Name: Preparação de Bicamadas lipídicas apoiadas por contas para estudar a saída de partículas de sinapses imunes de células T (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Aprenda a preparar bicamadas lipídicas apoiadas por contas para estudar a saída de partículas de sinapses imunes de células T. Este método utiliza citometria de fluxo multicolorida para análise precisa.

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Somos gratos aos nossos membros do laboratório e à comunidade do Instituto Kennedy de Reumatologia por discussões científicas construtivas, especialmente ao nosso gerente de instalações de citometria de fluxo, Jonathan Webber. Este trabalho foi financiado pela Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, o ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) e o Kennedy Trust for Reumatology Research (KTRR) (todos os três para MLD). O PFCD foi apoiado pela EMBO Long-Term Fellowship (ALTF 1420-2015, em conjunto com a Comissão Europeia (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) e Marie Sklodowska-Curie Actions) e uma Oxford-Bristol Myers Squibb Fellowship.

<ol><li>Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+membrane+systems+to+reconstitute+immune+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling.</a> FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).</li>
<li>Choudhuri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+release+of+T-cell-receptor-enriched+microvesicles+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse.</a> Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).</li>
<li>Saliba, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+structure+of+synaptic+ectosomes+exporting+antigen+receptor+linked+to+functional+CD40+ligand+from+helper+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells.</a> elife. 8, 47528(2019).</li>
<li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+polarization+of+IFN-gamma+at+Kupfer+and+non-Kupfer+immunological+synapses+during+the+clearance+of+virally+infected+brain+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells.</a> Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).</li>
<li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).</li>
<li>Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+expression+of+cytokines+in+cell+conjugates+of+helper+T+cells+and+splenic+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).</li>
<li>Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+splenic+B+cells+that+bind+to+antigen-specific+T+helper+%28Th%29+cells+and+face+the+site+of+cytokine+production+in+the+Th+cells+selectively+proliferate%3A+immunofluorescence+microscopic+studies+of+Th-B+antigen-presenting+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions.</a> Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).</li>
<li>Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+in+vivo+identification+of+TCR+redistribution+and+polarized+IL-2+production+by+naive+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells.</a> Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).</li>
<li>Gerard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+T+cell-T+cell+synaptic+interactions+drive+the+differentiation+of+protective+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).</li>
<li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 18 Unit 18.13 (2007).</li>
<li>Abcam. Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2021).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+compensation+for+flow+cytometry%3A+visualization+artifacts%2C+limitations%2C+and+caveats%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li>
<li>Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+T+cells+is+induced+by+binding+to+nickel-chelating+lipids+in+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers.</a> Frontiers in Physiology. 11, 613367(2020).</li>
<li>Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+spillover+spreading+for+comparing+instrument+performance+and+aiding+in+multicolor+panel+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design.</a> Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).</li>
<li>Céspedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+antigen-presenting+cells+reveal+the+diversity+and+functional+specialisation+of+extracellular+vesicles+composing+the+fourth+signal+of+T+cell+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Yoon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+non-activated+lymphocytes+using+three-dimensional+refractive+index+tomography+and+machine+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6654(2017).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributions+of+autofluorescence+after+compensation%3A+Be+panglossian%2C+fret+not%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not.</a> Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).</li>
<li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+controls%2C+instrument+setup%2C+and+the+determination+of+positivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li>
<li>Balint, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+attack+particles+are+autonomous+killing+entities+released+from+cytotoxic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells.</a> Science. 368 (6493), 897-901 (2020).</li>
<li>Cespedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+expression+of+the+hRSV+nucleoprotein+impairs+immunological+synapse+formation+with+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm conflito de interesses para declarar.

Os BSLBs são ferramentas versáteis para estudar a saída de partículas de células T estimuladas com membranas modelo APC. A flexibilidade do método permite a reconstituição de composições complexas e reducionistas da membrana para estudar os efeitos dos ligantes e seus sinais sobre a secreção de tSVs e partículas de ataque supramolecular e seus componentes. Testamos esta tecnologia em várias células T, incluindo TH pré-ativado, CTL, Tregs e CART15. Este protocolo também funciona para a medição da l...

A sinapse imunológica (IS) é uma estrutura molecular fundamental formada na interface de células envolvidas em contato físico que facilita a troca regulada de informações juxtracrinas. Diferentes ISs foram descritos na literatura, e um conjunto crescente de evidências sugere que esses hubs moleculares são uma característica conservada das redes celulares. Várias células imunes, incluindo células B, células assassinas naturais, células dendríticas, macrófagos e células T, trocam informações através da montagem de contatos de curta duração1. Estudos multiómicos estão avançando na compreensão de novos subconjuntos de leucócitos e células estromais que conduzem redes celulares patogênicas e expressam proteínas superficiais com funções desconhecidas. Como APCs sintéticos, os BSLBs permitem a investigação direta do papel funcional das proteínas individuais na integração de sinais de ativação, ou seja, antígenos e costimulação/corepressão, por células T e a consequente liberação de partículas de efeitos referidas como sinal quatro.
Este artigo descreve os protocolos e pontos técnicos críticos a serem considerados ao usar BSLBs para imitar a composição superficial dos APCs do modelo. Os protocolos para a medição quantitativa de receptores imunológicos e outras proteínas superficiais em APCs são apresentados juntamente com o protocolo para a reconstituição de APCs sintéticos contendo essas quantidades medidas. Em seguida, as etapas necessárias para coculturar células T e BSLB são apresentadas juntamente com o protocolo para a medição quantitativa da transferência de partículas trans-sinápticas usando citometria de fluxo. Mais notavelmente, os BSLBs facilitam o estudo de uma população derivada de membrana plasmática de tSVs denominadas ectomosse sináptico (ECtos). As SEs enriquecidas com receptor de antígeno de células T (TCR+) são lançadas em resposta ao Acionamento TCR2 e capturadas eficientemente por BSLBs3, representando uma excelente leitura para avaliar as propriedades agonizantes dos antígenos e a composição da membrana modelada. Exosomos CD63+ e partículas de ataque supramolecular (SMAPs) também são liberados por células T estimuladas e capturados por BSLBs. Eles podem ser usados como leituras adicionais da ativação e a secreção de grânulo exolítico e lítico resultante por células T. A mobilização de vesículas exocióticas ao polo interagente da célula T também facilita a liberação direcional de citocinas, como IL-2, IFN-γ e IL-10 em resposta à ativação4,5,6,7,8. Embora citocinas liberadas por células T também possam ser detectadas em BSLBs, um estudo mais dedicado está atualmente em desenvolvimento para validar a análise quantitativa da liberação de citocinas na sinapse imunológica.
Para questionar como as composições de membranas específicas influenciam a saída sináptica das células T requer a definição da densidade fisiológica do componente da membrana alvo. Quantificações baseadas em citometria de fluxo de proteínas superficiais celulares são um passo essencial neste protocolo e exigem: 1) o uso de anticorpos com números conhecidos de fluorochromes por anticorpo (F/P), e 2) contas de referência fornecendo uma referência padrão para interpolar moléculas fluorocromáticas a partir de intensidades de fluorescência média medida (MFIs).
Esses padrões de referência consistem em cinco populações de contas, cada uma contendo um número crescente de fluorocromes solúveis equivalentes (MESFs), que abrangem a faixa dinâmica de detecção arbitrária de fluorescência. Essas populações padrão produzem picos de fluorescência discreta, facilitando a conversão de unidades de fluorescência arbitrária em MESFs por simples regressão linear. Os MESFs resultantes são então usados juntamente com valores de anticorpos F/P para calcular o número médio de moléculas ligadas por célula (ou BSLB em etapas posteriores). A aplicação de áreas estimadas da superfície celular ao número médio de moléculas detectadas permite então o cálculo de densidades fisiológicas como moléculas/μm2. Este protocolo de quantificação também pode ser adaptado à medição de densidades proteicas em células T e à reconstituição bioquímica de composições de membrana mediando a formação de sinapses celulares T homotípicas (ou seja, sinapses T-T). Se necessário, a valência da ligação de anticorpos pode ser estimada usando alvos recombinantes rotulados com números conhecidos de fluorochromes por molécula. Em seguida, a valência de ligação de anticorpos pode ser calculada para a mesma população BSLB, comparando simultaneamente o número de proteínas fluorescentes ligadas e anticorpos de quantificação (usando dois fluorochromes de quantificação diferentes e padrões MESF).
A reconstituição das membranas APC requer a montagem de bicamadas lipídicas suportadas (SLBs) em contas de sílica1. Os estoques lipossomos contendo diferentes espécies fosfolipídicas podem ser aproveitados para formar uma versátil matriz lipídica-bicamada, permitindo a ancoragem de proteínas recombinantes com diferentes químicas de ligação (a preparação de lipossomos é detalhada em 10). Uma vez definida a densidade fisiológica (ou densidades) do ligante relevante "sobre células", o mesmo protocolo de citometria de fluxo é adaptado para estimar a concentração de proteína recombinante necessária para cobrir BSLBs com a densidade fisiológica alvo. Dois sistemas de ancoragem diferentes podem ser usados em combinação ou separadamente.
Primeiro, o SLB contendo 12,5% finais de fosfolipídios contendo Ni2+, é suficiente para fornecer aproximadamente 10.000 locais de ligação de sua etiqueta por micron10 quadrado e funciona bem para decorar BSLBs com a maioria das proteínas disponíveis comercialmente cujas densidades fisiológicas não excedem essa capacidade máxima de carregamento. O segundo sistema de carregamento aproveita fosfolipídios contendo biotina (como mol) para carregar os monomers anti-CD3e fab biotinilados (ou monômeros HLA/MHC) através de pontes streptavidinas. A combinação desses dois métodos de decoração BSLB permite, então, a alfaiataria flexível de BSLBs como APCs sintéticos. Para composições superficiais APC altamente complexas, o mol% de fosfolipídios e proteínas pode ser aumentado para carregar quantas proteínas a questão em questão exige. Uma vez definidas as concentrações de trabalho de proteínas e mol% de fosfolipídios biotinilados, os BSLBs podem ser montados para interrogar a saída sináptica de células T com citometria de fluxo multiparamétrico.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[(N-(5-amino-1-carboxipentil)ácido iminodiacético)succinil] (sal de níquel)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404C-25mg</td><td>18:1 DGS-NTA(Ni) em clorofórmio</td></tr><tr><td> PIPETMAN L Multicanal P8x200L, 20-200 &micro; L</td><td>Gilson</td><td>FA10011</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Lipídios Polares</td><td>850375C-25mg</td><td>&nbsp; 18:1 (&Delta; 9-Cis) PC (DOPC) em clorofórmio</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) ATTO 390</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 390-165</td><td>DOPE ATTO 390</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) ATTO 488</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 488-165</td><td>DOPE ATTO 488</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) ATTO 565</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 565-165</td><td>DOPE ATTO 565</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotinyl) (sal de sódio)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870273C-25mg</td><td>18:1 Biotinyl Cap PE em clorofórmio</td></tr><tr><td>200 &micro; L pontas amarelas 10 x 96 Pontas, Empilhamento</td><td>Starlab</td><td>S1111-0206</td><td></td></tr><tr><td>5 mL tubos de poliestireno de fundo redondo</td><td>Falcon&reg;</td><td></td><td></td>352052</tr><tr><td>5.00 &plusmn; 0.05 &micro; m grânulos de sílica não funcionalizados</td><td>Bangs Laboratories Inc.</td><td></td><td></td>SS05003</tr><tr><td>Placa de Cultura de Células de 96 Poços com Fundo em U com Tampa, Tratamento de cultura de tecidos, não pirogênico.</td><td>Costar&reg;</td><td>3799</td><td>Para coloração FCM e co-cultura de BSLB e células.</td></tr><tr><td>Placa de cultura celular de 96 poços com fundo em V com tampa, tratamento de cultura de tecidos, não pirogênico.</td><td>Costar&reg;</td><td>3894</td><td>Para coloração FCM de células ou grânulos em suspensão.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 NHS Ester (Éster Succinimidílico)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen&trade;</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidílico)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen&trade;</td><td>A37573 e A20006</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Para coloração normal em tubo de amostras biológicas para</td></tr><tr><td>FCM Folha de alumínio</td><td>Qualquer marca</td><td></td><td>Para proteger células e BSLBs da luz</td></tr><tr><td>anti-humana CD154 (CD40L), clone 24-31</td><td>BioLegend</td><td>310815 e 310818</td><td>conjugados Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 647, respectivamente.</td></tr><tr><td>CD185 anti-humano (CXCR5) Violeta Brilhante 711, clone J252D4</td><td>BioLegend</td><td>356934</td><td>Para análise quantitativa de FCM de células tonsilares, conforme mostrado na Fig. 1E</td></tr><tr><td>anti-CD19 humano Violeta Brilhante 421, clone HIB19</td><td>BioLegend</td><td>302234</td><td>Para análise quantitativa de FCM de células tonsilares, conforme mostrado na Fig. 1E</td></tr><tr><td>anti-CD2 humano, clone RPA-2.10</td><td>BioLegend</td><td>300202</td><td>Rotulado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td></tr> <tr><td>anti-human CD2, clone TS1/8</td><td>BioLegend</td><td>309218</td><td>conjugado Brilliant Violet 421.</td></tr><tr><td>CD252 anti-humano (OX40L), clone 11C3.1</td><td>BioLegend</td><td></td><td>Alexa Fluor 647 conjugado</td></tr><tr><td>anti-CD28 humano, clone CD28.2</td><td>eBioscience</td><td>16-0289-85</td><td>Rotulado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidil)</td></tr> <tr><td>anti-CD317 humano (BST2, PDCA-1), clone 26F8</td><td>ThermoFisher Scientific, invitrogen</td><td>53-3179-42</td><td>Alexa Fluor 488 conjugado, descobrimos que este clone é mais limpo que o clone RS38E.</td></tr><tr><td>CD38 anti-humano, clone HB-7</td><td>BioLegend</td><td>356624</td><td>conjugado Alexa Fluor 700</td></tr><tr><td>CD38 anti-humano, clone HIT2</td><td>BioLegend</td><td>303514</td><td>conjugado Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>CD39 anti-humano, clone A1</td><td>BioLegend</td><td></td><td>Marcado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidílico)</td></tr><tr><td>anti-humano CD4 Bright Violet 650, clone OKT4</td><td>BioLegend</td><td>317436</td><td>Para análise quantitativa de FCM de células tonsilares, conforme mostrado na Fig. 1E</td></tr><tr><td>CD4 anti-humano, clone A161A1</td><td>BioLegend</td><td>357414 e conjugados 357421</td><td>PerCP / Cyanine5.5 e Alexa Fluor 647, respectivamente</td></tr><tr><td>CD4 anti-humano, clone OKT4</td><td>BioLegend</td><td>317414 e conjugados 317422</td><td>PE / Cy7 e Alexa Fluor 647, respectivamente</td></tr><tr><td>CD40 anti-humano, clone 5C3</td><td>BioLegend</td><td>334304</td><td>Marcado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidil Ester)</td></tr> <tr><td>anti-humano CD40, clone G28.5</td><td>BioLegend</td><td></td><td>Marcado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td></tr> <tr><td>anti-humano CD45, clone HI30</td><td>BioLegend</td><td>304056 e 368516</td><td>Alexa Fluor 647 e APC/Cy7 conjugados</td></tr><tr><td>anti-humano CD47, clone CC2C6</td><td>BioLegend</td><td>323118</td><td>Alexa Fluor 647 conjugado</td></tr><tr><td>CD54 anti-humano (ICAM-1), clone HCD54</td><td>BioLegend</td><td>322702</td><td>Marcado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidílico)</td></tr> <tr><td>anti-CD63 humano (LAMP-3), clone H5C6</td><td>BioLegend</td><td>353020 e 353015</td><td>conjugados PerCP/Cyanine5.5 e Alexa Fluor 647, respectivamente</td></tr><tr><td>anti-CD73 humano, clone AD2</td><td>BioLegend</td><td>344002</td><td>Marcado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidílico)</td></tr><tr><td>CD80 anti-humano, clone 2D10</td><td>BioLegend</td><td>305216</td><td>conjugado Alexa Fluor 647 conjugado</td></tr><tr><td>CD81 anti-humano, clone 5A6</td><td>BioLegend</td><td>349512 e conjugado 349502</td><td>PE/Cy7 e rotulado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidílico), respectivamente.</td></tr><tr><td>CD82 anti-humano, clone ASL-24</td><td>BioLegend</td><td>342108</td><td>conjugado Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>CD86 anti-humano, clone IT2.2</td><td>BioLegend</td><td>305416</td><td>conjugado Alexa Fluor 647</td></tr><tr><td>CD8a anti-humano, clone HIT8a</td><td>BioLegend</td><td>300920</td><td>Alexa Fluor 700 conjugado</td></tr><tr><td>anti-humano CD8a, clone SK1</td><td>BioLegend</td><td>344724</td><td>Alexa Fluor 700 conjugado</td></tr><tr><td>anti-humano HLA-A/ B/C/E, clone w6/32</td><td>BioLegend</td><td>311414 e conjugado 311402</td><td>Alexa Fluor 647 e marcado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td></tr> <tr><td>anti-humano HLA-DR, clone L243</td><td>BioLegend</td><td>307656 e conjugados 307622</td><td>Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 647, respectivamente.</td></tr><tr><td>anti-humano ICAM-1, clone HCD54</td><td>BioLegend</td><td>322702</td><td>Rotulado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidil)</td></tr> <tr><td>anti-humano ICOS, clone C398.4A</td><td>BioLegend</td><td>313516</td><td>Hamster armênio IgG</td></tr><tr><td>anti-humano ICOSL, clone MIH12</td><td>BioLegend</td><td>329611</td><td>Alexa Fluor 647 conjugado</td></tr><tr><td>anti-humano ICOSL, clone MIH12</td><td>eBioscience</td><td>16-5889-82</td><td>Rotulado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidil Éster)</td></tr> <tr><td>anti-humano LFA-1, clone TS1/22</td><td>BioLegend</td><td>Produzido internamente</td><td>Rotulado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidil Éster)</td></tr> <tr><td>anti-humano OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35)</td><td>BioLegend</td><td>350018</td><td>Alexa Fluor 647 conjugado</td></tr><tr><td>anti-humano PD-1, clone EH12.2H7</td><td>BioLegend</td><td>135230 e 329902</td><td>Alexa Fluor 647 conjugado e marcado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidil Éster)</td></tr> <tr><td>anti-humano PD-L1, clone 29E.2A3</td><td>BioLegend</td><td>329702</td><td>Marcado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidil Éster)</td></tr> <tr><td>anti-humano PD-L2, clone 24F.10C12</td><td>BioLegend</td><td>329611</td><td>Alexa Fluor 647 conjugado</td></tr><tr><td>anti-humano PD-L2, clone MIH18</td><td>BioLegend</td><td>345502</td><td>Rotulado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td></tr> <tr><td>anti-humano TCRab, clone IP26</td><td>BioLegend</td><td>306712 e 306714</td><td>conjugados Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 647, respectivamente.</td></tr><tr><td>CD156c anti-humano (ADAM10), clone SHM14</td><td>BioLegend</td><td>352702</td><td></td></tr><tr><td>CD317 anti-humano (BST2, Tetherin), clone RS38E</td><td>BioLegend</td><td>348404</td><td>Alexa Fluor 647 conjugado</td></tr><tr><td>hamster armênio IgG Alexa Fluor 647 Controle de isotipo, clone HTK888</td><td>BioLegend</td><td>400902</td><td>Rotulado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidil)</td></tr> <tr><td>BD Cytometer Setup and Tracking beads</td><td>Becton Dickinson & Empresa (BD)</td><td>641319</td><td>Trilha de desempenho de instrumentos antes quantitativo FCM</td></tr><tr><td>BD FACSDiva</td><td>Becton Dickinson & Empresa (BD)</td><td>23-14523-00</td><td>Software de aquisição</td></tr><tr><td>Albumina de Sémen Bovino</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2, Cloreto de cálcio</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>anidro, BioReagent, adequado para cultura de células de insetos, adequado para cultura de células vegetais, &ge; 96,0%</td></tr><tr><td>Caseína de leite bovino, adequado para substrato para proteína quinase (após desfosforilação), pó purificado</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>C5890</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>11132D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>ThermoFisher Scientific, Invitrogen&trade;</td><td>12321D</td><td>Para a remoção do Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 em volumes inferiores a 2 mL</td></tr><tr><td>DynaMag&trade;-15</td><td>ThermoFisher Scientific, Invitrogen&trade;</td><td>12301D</td><td>Para a remoção de Dynabeads&trade; Ativador T humano CD3/CD28 em volumes inferiores a 15 mL</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal qualificado, dose única</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>A3160801</td><td>Precisa de inativação de calor por 30 min a 56 oC</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Cytiva, GE Healthcare</td><td>GE17-1440-02</td><td>Solução estéril de polissacarídeo e diatrizoato de sódio para isolamento de linfócitos</td></tr><tr><td>Corante de viabilidade fixável eFluor 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-14</td><td>Para a exclusão de células mortas durante as análises</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Becton Dickinson & Empresa (BD)</td><td>Versão 10.7.1</td><td>Software de análise</td></tr><tr><td>Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker</td><td>Keison Products</td><td>MPS-1</td><td>Para a mistura de células durante as colorações ou BSLBs durante o carregamento de proteínas (como alternativa à agitação orbital)</td></tr><tr><td>Solução tampão HEPES (1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, N-(2-hidroxietil)piperazina-N&prime;-(ácido 2-etanossulfónico), ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanossulfónico</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>Para preparação de tampão HBS/HAS ou HBS/BSA. Certificado BioPerformance, &ge; 99,5% (titulação), adequado para cultura de células</td></tr><tr><td>HERACell 150i CO2 incubadora, 150 L, Aço Inoxidável Electropolido</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51026282</td><td>Para cultura e expansão de células T CD4+ e CD8+ purificadas.</td></tr><tr><td>Misturador de Hula&reg; Misturador de amostras</td><td>ThermoFisher Scientific, Life Technologies</td><td>15920D</td><td>Misturador de laboratório vertical de ângulo variável usado para a mistura de BSLBs e mistura principal de lipídios, soluções de bloqueio, mistura mestre de proteínas e colorações de anticorpos em pequena escala.</td></tr><tr><td>Albumina sérica humana, solução aquosa a 30%</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>12667-M</td><td></td></tr><tr><td>Solução de bloqueio do receptor humano TruStain FcX Fc</td><td></td><td>Solução de bloqueio do receptor BioLegend 422302 Fc para bloqueio de receptores Fc de amostras biologicamente relevantes</td><td></td></tr><tr><td>Contador e analisador de células Innovatis CASY TT</td><td>Biovendis Products GmbH</td><td></td><td>Para a contagem de células e a determinação do tamanho e volume da célula com base na exclusão da corrente elétrica.</td></tr><tr><td>KCl, cloreto de potássio</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>Powder, BioReagent, adequado para cultura de células</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2, cloreto de magessium</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td>BioReagent, adequado para cultura de células, adequado para cultura de células de insetos</td></tr><tr><td>Inserção de microtubo para 24 x 1,5/2,0 mL tubos</td><td>Keison Products</td><td>P-2-24</td><td>Microtube insert para Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker</td></tr><tr><td>Mini Incubator</td><td>Labnet International&nbsp;</td><td>I5110A-230V</td><td>Para a incubação (co-cultura) de BSLB e células na ausência de CO2</td></tr><tr><td>Meio essencial mínimo Aminoácidos não essenciais</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Controle de anticorpos policlonais IgG de camundongo</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>PP54</td><td>Usado como controle positivo para a medição de anticorpos ligados aos padrões</td></tr> <tr><td>de esferas de captura de IgG de camundongoCamundongo IgG1, k Isotipo, clone MOPC-21</td><td>BioLegend</td><td>400129, 400112, 400130, 400144, 400128 e 400170</td><td>Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 e Bright Violet 785&nbsp; conjugados, respectivamente.</td></tr><tr><td>Rato IgG1, k Isotipo, clone X40</td><td>Becton Dickinson & Empresa (BD), Horizon</td><td>562438</td><td>Violeta Brilhante 421 conjugado.</td></tr><tr><td>IgG1 de camundongo, &kappa; Controle de isotipo, clone P3.6.2.8.1</td><td>eBioscience</td><td>14-4714-82</td><td>Marcado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidílico)</td></tr> <tr><td>Camundongo IgG2a, k Isotipo, clone MOPC-173</td><td>BioLegend</td><td>400240</td><td>Alexa Fluor 647 conjugado</td></tr><tr><td>Camundongo IgG2b, k Isotipo, clone MPC-11</td><td>BioLegend</td><td>400330 e 400355</td><td>conjugados Alexa Fluor 647 e Violeta Brilhante 785, respectivamente</td></tr><tr><td>Cultura de tecidos multipoços de 6 poços tratada com plasma gasoso</td><td>a vácuo Falcon</td><td>353046</td><td>Para cultura e expansão de células T CD4+ e CD8+</td></tr>.<tr><td>Na2HPO4, Fosfato Dissódico</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, Cloreto de sódio</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>BioReagent, adequado para cultura de células, adequado para cultura de células de insetos, adequado para cultura de células vegetais, etc; 99%</td></tr> <tr><td>NiSO4, sulfato de níquel (II)</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>656895</td><td>Para saturar locais NTA; adicionado durante o processo de bloqueio</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina [+]10.000 unidades Penicilina; [+] 10.000 &micro; g/mL de Estreptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tamponamento com Fosfato Salino pH 7.4, estéril</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>10010</td><td>Sem Ca2+ ou Mg2+ unidade de</td></tr><tr><td>filtro de polietersulfona (PES)</td> adicionada <td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>&nbsp; UY-06730-43</td><td>Membrana PES hidrofílica com baixa ligação a proteínas facilita a filtragem de soluções com alto teor de proteína</td></tr><tr><td>PURESHIELD argônio ISO 14175-I1-Ar</td><td>BOC Ltd.</td><td>11-Y</td><td>Para a proteção dos estoques de lipídios armazenados a +4 °C.</td></tr><tr><td>Estreptavidina Purificada</td><td>BioLegend</td><td>280302</td><td></td></tr><tr><td>Quantum Alexa Fluor 488 Contas MESF</td><td>Bangs Laboratories Inc.</td><td>488</td><td>grânulos de referência para a interpolação de moléculas Alexa Fluor 488 ligadas a células e/ou</td></tr><tr><td>grânulos BSLB Quantum Alexa Fluor 647 MESF</td><td>Bangs Laboratories Inc.</td><td>647</td><td>Grânulos de referência para a interpolação de moléculas Alexa Fluor 647 ligadas a células e/ou BSLB</td></tr><tr><td>Cadeia leve IgG Kappa anti-rato de rato, clone OX-20</td><td>ThermoFisher Scientific, invitrogen</td><td>SA1-25258</td><td>Marcado internamente com Alexa Fluor 647 NHS Ester (Éster Succinimidílico)</td></tr><tr><td>Humano recombinante IL-2</td><td>Peprotech</td><td>200-02-1MG</td><td></td></tr><tr><td>RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamina</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de Enriquecimento de Células B Humanas Rosette</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>15064</td><td>Isolamento de células B para medir densidades de proteínas em populações de células purificadas</td></tr><tr><td>Coquetel de Enriquecimento de Células T CD4+ Humanas</td><td>Rosette STEMCELL Technologies</td><td>15022C.1</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de Enriquecimento de Células T CD4+CD127low Rosette</td><td>STEMCELL Tecnologias</td><td>15361</td><td>Pré-enriquecimento de células T CD4+ CD127Low para o isolamento a jusante de Tregs por FACS.</td></tr><tr><td>Coquetel de Enriquecimento de Células T CD8+ Humanas Rosette</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>15063</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1x); [-] Vermelho de fenol</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>11835-063</td><td>Para a incubação (co-cultura) de BSLB e células na ausência de CO2. O meio sem vermelho de fenol reduz a autofluorescência das células em medições baseadas em citometria de fluxo e microscopia.</td></tr><tr><td>Piruvato de Sódio (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Sprout mini centrífuga</td><td>FisherScientific, Heathrow Scientific LLC</td><td>120301</td><td>Microcentrífuga de bancada usada para lavar esferas de sílica e BSLB em tubos Eppendorf de 1,5 mL.</td></tr><tr><td>Tubos de fundo redondo de poliestireno estéril cappeed 5 mL Falcon</td><td></td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads Contas de compensação</td><td>ThermoFisher Scientific, invitrogen</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>Colunas de Dessalinização Zeba Spin 7K MWCO</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen&trade;</td><td>Rolamento 89882</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de bicamadas lipídicas apoiadas por contas para estudar a saída de partículas de sinapses imunes de células t

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

As células que apresentam antígenos (APCs) apresentam três sinais de ativação para células T envolvidas no contato físico: 1) antígeno, 2) costimulação/corepressão e 3) citocinas solúveis. As células T liberam dois tipos de partículas efeitos em resposta à ativação: vesículas transsintálicas (tSVs) e partículas de ataque supramolecular, que transferem mensageiros intercelulares e mediam a citotoxicidade, respectivamente. Essas entidades são rapidamente internalizadas por APCs engajados no contato físico com células T, tornando sua caracterização assustadora. Este artigo apresenta o protocolo para fabricar e usar bicamadas lipídicas apoiadas por contas (BSLBs) como miméticas de células que apresentam antígenos (APC) para capturar e analisar essas partículas trans-sinápticas. Também são descritos os protocolos para as medições absolutas de densidades proteicas nas superfícies celulares, a reconstituição de BSLBs com tais níveis fisiológicos e o procedimento de citometria de fluxo para rastreamento da liberação de partículas sinápticas por células T. Este protocolo pode ser adaptado para estudar os efeitos de proteínas individuais, misturas complexas de ligantes, determinantes de virulência de patógenos e drogas na saída de células T, incluindo células T auxiliares, linfócitos T citotóxicos, células T regulatórias e células T que expressam receptor de antígeno quimérico (CART).

FCM para quantificação absoluta de proteína na superfície celular A reconstituição de BSLBs apresentando densidades fisiológicas de ligantes requer a estimativa de densidades proteicas totais no subconjunto celular modelado. Para reconstituir os BSLBs, inclua qualquer ligante relevante esperado para desempenhar um papel no eixo de sinalização de interesse ao lado de proteínas que suportem a adesão e interação funcional entre bslb e células, como ICAM-1 e moléculas costimulatórias, por exemplo, recepto...

Aqui apresentamos o protocolo para a reconstituição stepwise de células que apresentam antígenos sintéticos usando Bicamadas lipídicas apoiadas por contas e seu uso para interrogar a saída sináptica de células T ativadas.

Preparação de Bicamadas lipídicas apoiadas por contas para estudar a saída de partículas de sinapses imunes de células T

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

O estudo da saída da sinapse imunológica tem sido restrito principalmente a métodos microscópicos. Os BSLBs expandiram nosso repertório de ferramentas que podem ser usadas para estudar a saída de sinapses imunes de células T, incluindo citometria de fluxo, microscopia, proteômica e tecnologias de sequenciamento de RNA. Como tal, os BSLBs podem ser utilizados em uma ampla variedade de questões de imunologia e na identificação da composição e regulação bioquímica da produção celular T.Isso inclui, por exemplo, o estudo de receptores de antígeno quimérico, drogas que inibem vias específicas de sinalização, ou a ablação genética de genes de interesse. Um dos aspectos mais críticos deste protocolo é otimizar as calibrações proteicas e o painel de citometria de fluxo multicolor necessário para o rastreamento da partícula trans-sináptica de interesse. Isso requer a iteração sistemática de concentrações proteicas, concentrações de anticorpos e configurações de instrumentos.Comece diluindo um microliter de solução de contas com 1.000 microliters de PBS. Conte as contas usando uma câmara hemócica e calcule sua concentração por mililitro. Em seguida, calcule o volume de contas de sílica necessárias para 500.000 BSLBs finais por ponto de titulação.Transfira o volume necessário de contas de sílica para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro estéril. Lave as contas de sílica três vezes com um mililitro de PBS estéril e centrifugar as contas. Prepare três volumes de mistura mestre lipossosome contendo um percentual final de 12,5 mols de fosfolipídios contendo níquel.Use a mistura de mestre lipososome para resuspensar as contas de sílica lavadas. Em seguida, misture-o suavemente por pipetting para cima e para baixo metade do volume total. Usando uma técnica estéril, adicione argônio ou gás nitrogênio ao tubo para deslocar o ar e proteger os lipídios da oxidação durante a mistura.Adicione argônio aos estoques lipíduos de 0,4 milimilito. Armazene o estoque e manipule usando uma técnica estéril. Mova os BSLBs para a batedeira vertical e misture por 30 minutos à temperatura ambiente usando mistura orbital a 10 RPM.Em seguida, gire as contas por centrifugação por 15 segundos à temperatura ambiente em uma minicentrifuagem de bancada. Bloqueie os BSLBs formados adicionando um mililitro de 5%BSA contendo 100 micromolar de sulfato de níquel para saturar os locais NTA nos BSLBs. Lave três vezes usando o buffer HBS-HSA para remover a solução de bloqueio em excesso.Pegue uma nova placa U-bottom ou V-bottom 96-well e prepare diluições seriais duas vezes das proteínas. Resuspenja os BSLBs preparados em um volume de tal forma que 100 microliters de tampão HBS-HSA contenham 500.000 BSLBs. Em seguida, pegue outra placa de 96 poços de fundo U ou V e transfira 100 microliters da suspensão BSLB para os poços de tal forma que cada poço receba 500.000 BSBLs.Gire a segunda placa à temperatura ambiente por dois minutos a 300x G.Descarte o supernadante e transfira volumes de 100 microliter da placa de titulação proteica para a placa que contém os BSLBs sedimentados. Misture suavemente, evitando o excesso de geração de bolhas durante a pipetação. Use papel alumínio para protegê-lo da luz e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos a 1.000 RPM.Em seguida, lave a placa três vezes adicionando tampão HBS-HSA à placa e gire-a à temperatura ambiente por dois minutos a 300x G.Conte as células após a lavagem. Em seguida, dilui-os a uma concentração final de 2,5 milhões por mililitro usando o meio de ensaio de transferência sináptica. Uma vez que os BSLBs são carregados com a mistura de proteína, lave os BSLBs duas vezes com tampão HBS-HSA para remover o excesso de proteínas não ligadas.Resuspend 500.000 BSLBs por poço em 200 microliters de tampão HBS-HSA. Transfira 100 microliters de BSLBs por poço para uma nova placa U-bottom de 96 poços para fazer uma duplicata, de tal forma que a quantidade final de BSLB por poço seja de 250.000. Gire os BSLBs a 300x G por dois minutos em temperatura ambiente.Descarte o supernatante e, em seguida, resuspenque os BSLBs usando 100 microliters de suspensão celular T. Misture suavemente para evitar a formação de bolhas. Incubar as coculturas por 90 minutos a 37 graus Celsius.Proteja as células da luz e esfrie as co-culturas, primeiro incubando-as à temperatura ambiente por um mínimo de 15 minutos. Centrifugar as co-culturas à temperatura ambiente por cinco minutos a 500x G.Descarte o sobrenasciente e resuspenque as co-culturas em cálcio e magnésio livre de íons 2%BSA PBS à temperatura ambiente para bloqueio. Coloque as células no gelo por 45 minutos e proteja-as da luz.Prepare a mistura mestre de anticorpos usando 0,22 micrômetros filtrados 2% BSA e PBS como tampão de coloração. Esta mistura mestre fornecerá um bloqueio extra. Gire as co-culturas a 500x G por cinco minutos e quatro graus Celsius.Descarte os supernantes e use uma pipeta multicanal para resuspensar as células na mistura mestre de coloração contendo concentrações otimizadas de anticorpos. Inclua células com rótulo de isótipo e BSLBs, BSLBs fluorescentes e não fluorescentes, e células e BSLBs manchadas sozinhas. Misture suavemente por pipetting para cima e para baixo metade do volume.Incubar por 30 minutos no gelo e protegê-los da luz. Lave as células e os BSLBs duas vezes usando PBS 2%BSA com frio gelado. Gire-os a 500x G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Após a centrifugação, verifique a cocultura sedimentada na parte inferior dos poços. Em seguida, resuspenja as co-culturas lavadas em 100 microliters de PBS e adquira imediatamente. Ative a escala de log para luz dispersa lateral e o parâmetro de tempo de voo para luzes de lado e para a frente.Adquira os padrões MESF, garantindo que tanto as populações dim-set quanto as mais brilhantes caiam na faixa linear do instrumento. Em seguida, adquira amostras de compensação, calcule a compensação e aplique a matriz de compensação ao experimento. Adquira e economize um mínimo de 20.000 padrões totais de MESF para cada canal de quantificação.Evite o uso de fluido de bainha FACS ou similar a contas MESF resuspend, pois estas contêm sais e álcoois que destruirão os fluorochromes, levando a picos de fluorescência mais amplos e alto erro. Para aquisição utilizando samplers de alto rendimento, defina a aquisição de instrumentos à Standard, defina a aquisição de amostras para 80 microlitros. Taxa de Fluxo amostral entre dois e três microliters por segundo, amostra de Volume de Mistura em 50 microliters, mistura amostral de 150 microliters por segundo e mistura por poço entre três e cinco.Adquira um mínimo de 10.000 BSLBs únicos por amostra. Finalmente, exporte os arquivos FCS. Um exemplo de medidas quantitativas de citometria de fluxo de ICAM-1 na superfície de células Amigillar e células T auxiliares é mostrado aqui.As imagens representativas descrevem a estratégia de gating para analisar células únicas CXCR5 B e células T foliculares isoladas de amígdalas palatinas humanas. Esta estratégia de gating sequencial identifica eventos ao vivo únicos dentro da janela de aquisição contínua. Os doublets, a expressão da superfície celular do ICAM-1 em comparação com os controles FMO e os controles de FMO rotulados com isótipos relevantes das populações, são mostrados aqui.Gating e medição de MFIs de diferentes populações padrão de MESF nos histogramas sobrepostos das populações do MESF são mostrados aqui. Os valores representam os MFIs para cada uma das cinco populações do MESF. A regressão linear do MESF sobre a CMFI para as populações do MESF é apresentada aqui.A inclinação extrai MESF vinculado às células dos dados fcm do ICAM-1 na superfície de células B tonsilárgas em TFH. A conversão para densidades moleculares absolutas segue essas simples operações matemáticas. As imagens representativas mostram a análise de citometria de fluxo de BSLBs reconstituídas com densidades aumentadas de histidinas monoméricas recombinantes ICAM-1 12.Análises de regressão da concentração de referência ICAM-1 sobre densidade medida são mostradas aqui. A inclinação é usada para calcular concentrações-alvo de proteína para atingir a densidade das células. Os diagramas de fluxo mostram os passos críticos para co-culminar células T com BSLBs, reconstituindo membranas modelo na medição subsequente da transferência de partículas com citometria de fluxo.A estratégia de gating para identificar BSLBs e células únicas dentro da janela de aquisição contínua é mostrada aqui. Um dos aspectos mais importantes deste protocolo é que, para manter a reprodutibilidade dos resultados, cada vez que você muda os estoques de proteínas ou lipídios, você precisa realizar uma nova análise de calibração. Para descobrir novas moléculas eficazes secretadas por diferentes subconjuntos de células T, os BSLBs podem ser ainda mais isolados pela classificação celular ativada pela fluorescência, como submetidos à análise transcriômica e proteômica.Nossos colegas da Universidade de Oxford têm usado essa tecnologia para estudar e demonstrar novas interações receptor-ligantes, e também para estudar os efeitos das ablações genéticas na saída da sinapse imunológica das células T.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Suportados bicamadas planar são ferramentas poderosas que podem ser usados ​​para modelar as interações moleculares em uma sinapse imunológica. Aqui, vamos mostrar os métodos de ancoragem de proteínas de adesão celular que modula a formação de sinapses para o folheto superior do bilyer lipídico e visualize a formação de sinapses através de microscopia TIRF.

Suportados Bicamadas Planar para a Formação do Estudo da Sinapses imunológicas e Kinapse

Este vídeo descreve a técnica de estudo da montagem da proteína septina em microesferas revestidas com bicamadas lipídicas. Essa técnica ajuda a entender os conjuntos de proteínas dependentes da curvatura em superfícies curvas.

Ensaio de Bicamada Lipídica Esférica Suportada: Uma Técnica para Observar a Montagem de Septina em Microesferas

Este vídeo demonstra uma técnica para visualizar a formação da sinapse imunológica em células natural killer (NK) em uma bicamada lipídica (SLB) suportada. O SLB é primeiro marcado com um ligante do receptor ativador de células NK marcado com fluoróforo, seguido de incubação com células NK. Posteriormente, as células são coradas para actina polimerizada e grânulos líticos positivos para perforina. Essa abordagem permite a visualização da formação de sinapses usando microscopia de depleção de...

Imagem de super-resolução da formação de sinapses imunológicas de células NK em uma bicamada lipídica suportada

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para estudar a formação de sinapses imunes entre células T humanas primárias e bicamadas lipídicas suportadas (SLB). As proteínas da superfície das células T interagem com os respectivos ligantes imobilizados no SLB para formar uma sinapse imune, seguida pelo movimento dos grânulos líticos em direção à sinapse, que é visualizado por meio de microscopia de fluorescência.

Uma técnica in vitro para estudar a interação de células T com bicamadas lipídicas planares suportadas

Este vídeo ilustra a reconstituição de células apresentadoras de antígenos sintéticos por meio de bicamadas lipídicas suportadas por grânulos e sua aplicação na avaliação da saída sináptica gerada por células T ativadas.

Utilizando bicamadas lipídicas suportadas por grânulos para investigar a saída sináptica das células T

Bicamadas lipídicas suportadas e partículas de membranas naturais são sistemas convenientes que podem aproximar as propriedades das membranas celulares e ser incorporadas em uma variedade de estratégias de análise. Aqui demonstramos um método para a preparação de compostos de microarrays de suporte revestidas de lípidos em bicamada-SiO 2 grânulos, vesículas de fosfolípidos ou partículas de membranas naturais.

Formação de biomembrana Microarrays com um método de montagem baseada em Rodo

Descrevemos aqui uma combinação da técnica de bicamada lipídica suportada em vidro de formação de sinapses imunológicas com a técnica de imagem de super-resolução de microscopia de depleção por emissão estimulada (STED). O objetivo deste protocolo é fornecer aos usuários as instruções necessárias para realizar com sucesso essas duas técnicas.

Super-Resolution Imaging da Célula Natural Killer imunológica Synapse em um vidro com suporte Planar Lipid Bilayer

A imunidade adaptativa é controlada por 'sinapses imunológicas' dinâmicas formadas entre células T e células apresentadoras de antígenos. Este protocolo descreve métodos para investigar células endoteliais como APCs fisiológicas pouco estudadas e como um novo tipo de 'modelo de APC celular planar'.

Um modelo de celular endotelial Planar for Imaging imunológica Synapse Dynamics

Apresenta-se um protocolo para funcionalizar vidro com manchas proteicas nanométricas rodeado por uma bicamada lipídica fluida. Estes substratos são compatíveis com microscopia óptica avançado e espera-se para servir como plataforma para estudos de adesão celular e de migração.

Matrizes ligando Nano-fragmentação em uma bicamada lipídica Compatível

O protocolo descreve uma técnica para estudar a capacidade das células T policlonais humanas de primário para formar sinápticas interfaces usando bilayers do lipid planar. Usamos esta técnica para mostrar a capacidade de formação de sinapse diferencial de células T humanas primárias derivado dos gânglios linfáticos e sangue periférico.

Avaliação da Interface sináptica de células T humano primário do sangue periférico e tecido linfoide

Este protocolo descreve a formação de células imitando vesículas uni-lipídicas e multi-lipídicas, bicamadas lipídicas suportadas e bicamadas lipídicas suspensas. Estes modelos in vitro podem ser adaptados para incorporar uma variedade de tipos lipídes e podem ser usados para investigar várias interações de moléculas e macromoléculas.

Montagem de Modelos de Bicamadas lipídicas apoiadas e suspensas para o estudo de interações moleculares

Aprenda a preparar bicamadas lipídicas apoiadas por contas para estudar a saída de partículas de sinapses imunes de células T. Este método utiliza citometria de fluxo multicolorida para análise precisa.

Preparação de Bicamadas lipídicas apoiadas por contas para estudar a saída de partículas de sinapses imunes de células T

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