separe os tecidos um do outro.Em seguida, coloque a bandeja dentro da câmara de isolamento dentro do armário de biossegurança e, em seguida, transfira a câmara de isolamento para o IVIS. Feche a porta do imager IVIS e clique em Adquirir para iniciar o sistema de imagem. Para analisar a fluorescência, utilize a ferramenta ROI e desenhe ROIs em torno de cada um dos pulmões individuais.Meça cada ROI manualmente e, em seguida, use os valores médios de eficiência radiante dados e subtraia dos ratos infectados por simulação. Uma vez que a imagem esteja completa, coloque os tecidos em um criobotube para congelamento de gelo seco para armazenar a menos 80 graus Celsius para processamento posterior. Utilizando o supernato obtido a partir dos homogeneizadores teciduais, realize diluição serial dez vezes maior e infecte monocamadas confluentes de células Vero E6 com um mililitro de cada diluição sobrenante em triplicados.Deixe o vírus adsorb por uma hora a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono. Uma vez feito, lave as células com um mililitro de 1X PBS e, em seguida, incubar as células em dois mililitros de mídia pós-infecção contendo 1% de ágar na incubadora de dióxido de carbono umidificada a 37 graus Celsius por 72 horas. Após a incubação, inative as placas em formalina tamponada 10% neutra por 24 horas a quatro graus Celsius, garantindo que toda a placa esteja submersa.Tire as placas do nível de biossegurança três e lave as células três vezes com um mililitro de 0,5% Triton X-100 por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, bloqueie as células permeabilizadas com um mililitro de 2,5 gêmontos bovinos albumina ou BSA e PBS por uma hora a 37 graus Celsius seguido de incubação em um mililitro de um micrograma por mililitro da proteína nucleocapsida SARS-CoV anticorpo monoclonal interativo 1C7C7 diluído em 2,5 BSA por uma hora a 37 graus Celsius. Lave as células três vezes com um mililitro de 1X PBS e desenvolva as placas usando o ABC e diaminobenzeno, ou DAB, kits de substrato peroxidase de acordo com as instruções do fabricante, em seguida, calcule os títulos virais como unidades formando placas por mililitro.No estudo, observou-se que a nanoluciferase bioluminescente, ou Niuc, foi facilmente detectada e os camundongos infectados com o niuc rSARS-CoV-2, mas não aqueles infectados com rSARS-CoV-2 selvagem ou infectados simulados. As análises quantitativas mostraram intensidade de Niuc em dias diferentes após a infecção. Lesões brutas na superfície pulmonar de camundongos infectados com rSARS-CoV-2 Niuc foram comparáveis às do grupo infectado do tipo selvagem rSARS-CoV-2.Além disso, os títulos virais detectados e os camundongos infectados por RSARS-CoV-2 Niuc foram comparáveis aos infectados com rSARS-CoV-2 em todos os órgãos em dias diferentes após a infecção. Ao mesmo tempo, a atividade de Nluc só foi detectada nos órgãos de camundongos infectados por RSARS-CoV-2 Niuc. Um grupo separado de camundongos infectados por simulados e infectados por vírus foi monitorado por 12 dias para mudanças no peso e na sobrevivência do corpo.Camundongos infectados com rSARS-CoV-2 Niuc e rSARS-CoV-2 tipo selvagem perderam até 25% de seu peso corporal e todos sucumbem à infecção viral entre sete a oito dias após a infecção. Após a infecção por Vênus rSARS-CoV-2, a expressão de Vênus foi prontamente detectada em todos os pulmões de camundongos infectados com rSARS-CoV-2 Vênus, mas não aqueles infectados com rSARS-CoV-2 selvagem ou simulado infectado. As análises quantitativas mostraram que a intensidade de Vênus atinge picos de dois dias após a infecção e diminui ao longo da infecção e dos pulmões de camundongos infectados.Imagens da superfície pulmonar revelaram lesões brutas de camundongos infectados com rSARS-CoV-2 Vênus era comparável à de camundongos infectados do tipo selvagem rSARS-CoV-2. Além disso, a infecção por rSARS-CoV-2 Vênus resultou em títulos virais comparáveis aos observados em camundongos infectados com rSARS-CoV-2 tipo selvagem em todos os órgãos. Os camundongos infectados com rSARS-CoV-2 Venus e rSARS-CoV-2 wild-type perderam até 25% de seu peso corporal e sucumbiram à infecção viral até o nono dia pós-infecção sem sobrevivência.Os resultados do repórter que expressa SARS-CoV-2 mostraram-se substitutos válidos da infecção viral. Assim, isso poderia levar à rápida identificação e avaliação de contramedidas para o tratamento da infecção pelo SARS-CoV-2.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um método de rastreio neurónios ligados sinapticamente é descrito. Usamos TVA especificidade de uma célula de montante para investigar se uma população de células de interesse recebe entrada sináptica de tipos de células geneticamente definidos.

Rastreamento de viral geneticamente definido Neural dos circuitos

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

Source: Morales Vasquez, D., et al. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the protocol for carrying out plaque assay–based viral titration for quantifying infectious virus levels in tissue sample collected from a virus–infected mouse model.

Plaque Assay–Based Quantification of Viral Load in an Infected Mouse Tissue Sample

Este vídeo demonstra um método para rastrear infecções virais em modelos de camundongos usando um vírus Influenza A bi-repórter recombinante com luciferase e proteína de fluorescência. Este método permite estudos in vivo e ex vivo, permitindo que os pesquisadores obtenham insights sobre a dinâmica viral e os efeitos das intervenções.

Um vírus da gripe repórter fluorescente luciferase para rastrear infecções virais

Este vídeo demonstra a aplicação da Reação em Cadeia de Hibridização (HCR)-Hibridização In Situ de Fluorescência (FISH) para visualizar a distribuição espacial do RNA subgenômico do SARS-CoV-2. A combinação de HCR com técnicas de imunofluorescência tem o potencial de fornecer informações sobre as interações hospedeiro-vírus no nível de célula única.

Usando hibridização in situ de fluorescência de imuno-RNA para visualizar o SARS-CoV-2

Descreve-se a utilização de um vírus vaccinia repórter fluorescente que permite a medição em tempo real da infectividade viral e a expressão do gene através da expressão específica da fase de fluoróforos espectralmente distintos repórter. Detalhamos um método baseado em placa para identificar com precisão a fase em que a replicação do vírus é afetada em resposta a pequena inibição molécula.

Repórter Vaccinia vírus para quantificar Função Viral em todas as fases da Expressão Gênica

Os vírus da influenza A (IAVs) são patógenos respiratórios contagiosos que causam epidemias anuais e pandemias ocasionais. Aqui, nós descrevemos um protocolo para rastrear infecções virais in vivo usando uma novela recombinante luciferase e fluorescência-expressando o bi-repórter IAV (BIRFLU). Esta abordagem fornece aos pesquisadores uma excelente ferramenta para estudar IAV in vivo.

Um luciferase-vírus da gripe do repórter fluorescente para A imagem latente viva e a quantificação da infecção viral

Aqui, descrevemos um método simples que combina fluorescência de RNA na hibridização situ (RNA-FISH) com imunofluorescência para visualizar síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) RNA. Este protocolo pode aumentar a compreensão das características moleculares das interações sars-cov-2 RNA-host em um nível de célula única.

Visualização de SARS-CoV-2 usando Imuno RNA-Fluorescence In Situ Hibridização

O protocolo descrito aqui descreve um método rápido e eficaz para medir anticorpos neutralizantes contra a proteína de pico SARS-CoV-2, avaliando a capacidade de amostras de soro convalescente para inibir a infecção por um vírus de estomatite vesicular rotulado por proteína verde aumentada com pseudotipto de glicoproteína.

Detecção de anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2 usando imagens fluorescentes de alto rendimento da infecção por pseudovírus

Neste protocolo, os pontos quânticos conjugados ao pico SARS-CoV-2 recombinante permitem que ensaios baseados em células monitorem a ligação de espigão para hACE2 na membrana plasmática e a endocitose subsequente das proteínas ligadas ao citoplasma.

Imagem confocal de alta taxa de imagem confocal de sars-cov-2 trimers de pico conjugados de alta throughput para rastrear a vinculação e a endocitose em células HEK293T

Aqui, detalhamos um protocolo otimizado para injeção de veia da cauda lateral de camundongo para administrar sistemicamente o vírus adeno-associado (AAV) em camundongos adultos. Além disso, descrevemos protocolos de ensaios comumente usados para avaliar a transdução de AAV.

Entrega consistente de vírus adeno-associado por injeção lateral na veia da cauda em camundongos adultos

Aprenda a realizar imagem ao vivo e quantificação da infecção viral em camundongos transgênicos K18 hACE2 usando SARS-CoV-2 recombinante. Este método permite avaliar terapêuticas contra a COVID-19.

Imagem ao vivo e quantificação da infecção viral em K18 hACE2 Camundongos transgênicos usando o recombinante SARS-CoV-2

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