Name: DetectSyn: um método fluorescente rápido e imparcial para detectar alterações na densidade da sinapse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-22T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprenda o método DetectSyn para detectar alterações na densidade sináptica usando ensaio de ligação por proximidade em neurônios cultivados e tecido fixo. Esta técnica rápida e imparcial auxilia pesquisadores em neurociência.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde NINDS R01 NS105005 (KRG) e NS105005-03S1 (KRG), Departamento de Defesa USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH), e uma bolsa da FRAXA Research (CFH) e da Associação de Alzheimer, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG).

O isolamento de células e tecidos de animais foi de acordo com o Guia nacional de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório e aprovado pelo Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais da Floresta de Despertar
NOTA: Este protocolo é utilizado em amostras já tratadas e fixas por paradigmas e requisitos experimentais específicos. Para fins de demonstração, a formação de sinapse devido ao tratamento antidepressivo rápido é usada para destacar esta técnica de detecção de sinapse6. Neurônios previamente cultivados em tampas, tratados, fixados em 4% de paraformaldeído (PFA), e armazenados em 1x salina tamponada com fosfato (PBS) serão usados para destacar os procedimentos in vitro. Tecido hipocampal anteriormente fatiado (25 μm de espessura) de camundongos tratados, transcardialmente perfumado com PBS gelado e 4% PFA, e depois armazenado em crioprotetor será usado para destacar os procedimentos de fatia. Consulte11,12 para obter mais informações sobre como cultivar neurônios ou roedores transcárdio perfumados. Consulte a Figura 1 para uma representação gráfica deste procedimento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63139/63139fig01.jpg"> Figura 1: Representação gráfica do ensaio DetectSyn. Após a permeabilização das membranas celulares, os anticorpos primários para Synapsin1 e PSD95 se ligam a essas proteínas sinápticas. Secundários com etiquetas de oligonucleotídeos, em seguida, ligam-se aos anticorpos primários. Se Synapsin1 e PSD95 estiverem dentro de 40 nm, como em uma sinapse, então os oligonucleotídeos interagem, e uma tag fluorescente é amplificada. Este sinal fluorescente pode então ser imageado através de microscopia padrão e analisado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63139/63139fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
1. Enxágüe amostras
<ol><li>Enxágüe as amostras com 500 μL de 1x PBS + 0,75% de glicina por 5 min 3 vezes com agitação suave em um agitador orbital para remover PFA residual ou crioprotetor.</li>
</ol>2. Bloquear e permeabilize amostras
<ol><li>Prepare a solução de bloqueio e permeabilização (soro de burro 10% normal, 0,25% Tween 20) em 1x PBS. Prepare-se o suficiente para usar para incubações de bloqueio, primárias e secundárias.</li>
	<li>Às amostras (por exemplo, deslizamentos ou fatias flutuantes livres) em 24 placas de poço, adicione 500 μL de solução de bloqueio e permeabilização. Certifique-se de que cada poço contém uma amostra diferente e é apropriadamente rotulado para evitar que as amostras sejam trocadas.</li>
	<li>Incubar as amostras à temperatura ambiente (RT) por 60 min para células cultivadas ou 2 h para tecido fatiado. Use um agitador orbital para agitação suave.</li>
</ol>3. Incubar amostras em anticorpos primários
<ol><li>Prepare os anticorpos primários no buffer de bloqueio:<ol>
<li>Preparar densidade postina 95 (PSD95; 1:500, polclonal de coelho), Sinapsin1 (1:500, monoclonal do rato), MAP2 (1:400, policlonal de frango)</li>
		<li>Prepare uma alíquota de controle negativo que omita um dos pares sinápticos (por exemplo, sem PSD95)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova cuidadosamente a solução de bloqueio com uma pipeta pasteur de plástico. Tente remover o máximo possível sem perturbar as células ou rasgar tecido.</li>
	<li>Para células cultivadas:<ol>
<li>Forme uma grande placa de petri de plástico com parafilm. Transfira cuidadosamente as tampas para o parafilm usando fórceps.</li>
		<li>Adicione cuidadosamente 60 μL da solução de anticorpos primários ao topo das tampas. Certifique-se de não derramar a solução de anticorpos primária sobre o lado da tampa.</li>
		<li>Para fornecer umidade e evitar que as amostras sequem durante o período de incubação, adicione água ultrauso a uma placa de Petri menor e organize cuidadosamente a pequena placa de Petri ao redor das tampas.</li>
		<li>Cubra a grande placa de Petri e incuba as células cultivadas por 1 h na RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para tecido fatiado:<ol>
<li>Adicione cuidadosamente 250 μL da solução de anticorpos primários a fatias flutuantes em uma placa de 24 poços.</li>
		<li>Cubra a placa e incuba o tecido durante a noite a 4 °C com agitação suave em um agitador orbital.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Lave amostras e incuba em anticorpos secundários
<ol><li>Prepare anticorpos secundários no buffer de bloqueio:<ol>
<li>Prepare o anti-rato burro (1:5), anti-coelho de burro (1:5), anti-frango de burro (1:400).</li>
		<li>Nesta etapa, controles técnicos adicionais podem ser obtidos preparando uma alíquota secundária que omite o anti-rato ou anti-coelho secundário.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para células cultivadas:<ol>
<li>Usando fórceps, toque cuidadosamente a solução primária de tampas em uma toalha de papel</li>
		<li>Usando fórceps, transfira cuidadosamente as tampas de volta para a placa original de 24 poços preenchidas com 500 μL de 1x PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para tecido fatiado:<ol>
<li>Remova cuidadosamente a solução de anticorpos primários com uma pipeta pasteur de plástico. Tente remover o máximo possível sem rasgar tecido.</li>
		<li>Adicionar 500 μL de 1x PBS</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave as amostras por 10 min 3 vezes em 1x PBS com agitação suave em um agitador orbital. Durante este tempo, leve todos os buffers de lavagem para RT.<ol>
<li>Durante este tempo, mude o parafilm na grande placa de Petri</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para células cultivadas:<ol>
<li>Usando fórceps, transfira cuidadosamente as tampas de volta para a placa de Petri grande parafilmada</li>
		<li>Adicione cuidadosamente 40 μL da solução de anticorpos secundários à parte superior das tampas. Certifique-se de não derramar a solução secundária de anticorpos sobre o lado da tampa.</li>
		<li>Se necessário, adicione mais água ultrauso a uma placa de petri menor e organize cuidadosamente a pequena placa de petri em torno de tampas.</li>
		<li>Cubra a grande placa de Petri</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para tecido fatiado:<ol>
<li>Adicione cuidadosamente 250 μL da solução de anticorpos secundários a fatias flutuantes em uma placa de 24 poços.</li>
		<li>Cubra a placa NOTA: A partir de agora, proteja as amostras da luz, envolvendo os topos das placas com papel alumínio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar as amostras a 37 °C por 1 h</li>
</ol>5. Ligadura
<ol><li>Misture o estoque de ligadura 1:5 em água de grau molecular.</li>
	<li>Como na seção 4, transfira cuidadosamente as tampas e remova a mistura secundária do tecido fatiado.</li>
	<li>Lave as amostras em 500 μL de tampão de lavagem A<ol>
<li>Para células cultivadas, lave 2 vezes por 5 minutos. Para tecido fatiado, lave 2 vezes por 10 minutos. Use agitação suave em um agitador orbital para ambos.</li>
		<li>Durante este tempo, mude o parafilm na grande placa de Petri</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mantendo a ligase em um bloco frio, diluir o ligase 1:40 no estoque de ligaduras a partir do passo 5.1. Realize esta diluição imediatamente antes de adicionar o ligase às amostras.</li>
	<li>Como na seção 4, remova o máximo possível do tampão de lavagem A das amostras antes de adicionar o ligase.</li>
	<li>Para células cultivadas: A transferência cobre clipes de volta para a placa de Petri parafilmada. Adicione 40 μL da mistura de ligadura aos deslizamentos, organize pequenas placas de Petri cheias de água ao redor das tampas e cubra a grande placa de Petri.</li>
	<li>Para tecido fatiado: Adicione 250 μL da mistura de ligadura da etapa 5.4 para cada poço e cubra a placa.</li>
	<li>Incubar as amostras por 30 min a 37 °C.</li>
</ol>6. Amplificação
<ol><li>Misture o estoque de amplificação 1:5 em água de grau molecular.</li>
	<li>Como na seção 4, transfira cuidadosamente as tampas e remova a mistura de ligadura do tecido fatiado.</li>
	<li>Lave amostras em 500 μL de tampão de lavagem A<ol>
<li>Para células cultivadas, lave 2 vezes por 2 minutos. Para tecido fatiado, lave 2 vezes por 10 minutos. Use agitação suave em um agitador orbital para ambos.</li>
		<li>Durante este tempo, mude o parafilm na grande placa de Petri</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realize esta diluição imediatamente antes de adicionar a polimerase às amostras. Enquanto mantém a polimerase em um bloco frio, dilui a polimerase<ol>
<li>Para células cultivadas, diluir a polimerase 1:80 no estoque de amplificação a partir da etapa 6.1.</li>
		<li>Para tecido fatiado, diluir a polimerase 1:40 no estoque de amplificação a partir da etapa 6.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Como na etapa 4, remova o máximo possível do tampão de lavagem A das amostras antes de adicionar a polimerase.</li>
	<li>Para células cultivadas: Transfira as tampas de volta para a placa de Petri parafilmada. Adicione 40 μL da mistura de amplificação da etapa 6.4.1 às tampas, organize pequenas placas de Petri cheias de água ao redor das tampas e cubra a grande placa de Petri. Incubar as amostras por 100 min a 37 °C.</li>
	<li>Para tecido fatiado: Adicione 250 μL da mistura de amplificação da etapa 6.4.2 para cada poço e cubra a placa. Incubar as amostras por 2h a 37 °C. NOTA: Durante este tempo, prepare e rotule slides.</li>
</ol>7. Montagem
<ol><li>Como na etapa 4, transfira cuidadosamente as tampas e remova a mistura de amplificação do tecido fatiado.</li>
	<li>Lave as amostras em 500 μL de tampão de lavagem B 2 vezes por 10 minutos com agitação suave em um agitador orbital.</li>
	<li>Lave as amostras em 500 μL de 1% de tampão de lavagem B por 1 min com agitação suave em um agitador orbital.</li>
	<li>Para células cultivadas:<ol>
<li>Solte 3 μL de mídia de montagem em um slide</li>
		<li>Toque no excesso de tampão de lavagem do deslizamento de tampas e, em seguida, coloque o deslizamento (com células voltadas para baixo) na mídia de montagem. Sele as laterais com uma pequena quantidade de esmalte transparente para selar a mancha no lugar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para tecido fatiado:<ol>
<li>Transfira cuidadosamente uma fatia de tecido para o slide preparado e organize-a, de modo que a fatia esteja plana. Solte entre 5-10 μL de mídia de montagem (a quantidade dependerá do tamanho da fatia) na fatia de tecido</li>
		<li>Coloque cuidadosamente uma mancha de vidro sobre a fatia de tecido e selado com uma pequena quantidade de esmalte transparente ao longo da borda para selar a mancha no lugar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aguarde pelo menos 15 minutos antes de analisar sob o microscópio ou armazene a -20 °C.</li>
</ol>8. Obtenha imagens digitais com um microscópio confocal
<ol><li>Otimize as configurações de aquisição (por exemplo, potência laser, ganho, deslocamento) em amostras de todos os tratamentos. Certifique-se de que a otimização inclui a diminuição do ruído de fundo e o aumento do sinal sem saturar demais a intensidade dos sinais fluorescentes. Uma vez determinadas as configurações, aplique as mesmas configurações de aquisição em todas as imagens obtidas. NOTA: Os seguintes detalhes de aquisição podem ser usados com um microscópio confocal Nikon A1 e o software Nikon NIS AR Elements.</li>
	<li>Coloque o slide com a amostra no palco e encontre o plano focal para a amostra usando DAPI através da ocular.</li>
	<li>Desligue a porta dos olhos clicando na porta Eye e escolha um botão de configuração óptica para ajustar as configurações.</li>
	<li>Ajuste o ganho, deslocamento e potência laser para cada canal fluorescente para diminuir o ruído de fundo e melhorar o sinal fluorescente. Certifique-se de que o sinal fluorescente não fique supersaturado como mencionado nas etapas 8.5-8.6.</li>
	<li>Monitore a supersaturação usando um pseudocolor para o sinal fluorescente. Na parte inferior da imagem ao vivo, clique com o botão direito do mouse na guia rotulada com o canal fluorescente atualmente sendo usado.</li>
	<li>Em seguida, escolha o Canal Coloração e escolha um pseudocolor como Rainbow Dark para visualizar a intensidade da fluorescência em um pseudocolor de mapa de calor. Em Rainbow Dark, cores mais frias indicam menos intensidade fluorescente, e cores mais quentes indicam mais intensidade fluorescente.</li>
	<li>Uma vez que todos os canais fluorescentes sejam otimizados, clique com o botão com o botão direito de configuração escolhido anteriormente e escolha Atribuir configuração de câmera atual para este botão.</li>
	<li>Verifique se as configurações escolhidas são suficientes para uma amostra aleatória de cada grupo de tratamento. Se as configurações escolhidas sobressaturarem qualquer uma dessas amostras, repita o passo 8.4 para eliminar a sobresaturação.</li>
	<li>Para neurônios cultivados, siga os passos 8.10-8.16.</li>
	<li>Usando a porta ocular, procure por um neurônio com dendritos que tenham sobreposição mínima com outros dendritos.</li>
	<li>Desligue a porta dos olhos e use o canal DAPI para visualizar o corpo celular do neurônio escolhido. Clique duas vezes no centro da soma para centralizar o neurônio no meio do campo de visão.</li>
	<li>Usando o canal MAP2, encontre o melhor plano de foco para o sinal MAP2 com varredura ao vivo.</li>
	<li>Na guia ND Acquisition , clique em Salvar para Arquivar e escolha um arquivo para salvar a imagem em "Procurar". Em seguida, insira o nome do arquivo.</li>
	<li>Na guia Z , selecione a opção Modo Simétrico Definido por Intervalo . Defina o foco para o melhor plano MAP2 e clique no botão Relativo para definir este plano focal como o meio da pilha z.</li>
	<li>Defina o intervalo para 5 μm com passos de 1 μm e certifique-se de verificar o obturador ativo durante o movimento Z. Na guia Comprimento de onda , selecione o nome do botão óptico com as configurações de aquisição previamente configuradas em Optical Conf. Em seguida, clique em Executar agora.</li>
	<li>Repetir as etapas 8.1.10-8.1.15 para cerca de 10 neurônios por deslizamento/tratamento.</li>
	<li>Para tecido fatiado, siga as etapas 8.18-8.22.</li>
	<li>Usando o olho-porta, procure a região de interesse. Por exemplo, localize CA1 do hipocampo.</li>
	<li>Desligue a porta dos olhos e use o canal MAP2 para encontrar o melhor plano de foco para o sinal MAP2 com varredura ao vivo.</li>
	<li>No menu Adquirir , escolha Digitalizar grande imagem. Em seguida, selecione o nome do botão óptico com as configurações de aquisição previamente configuradas sob o painel Capturando do painel que abre. Além disso, certifique-se de selecionar o objetivo correto neste painel.</li>
	<li>Sob o painel Área e a ocular, use as teclas de seta para definir os limites da região de interesse. Em seguida, clique em Salvar imagem grande para arquivar e criar um nome de arquivo de caminho de salvar para a imagem.</li>
	<li>No painel Configuração , certifique-se de que o Multichannel Capture seja verificado e, em seguida, escolha o nome do botão óptico com as configurações de aquisição previamente configuradas em Optical Conf. NOTA: Uma pilha de z para uma imagem grande é possível, mas aumentará o tempo de varredura.</li>
</ol>9. Análise
<ol><li>Semelhante às configurações de aquisição, use amostras de todos os tratamentos para otimizar as configurações de limiar. Certifique-se de que a otimização do limiar se concentre em diminuir o ruído de fundo e melhorar o sinal sem sobressaturar a intensidade dos sinais fluorescentes. Uma vez determinadas essas configurações, aplique as mesmas configurações de limiar em todas as imagens usadas para análise, conforme descrito nas etapas 9.2-9.3.</li>
	<li>No ImageJ, a opção limiar está localizada no menu Imagem &gt; Ajustar &gt; Limiar. Escolha a opção Fundo Escuro se a imagem tiver um fundo escuro.</li>
	<li>Em seguida, ajuste os limites superior e inferior do limiar por configurações de limiar otimizados previamente determinadas e clique em Aplicar.</li>
	<li>Para células cultivadas, use o canal MAP2 e uma ferramenta de região de interesse (ROI) para desenhar um ROI para cada neurônio, incluindo dendritos e soma. Para tecido fatiado, desenhe um ROI à mão livre dentro da imagem de fatia que encapsula a área de interesse (por exemplo, radiador de estrato do CA1 dentro do hipocampo).</li>
	<li>Obtenha a área do ROI. No ImageJ, meça a área sob o menu Analisar &gt; Medida.</li>
	<li>Detecte o número de puncta dentro de cada ROI usando uma ferramenta de detecção automática como análise de partículas no ImageJ seguindo as etapas 9.7-9.9.</li>
	<li>Encontre a opção Análise de partículas no menu Analisar &gt; analisar partículas. Primeiro, defina o diâmetro do tamanho do puncta, tipicamente de 0,1-3 μm2.</li>
	<li>Em seguida, escolha a opção Máscaras de Sobreposição no menu suspenso do Show e verifique a opção Resultados de exibição. Em seguida, clique em OK.</li>
	<li>Se puncta não for detectado com a faixa de diâmetro escolhida, ajuste a faixa até que todos os puncta sejam detectados com esta análise. Certifique-se de usar as mesmas configurações de análise de partículas para todas as imagens.</li>
	<li>Divida o número de puncta pela área de uma região de interesse individual seguindo as etapas 9.11-9.13.</li>
	<li>Copie e cole os resultados de cada imagem do pop-up resultados do ImageJ em uma planilha.</li>
	<li>Primeiro, identifique de qual arquivo e amostra os dados foram obtidos. Em seguida, divida a área do ROI pelo número de puncta.</li>
	<li>Em seguida, limpe os dados do pop-up resultados e repita as etapas 9.2-9.12.</li>
	<li>Normalizar resultados para controlar amostras: Média dos resultados (número de puncta/área de ROI) para as amostras de controle. Em seguida, divida os resultados obtidos de todas as amostras pela média do controle para obter os resultados normalizados. A nova média das amostras de controle deve ser igual a 1.</li>
</ol>

<ol><li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+an+understanding+of+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Towards an understanding of synapse formation.</a> Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).</li>
<li>Bliss, T. V., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synaptic+model+of+memory%3A+long-term+potentiation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus.</a> Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).</li>
<li>Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeaney%2C+CF+%22The+Oxford+Handbook+of+Neuronal+Protein+Synthesis%22">The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis</a>. , Oxford University Press. NY. 510-532 (2018).</li>
<li>Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+remodeling+during+aging+and+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 9, 91-99 (2006).</li>
<li>van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+pathology+in+psychiatric+and+neurologic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neurology+and+Neuroscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).</li>
<li>Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+FMRP+in+rapid+antidepressant+effects+and+synapse+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation.</a> Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).</li>
<li>Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines+shape+analysis-Classification+or+clusterization%3F+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31(2020).</li>
<li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).</li>
<li>Berry, K. P., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+Dynamics%3A+Are+they+all+the+same%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spine Dynamics: Are they all the same.</a> Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).</li>
<li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+A+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1-dependent+protein+synthesis+underlying+rapid+antidepressant+effect+requires+GABABR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling.</a> Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).</li>
<li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR-dependent+synapse+formation+underlies+the+rapid+antidepressant+effects+of+NMDA+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists.</a> Science. 329 (5994), 959-964 (2010).</li>
</ol>

Os autores não relatam conflito de interesses.

DetectSyn é um ensaio rápido que usa um ensaio de ligadura de proximidade para detectar proteínas dentro de 40 nm uma da outra, o que permite a detecção da formação de sinapse. Esta técnica melhora os ensaios fluorescentes atuais, que servem apenas como medidas proxy para formação de sinapse. DetectSyn detecta alterações quantificáveis em proteínas sinápticas localizadas dentro de 40 nm, ou seja, dentro da fissura sináptica, umas das outras. Além disso, o DetectSyn é mais econômico e leva menos tempo do que técnicas, com...

As sinapses são a unidade fundamental de comunicação entre os neurônios1. Muitas sinapses entre neurônios dentro das mesmas regiões dão origem a circuitos que mediam o comportamento2. As sinapses consistem em um terminal pré-sináptico de um neurônio que libera neurotransmissores ou neuropeptídeos que retransmitem informações para receptores postsináspicos de outro neurônio. A soma dos sinais pré-sinápticos determina se o neurônio postsinásptico disparará um potencial de ação e propagará a mensagem para outros neurônios.
A sinaptopatologia, a quebra das sinapses, surge em doenças e distúrbios marcados pela diminuição do volume neural, como a doença de Alzheimer e o transtorno depressivo grave, resultando em circuitos que não funcionam maisde forma ideal 3,4,5. Restaurar a densidade da sinapse provavelmente está por trás da eficácia de tratamentos potenciais para esses distúrbios. Por exemplo, foi recentemente demonstrado que o aumento das sinapses está por trás da eficácia comportamental dos antidepressivos rápidos6. Para testar rapidamente possíveis tratamentos de sinaptopatologia, os pesquisadores exigem técnicas que identifiquem rapidamente mudanças nos números da sinapse.
As metodologias atuais são demoradas e caras (microscopia eletrônica, tomografia de matriz), ou examinam apenas alterações postsináspticas sem incorporar engajamento pré-sináptico (análises da coluna vertebral, imunofluorescência/colocalização). Corantes como dii ou proteínas fluorescentes como gfp ajudam a visualizar neurônios e caracterizam espinhas pós-sinápticas. No entanto, a análise da coluna vertebral utiliza razões definidas pelo pesquisador para determinar a morfologia, o que pode diminuir a reprodutibilidade7. Além disso, como as diferentes classes de coluna vertebral se relacionam com sinapses funcionais ainda está sendo descoberto8. A formação da coluna vertebral pode ser transitória e pode refletir plasticidade post-sináptica, mas essas espinhas podem ser eliminadas antes de estabilizar em uma sinapse com um neurônio pré-sináptico9.
A colocalização fornece um proxy melhor para sinapses do que a análise da coluna vertebral, porque pode-se imunossuer proteínas pré-sinápticas e pós-sinápticas. No entanto, as proteínas sinápticas podem produzir baixos valores de colocalização porque as proteínas são justapostas e podem não se sobrepor consistentemente. Assim, como as proteínas não são totalmente sobrepostas, as técnicas de colocação podem não medir com precisão as alterações na formação de sinapse devido a essa informação perdida. Finalmente, embora tanto a microscopia eletrônica (EM) quanto a tomografia de matriz forneçam imagens de alta resolução de sinapses, elas são demoradas. A EM requer ainda equipamentos especializados, e os pesquisadores estão limitados a pequenos volumes de tecido para qualquer experimento. Embora a tomografia de array forneça elegantemente a capacidade de tela para muitas proteínas em seções ultrathin e possa ser combinada com o EM10, essa técnica pode ser muito trabalhosa e além do escopo de experimentos que precisam digitalizar rapidamente para mudanças na formação de sinapsia.
DetectSyn é uma aplicação específica do Ensaio de Ligadura de Proximidade duolink. O ensaio PLA permite a detecção geral de interações proteína-proteína. Detecta as pontes proxy medidas pós-sinápticas amplificando um sinal fluorescente emitido por proteínas pré e pós-sináptica marcadas dentro de 40 nm uma da outra. Se as proteínas sinápticas estiverem dentro de 40 nm, como dentro de uma fenda sináptica, então os anticorpos secundários, que contêm sondas de DNA, hibridizarão em DNA circular. Este DNA circular hibridizado expressa uma sonda fluorescente, que é então amplificada e detectada com técnicas padrão de microscopia fluorescente (ver Figura 1). Crucialmente, ao contrário da em e tomografia de matriz, esta técnica não requer equipamento especializado e leva cerca da mesma quantidade de tempo que a imunohistoquímica padrão. A acessibilidade dessa técnica, assim, permite que pesquisadores fora de instituições intensivas em pesquisa participem de pesquisas sinaptopológicas. Além disso, essa técnica pode examinar alterações na densidade sináptica em múltiplas regiões cerebrais dentro de um único experimento, oferecendo uma representação mais holística de mudanças sinápticas devido a doenças ou tratamento.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP39920</td><td>PBS feito em obras domésticas também.</td></tr><tr><td>Placas de 24 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012929</td><td>Para fatias de tecido, placas pré-esterilizadas podem ser desnecessárias.</td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Folha de alumínio</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-078-290</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-MAP2 de frango</td><td>Abcam</td><td>ab5392</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte transparente</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1849418</td><td>Outros esmaltes transparentes também funcionam.</td></tr><tr><td>Bloco frio</td><td>Fisher Scientific</td><td>13131012</td><td></td></tr><tr><td>Estação de trabalho de computador</td><td>HP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal ou fluorescente</td><td>Nikon</td><td>A1R HD25</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-frango FITC</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA1-72000</td><td></td></tr><tr><td>Duolink burro anti-Mouse PLUS</td><td>Sigma</td><td>DUO92001</td><td></td></tr><tr><td>Duolink burro anti-Coelho MENOS</td><td>Reagentes</td><td></td> de detecção in situ Sigma DUO92005 <td></td></tr><tr><td>Duolink Far Red</td><td>Sigma</td><td>DUO92013</td><td>Contém estoque de ligação, estoque de amplificação, ligase e polimerase.</td></tr><tr><td>Meio de montagem in situ Duolink com DAPI</td><td>Sigma</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Tampões de lavagem in situ, Sigma de fluorescência</td><td></td><td>DUO82049</td><td>Contém tampão de lavagem A e tampão de lavagem B; dilua o tampão de lavagem B a 1% em diH20 para tampão de lavagem B a 1%.</td></tr><tr><td>Pincel de ponta fina</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9691026</td><td>Cabelo de zibelina, tamanho 00 ou 000, também pode ser encontrado em lojas de artesanato</td></tr><tr><td>Fisherbrand Cover Glasses: Retângulos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545MP</td><td>O vidro de cobertura é desnecessário para neurônios cultivados já em lamínulas de vidro.</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio Superfrost Plus da marca Fisher</td><td></td><td>1255015</td><td>Científica Para neurônios cultivados já em lamínulas de vidro, as lâminas Superfrost podem ser desnecessárias.</td></tr><tr><td>Congelador, -20&deg; C</td><td>VWR</td><td>76449-108</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>125480</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Software de processamento de imagem</td><td>, por exemplo, NIS Elements, Incubadora ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>15-015-2633</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri grande, 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Água de grau molecular</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24701</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-Synapsin1 anticorpo</td><td>Synaptic Systems</td><td>106-011</td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro normal</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-106-1013</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de Pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-025</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td><td>Volumes de trabalho variam de 3 &micro; L a 500 &micro; L</td></tr><tr><td>Pipeta de pasteur de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-708-006</td><td></td></tr><tr><td>Pinças/foreceps de precisão</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-PSD95 de coelho</td><td>Abcam</td><td>ab18258</td><td>Outros pares de anticorpos também podem funcionar com otimização.</td></tr><tr><td>Frigorífico</td><td>VWR</td><td>76470-402</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri pequena, 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-649-17</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr></tbody></table>

detectsyn: um método fluorescente rápido e imparcial para detectar alterações na densidade da sinapse

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

Sinapses são o local de comunicação entre neurônios. A força do circuito neuronal está relacionada à densidade sináptica, e a quebra das sinapses é característica de estados da doença como transtorno depressivo grave (MDD) e doença de Alzheimer. Técnicas tradicionais para investigar números de sinapse incluem expressão genética de marcadores fluorescentes (por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP)), corantes que preenchem um neurônio (por exemplo, corante de carbocianina, DI) e detecção imunofluorescente de marcadores de coluna (por exemplo, densidade pós-sináptica 95 (PSD95)). Uma grande ressalva a essas técnicas de proxy é que elas só identificam alterações postsináspticas. No entanto, uma sinapse é uma conexão entre um terminal pré-sináptico e uma coluna postsintáptica. O padrão-ouro para medir a formação/eliminação da sinapse requer técnicas demoradas de microscopia eletrônica ou tomografia de matriz. Essas técnicas exigem treinamento especializado e equipamentos caros. Além disso, apenas um número limitado de neurônios pode ser avaliado e são usados para representar alterações em toda uma região cerebral. DetectSyn é uma técnica fluorescente rápida que identifica alterações na formação ou eliminação da sinapse devido a um estado da doença ou atividade medicamentosa. DetectSyn utiliza um ensaio de ligadura de proximidade rápida para detectar proteínas pré e pós-sináptica justtaposed e microscopia fluorescente padrão, uma técnica prontamente disponível para a maioria dos laboratórios. A detecção fluorescente do puncta resultante permite uma análise rápida e imparcial dos experimentos. DetectSyn fornece resultados mais representativos do que microscopia eletrônica porque áreas maiores podem ser analisadas do que um número limitado de neurônios fluorescentes. Além disso, a DetectSyn trabalha para neurônios in vitro cultivados e fatias de tecido fixo. Finalmente, é fornecido um método para analisar os dados coletados dessa técnica. No geral, o DetectSyn oferece um procedimento para detectar alterações relativas na densidade de sinapse em tratamentos ou estados de doença e é mais acessível do que as técnicas tradicionais.

Os dados modificados de Heaney et al.6 são apresentados para demonstrar um experimento onde é esperada maior formação de sinapse (consulte6 para obter mais informações e uma discussão mais aprofundada do mecanismo). Anteriormente, foi demonstrado que antidepressivos rápidos requerem ativação do receptor metabotrópico inibidor, GABAB (subtipo B de ácido gama-aminobutírico), para ser eficaz13. Além disso, dados anteriores indicaram que antidepressivos ...

DetectSyn é um ensaio fluorescente rápido e imparcial que mede mudanças no número de sinapse relativa (engajamento pré e pós-sináptico) entre os estados de tratamento ou doença. Esta técnica utiliza uma técnica de ligadura de proximidade que pode ser usada tanto em neurônios cultivados quanto em tecido fixo.

DetectSyn: um método fluorescente rápido e imparcial para detectar alterações na densidade da sinapse

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

DetectSyn aproveita a tecnologia de ensaio de ligadura de proximidade para identificar rapidamente mudanças nas sinapses. Também fornecemos um protocolo para analisar os resultados. A principal vantagem do DetectSyn é a rapidez com que os resultados podem ser obtidos nas grandes regiões de tecido que podem ser analisadas.Para começar, remova cuidadosamente a solução de bloqueio com uma pipeta pasteur de plástico sem perturbar as células. Em seguida, forrar uma grande placa de petri de plástico com Parafilm. E usando fórceps, transfira cuidadosamente os deslizamentos de cobertura para o Parafilm.Adicione 60 microliters da solução de anticorpos primários à parte superior da tampa, garantindo que a solução de anticorpos não derrame sobre as laterais do deslizamento da tampa. Para fornecer umidade e evitar que as amostras sequem durante a incubação, adicione água ultrauso a uma placa de Petri menor e coloque cuidadosamente a placa ao redor dos deslizamentos de cobertura. Em seguida, cubra a placa de Petri maior e incuba as células cultivadas por uma hora à temperatura ambiente.Após a incubação com o anticorpo primário, use fórceps para cortar cuidadosamente a solução de anticorpos primários da tampa desliza para uma toalha de papel e transfira os deslizamentos de cobertura para sua placa original de 24 poços cheia com 500 microliters de PBS. Em seguida, lave as amostras com PBS três vezes por 10 minutos cada uma com agitação suave em um agitador orbital. Após a última lavagem, transfira a tampa desliza de volta para a grande placa de Petri e adicione 40 microliters da solução de anticorpos secundários ao topo da tampa.Cubra a placa de Petri e incuba as amostras a 37 graus Celsius por uma hora. Para a ligadura, mantendo o ligase em um bloco frio, diluir o ligase de 1 a 40 usando o estoque de ligadura e adicionar imediatamente 40 microliters da mistura de ligase aos deslizamentos de cobertura. Cubra a placa de Petri e incuba as amostras a 37 graus Celsius por 30 minutos.Para amplificação, diluir a polimerase 1280 em um bloco frio usando o estoque de amplificação. Em seguida, adicione 40 microliters da mistura de amplificação aos deslizamentos de cobertura e incubar as amostras por 100 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, para a montagem, solte três microliters de mídia de montagem em um slide.Toque no excesso de tampão de lavagem do deslizamento da tampa e coloque o deslizamento da tampa com as células voltadas para baixo na mídia de montagem. Sele os lados com uma pequena quantidade de esmalte transparente para manter o deslizamento da tampa no lugar. Para a montagem do tecido fatiado, transfira cuidadosamente uma fatia de tecido para o slide preparado e coloque-a plana.Em seguida, deixe cair de 5 a 10 microliters de mídia de montagem na fatia de tecido. Coloque uma tampa de vidro sobre a fatia de tecido e sele o deslizamento da tampa com esmalte claro, como demonstrado anteriormente. Para imagens digitais com um microscópio confocal, ajuste o ganho, deslocamento e poder laser para cada canal fluorescente para diminuir o ruído de fundo e melhorar o sinal fluorescente.Certifique-se de que o sinal fluorescente não está supersaturado. Para os neurônios da cultura, na guia ND Acquisition, clique em Salvar para Arquivo. Em seguida, em Procurar, escolha um arquivo para salvar a imagem e insira o nome do arquivo.Em seguida, na guia Z, selecione a opção Modo Simétrico Definido por Intervalo. Defina o foco para o melhor mapa de dois planos e clique no botão Relativo para definir este plano focal como o meio da pilha z. Em seguida, defina o intervalo para cinco micrômetros com um passo de micrômetro e verifique Fechar o obturador ativo durante o movimento Z.Na guia Comprimento de onda, selecione o nome do botão óptico com as configurações de aquisição configuradas anteriormente em Configuração Óptica e clique em Executar agora. Para tecido fatiado, a partir do menu de aquisição escolha Digitalizar grande imagem e, em seguida, sob o painel de captura, selecione o botão óptico com as configurações de aquisição previamente configuradas. Além disso, selecione o objetivo correto neste painel.Em seguida, sob o painel de área e a peça ocular, use as teclas de seta para definir os limites da região de interesse ou ROI. Em seguida, clique em Salvar imagem grande para arquivar e criar um nome de arquivo save path para a imagem. Finalmente, no painel de configuração, certifique-se de que o Multichannel Capture seja verificado.Em seguida, escolha o nome do botão óptico com as configurações de aquisição previamente configuradas em configuração óptica. No ImageJ, abra a opção limiar indo para o menu de imagem, clicando em Ajustar e, em seguida, Limiar. Escolha a opção Fundo Escuro se a imagem tiver um fundo escuro.Em seguida, ajuste os limites superiores e inferiores do limiar por configurações de limiar otimizados previamente determinadas e clique em Aplicar. Para células cultivadas, use o canal MAP2 e uma ferramenta de ROI manual livre para desenhar um ROI para cada neurônio, incluindo dendritos e soma. Para o tecido fatiado, desenhe um ROI de mão livre dentro da imagem de fatia que encapsula a área de interesse.Em seguida, obtenha a área do ROI abrindo o menu Analisar e clicando em Medir. Para detectar o número de punta dentro de cada ROI, use uma ferramenta de detecção automática como análise de partículas. No menu Analisado, selecione Partículas Analisadas e defina o diâmetro do tamanho do puncta.Em seguida, a partir do menu suspenso do show, escolha a opção Máscaras sobrepostas, em seguida, verifique a opção Resultados de exibição e clique em Ok. Para dividir o número de punta pela área do ROI individual, copie e cole os resultados de cada imagem a partir dos resultados aparecem em uma planilha. Identifique de qual arquivo e amostra os dados de onde somos obtidos, e divida a área do ROI pelo número de punta.Por fim, para normalizar os resultados para controle das amostras, média dos resultados das amostras de controle e dividir os resultados obtidos de todas as amostras pela média do controle. O agonista GABAB, baclofen, é necessário para a eficácia in vitro do antidepressivo rápido Ro-256981. Um aumento na formação de sinapse é demonstrado por um aumento no punta branco.Sem baclofen, não se vê aumento na formação de sinapse. In vivo, a injeção intraperitoneal do antidepressivo rápido resulta em um aumento na formação de sinapse em comparação com o controle salino. Embora alguns punta apareçam nas imagens de controle técnico, eles geralmente não são do mesmo tamanho demonstrado pela especificação branca em comparação com o punta grande nos outros painéis.Além disso, esses punta não estão no mesmo local que demonstrado por algum punta que aparece dentro da soma. DetectSyn pode identificar alterações nas sinapses devido a um estado da doença ou tratamento medicamentoso. Este método pode ajudar a fornecer insights para qualquer área de pesquisa que estuda os transtornos que afetam o desenvolvimento ou a quebra de sinapses.

detectsyn-rapid-unbiased-fluorescent-method-to-detect-changes-synapse

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Sinapses glutamatérgicas pode mudar de um modo ativo de um modo silencioso. Nós demonstramos que o status de atividade pré-sináptica da cultura dissociada dos neurônios dos roedores é visualizado através de um formulário fixable do FM1-43 corante para visualizar sinapses ativas e imunocoloração com vGluT-1 anticorpos para visualizar todas as sinapses de glutamato.

Sinapses pré-sináptico Silencioso Estudou com Microscopia de Luz

Este protocolo detalhes como quantificar o número sinapse neuronal tanto na cultura dissociada e nas seções do cérebro utilizando imunocitoquímica. Usando compartimento de anticorpos específicos, nós rótulo terminais pré-sinápticos, bem como sites de especialização pós-sináptica. Nós definimos sinapses como pontos de co-localização entre os sinais gerados por estes marcadores.

Sinapses quantificar: um ensaio baseado em Imunocitoquímica para a quantificação do número Synapse

A abundância de receptores de neurotransmissores nas sinapses cluster influencia fortemente a força sináptica. Este método quantifica receptores de neurotransmissores fluorescente-etiquetados em três dimensões com um único sinapse resolução...

Quantificação automatizada de fluorescência em Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Descreve-se o uso de corantes estiril FM imagem sináptica reciclagem vesícula nos terminais nervosos funcionais. Este protocolo pode ser aplicado não só a evocada, mas também espontânea e actividades sinápticas em miniatura. O protocolo expande a variedade de eventos sinápticos que podem ser eficazmente analisados.

Exame do Synaptic Vesicle Reciclagem Usando FM Corantes Durante Evocado, espontânea, e as atividades de Synaptic miniatura

Este artigo fornece um método para investigar a dinâmica de vesículas de neurotransmissores em células de neuroblastoma, usando uma construção de sinaptobrevin2-pHluorina e Microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total. A estratégia desenvolvida para processamento de imagens e análise de dados também é relatada.

TIRFM e GFP-sondas sensíveis ao pH para avaliar Neurotransmitter Vesicle Dynamics em SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: imagens de células e Análise de Dados

Aqui nós mostramos como quantificar o número ea distribuição espacial das zonas ativas sinápticas em fotorreceptores de Drosophila melanogaster, destacou com um marcador molecular geneticamente codificado, e sua modulação após a exposição prolongada à luz.

Analisando Synaptic Modulação da<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorreceptores após exposição à luz prolongada

Um protocolo para com precisão, identificando e analisando as sinapses em fatias hippocampal usando a imunofluorescência é descrito neste artigo.

Avaliação da densidade de sinapse em fatias Hippocampal cérebro de roedor

Descrevemos um ensaio óptico para vesícula sináptica (SV) reciclagem em neurônios cultivados. Combinar este protocolo com duplo transfeccao de expressar uma proteína de interesse e o marcador pré-sináptica nos permite localizar sites pré-sináptica, sua vesícula sináptica, capacidade de reciclagem e determinar o papel da proteína de interesse.

Um ensaio óptico para vesícula sináptica reciclagem nos neurônios cultivados superexpressão de proteínas pré-sináptica

Aqui, descrevemos uma abordagem quantitativa para determinar a distribuição de uma proteína sináptica em relação uma proteína de marcador usando a mancha da imunofluorescência, microscopia confocal e análise baseada em computador.

Quantificar a distribuição heterogênea de uma proteína sináptica no cérebro do rato utilizando imunofluorescência

Apresentamos um protocolo para avaliar o equilíbrio entre liberação de glutamato e liberação em sinapses glutamatergicas corticostriatais únicas em fatias agudas de camundongos adultos. Este protocolo usa o sensor fluorescente iGluu para detecção de glutamato, uma câmera sCMOS para aquisição de sinal e um dispositivo para iluminação a laser focal.

Indicadores únicos de sinapse de liberação de glutamato e absorção em fatias cerebrais agudas de ratos normais e huntington

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

Aprenda o método DetectSyn para detectar alterações na densidade sináptica usando ensaio de ligação por proximidade em neurônios cultivados e tecido fixo. Esta técnica rápida e imparcial auxilia pesquisadores em neurociência.

DetectSyn: um método fluorescente rápido e imparcial para detectar alterações na densidade da sinapse

Explorar mais vídeos