Name: Isole RNAs específicos do tipo celular de amostras de tecido heterogêneo congeladas sem triagem celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprenda a isolar RNAs específicos de tipos celulares em tecidos heterogêneos congelados sem triagem celular, utilizando o modelo NuTRAP com pull-down de ribossomos. Este método permite estudar expressão gênica em células EGFP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo NIH R00HD082686. Agradecemos à Endocrine Society Summer Research Fellowship a H.S.Z. Também agradecemos ao Dr. Yuan Kang por criar e manter a colônia de ratos.

Todos os experimentos em animais realizados seguiram os protocolos aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Auburn.
NOTA: O protocolo a seguir usa um testículo (cerca de 100 mg) em P28 de Gli1-CreERT2; Camundongos NuTRAP (Mus musculus). Os volumes de reagentes podem precisar ser ajustados com base nos tipos de amostras e no número de tecidos.
1. Coleta de tecidos
<ol><li>Eutanasiar os ratos usando uma câmara de CO2 , higienizar a superfície do abdômen com etanol a 70%.</li>
	<li>Abra o abdômen inferior com uma tesoura e remova os testículos. Use nitrogênio líquido (LN2) para congelar os testículos imediatamente.</li>
	<li>Armazenar amostras na fase de vapor do LN2 até o uso.</li>
</ol>2. Preparação de reagentes e contas
<ol><li>Preparar a solução-mãe de homogeneização: Adicionar 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40 e 1 mg/mL de heparina. Conservar a solução a 4 °C até à utilização (até 1 mês).</li>
	<li>Preparar o tampão de trabalho de homogeneização da solução-mãe (passo 2.1) imediatamente antes da utilização: Adicionar TDT (concentração final: 1 mM), cicloheximida (concentração final: 100 μg/ml), ribonuclease recombinante (concentração final: 200 unidades/ml) e cocktail inibidor de protease (concentração final: 1x) à solução-mãe de homogeneização para obter a quantidade necessária do tampão de trabalho de homogeneização. Armazenar o tampão de trabalho recém-preparado no gelo até à utilização.</li>
	<li>Prepare os tampões de lavagem com baixo teor de sal e alto teor de sal:<ol><li>Para preparar tampão de lavagem com baixo teor de sal, misture 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl e 1% NP-40. Adicionar TDT (concentração final: 1 mM) e cicloheximida (concentração final: 100 μg/ml) antes de utilizar.</li>
		<li>Para preparar tampão de lavagem com alto teor de sal misture 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. Adicionar TDT (concentração final: 2 mM) e cicloheximida (concentração final: 100 μg/ml) antes de utilizar.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare as contas de proteína G (Tabela de Materiais):<ol><li>Cada amostra precisará de 50 μL de esferas de proteína G. Coloque a quantidade necessária de contas em um tubo de centrífuga de 1,5 mL e separe as contas da solução usando um rack magnético, deixando o tubo no rack por 30-60 s.</li>
		<li>Remova o sobrenadante por pipetagem. Lave as contas três vezes com 1 mL de tampão de lavagem gelado com baixo teor de sal de cada vez.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Lise tecidual e homogeneização
<ol><li>Adicionar 2 ml de tampão de trabalho de homogeneização gelado (preparado na hora a partir do passo 2.2) a um conjunto de moedores de tecido de vidro. Coloque rapidamente a amostra congelada no moedor e homogeneize o tecido com 30 golpes no gelo usando um pilão solto.</li>
	<li>Transferir o homogeneizado para um tubo de fundo redondo de 2 ml e centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 2 mL. Salve 100 μL em um tubo de 1,5 mL como a "entrada".</li>
	<li>Incubar o sobrenadante no tubo de 2 ml com o anticorpo anti-GFP (5 μg/ml; 1:400) a 4 °C num rotador end-over-end (24 rpm) durante a noite.</li>
</ol>4. Imunoprecipitação
<ol><li>Transfira a mistura homogeneizada/anticorpo para um novo tubo de fundo redondo de 2 ml contendo as esferas de proteína G lavadas a partir do passo 2.4. Incubar a 4 °C num rotador de ponta a ponta (24 rpm) durante 2 h.</li>
	<li>Separe as contas magnéticas do sobrenadante usando um rack magnético. Salve o sobrenadante como a "fração negativa". A fração negativa contém (1) RNAs em células EGFP-negativas e (2) RNAs em células EGFP-positivas que não estão ligadas aos ribossomos.</li>
	<li>Adicione 1 mL de tampão de lavagem com alto teor de sal às contas e faça um breve vórtice do tubo para lavar as contas. Coloque o tubo em um rack magnético.</li>
	<li>Remova o tampão de lavagem. Repita a etapa de lavagem mais duas vezes. As contas agora contêm o complexo de RNA de contas ribossomo-RNA de células positivas para EGFP.</li>
</ol>5. Extração de RNA
NOTA: As etapas a seguir são adaptadas do kit de isolamento de RNA (Tabela de Materiais). Trate cada fração (ou seja, entrada, positiva e negativa) como uma amostra independente e isole os RNAs de forma independente.
<ol><li>Incubar as esferas da etapa 4.4 com 50 μL de tampão de extração (do kit de isolamento de RNA) em um bifrutificador (42 °C, 500 rpm) por 30 min para liberar RNAs de contas.</li>
	<li>Separe as contas com um rack magnético, transfira o sobrenadante que contém o complexo contas-ribossomo-RNA para um tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 3000 x g durante 2 min e, em seguida, pipetar o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml. Este tubo contém a "fração positiva" da etapa TRAP. NOTA: Para a entrada e as frações negativas, extrair RNA de 25 μL de amostras usando 1 mL de tampão de extração. Incubar numa betoneira (42 °C, 500 rpm) durante 30 min.</li>
	<li>Pré-condicione a coluna de purificação de ARN: Pipeta 250 μL de tampão de condicionamento para a coluna de purificação. Incubar durante 5 min à temperatura ambiente (RT). Centrifugar a coluna a 16.000 x g durante 1 min.</li>
	<li>Pipetar volume igual de 70% de EtOH para o sobrenadante a partir do passo 5.3 (em torno de 50 μL de 70% de EtOH para a fração positiva e 1 mL de EtOH de 70% para a entrada e as frações negativas). Misture bem pipetando para cima e para baixo.</li>
	<li>Pipetar a mistura para a coluna a partir do passo 5.4.</li>
	<li>Centrifugar a coluna a 100 x g durante 2 min para permitir a ligação do ARN à membrana na coluna e, em seguida, continuar a centrifugar a 16.000 x g durante 30 s imediatamente. Descarte o fluxo. NOTA: Para a entrada e as fracções negativas, adicionar 250 μL da mistura à coluna de cada vez. Repetir os passos 5.6 e 5.7 até que todas as misturas sejam utilizadas.</li>
	<li>Pipetar 100 μL de tampão de lavagem 1 (W1) para a coluna e centrifugar a 8.000 x g durante 1 min. Descarte o fluxo.</li>
	<li>Pipeta 75 μL de solução de DNase misturada diretamente na membrana da coluna de purificação. Incubar no RT por 15 min.</li>
	<li>Pipetar 40 μL de W1 para a coluna e centrifugar a 8.000 x g durante 30 s. Descarte o fluxo.</li>
	<li>Pipetar 100 μL de tampão de lavagem 2 (W2) para a coluna e centrifugar a 8.000 x g durante 1 min. Descarte o fluxo.</li>
	<li>Pipetar 100 μL de W2 para a coluna e centrifugar a 16.000 x g durante 2 min. Descarte o fluxo. Recentrífuga da mesma coluna a 16.000 x g durante 1 min para remover todos os vestígios de tampão de lavagem antes da etapa de eluição.</li>
	<li>Transfira a coluna para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Pipetar 12 μL de água isenta de RNase directamente sobre a membrana da coluna de purificação. A ponta da pipeta não deve tocar a membrana. Incubar a RT durante 1 min e centrifugar a 1000 x g durante 1 min. Em seguida, continue a centrifugação a 16.000 x g por 1 min para eluir o RNA.</li>
</ol>6. Concentração e qualidade do RNA
<ol><li>Use um bioanalisador para avaliar a qualidade e a quantidade do RNA10 extraído.</li>
</ol>7. Armazenamento e análise posterior
<ol><li>Armazene o RNA a -80 °C (até 1 ano) até uma análise mais aprofundada (por exemplo, microarray, PCR quantitativa (qPCR) e RNA-seq, etc.). NOTA: Para obter detalhes da análise de qPCR, incluindo a síntese de cDNA, consulte Lyu et al.11. Os primers para qPCR estão listados na Tabela de Materiais.</li>
</ol>

<ol><li>Yang, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+RNA+sequencing+reveals+dynamic+regulation+of+myocardial+noncoding+RNAs+in+failing+human+heart+and+remodeling+with+mechanical+circulatory+support%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support.</a> Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).</li>
<li>Soumillon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+source+and+mechanisms+of+high+transcriptome+complexity+in+the+mammalian+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis.</a> Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li>
<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li>
<li>Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAP-rc%2C+translating+ribosome+affinity+purification+from+rare+cell+populations+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985(2015).</li>
<li>Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+ribosome+affinity+purification+%28trap%29+to+investigate+Arabidopsis+thaliana+root+development+at+a+cell+type-specific+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919(2020).</li>
<li>Moran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29+for+RNA+isolation+from+endothelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624(2019).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Varjosalo, M., Taipale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog%3A+functions+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog: functions and mechanisms.</a> Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).</li>
<li>Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+integrity+number+%28RIN%29-standardization+of+RNA+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Agilent+Technologies%22%5BJournal%5D)">RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control.</a> Agilent Technologies. , Application Note 1 1-8 (2004).</li>
<li>Lyu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+reveals+sub-zones+in+mouse+adrenal+zona+fasciculata+and+the+sexually+dimorphic+responses+to+thyroid+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone.</a> Endocrinology. 161 (9), (2020).</li>
<li>King, P., Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shh+signaling+regulates+adrenocortical+development+and+identifies+progenitors+of+steroidogenic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).</li>
<li>Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell+expansion+and+organ+size+of+mouse+adrenal+is+regulated+by+sonic+hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog.</a> Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).</li>
<li>Benton, L., Shan, L. -X., Hardy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+adult+Leydig+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of adult Leydig cells.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).</li>
<li>Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+11%CE%B2-hydroxysteroid+dehydrogenase.+Testicular+11%CE%B2-hydroxysteroid+dehydrogenase%3A+development+of+a+model+for+the+mediation+of+Leydig+cell+function+by+corticosteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids.</a> Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).</li>
<li>Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sertoli+cell+signaling+by+Desert+hedgehog+regulates+the+male+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline.</a> Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).</li>
<li>Beverdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9-dependent+expression+of+Gstm6+in+Sertoli+cells+during+testis+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice.</a> Reproduction. 137 (3), 481(2009).</li>
<li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+for+single-cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Technologies for single-cell isolation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
<li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+considerations+for+single-cell+rna+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108(2018).</li>
<li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+cell-specific+mouse+models+for+paired+epigenetic+and+transcriptomic+studies+of+microglia+and+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia.</a> Communications Biology. 3 (1), 693(2020).</li>
<li>Barsoum, I., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+and+differential+roles+of+transcription+factors+Gli1+and+Gli2+in+the+development+of+mouse+fetal+Leydig+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells.</a> Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).</li>
<li>Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+analysis+of+testicular+Leydig+cells+in+normal+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice.</a> The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

A utilidade da análise do transcriptoma de todo o tecido pode ser atenuada, especialmente quando se estuda tecidos heterogêneos complexos. Como obter RNAs específicos do tipo celular torna-se uma necessidade urgente para liberar a poderosa técnica de RNA-seq. O isolamento de RNAs específicos do tipo celular geralmente depende da coleta de um tipo específico de células usando micromanipulação, classificação celular ativada por fluorescência (FACS) ou microdissecção por captura a laser (LCM)18. Outr...

Abordagens de alto rendimento, incluindo sequenciamento de RNA (RNA-seq) e microarray, tornaram possível interrogar perfis de expressão gênica no nível de todo o genoma. Para tecidos complexos, como coração, cérebro e testículos, os dados específicos do tipo celular fornecerão mais detalhes comparando o uso de RNAs de todo o tecido 1,2,3. Para superar o impacto da heterogeneidade celular, o método Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) vem sendo desenvolvido desde o início da década de 20104. O TRAP é capaz de isolar RNAs ligados a ribossomos de tipos celulares específicos sem dissociação tecidual. Este método tem sido utilizado para análise de translatomos (mRNAs que estão sendo recrutados para o ribossomo para tradução) em diferentes organismos, incluindo a segmentação de uma população extremamente rara de células musculares em embriões de Drosophila5, o estudo de diferentes células radiculares na planta modelo Arabidopsis thaliana6 e a realização de análise de transcriptoma de células endoteliais em mamíferos7.
O TRAP requer uma modificação genética para marcar o ribossomo de um organismo modelo. Evan Rosen e seus colegas desenvolveram recentemente um modelo de rato chamado Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP)mouse 8, que está disponível no Jackson Laboratory desde 2017. Ao cruzar com uma linha de camundongo Cre, os pesquisadores podem usar este modelo de camundongo NuTRAP para isolar RNAs ligados a ribossomos e núcleos celulares de células que expressam Cre sem classificação celular. Em células que expressam Cre que também carregam o alelo NuTRAP , o ribossomo marcado com EGFP/L10a permite o isolamento de mRNAs de tradução usando ensaios pulldown de afinidade. Na mesma célula, a membrana nuclear marcada com peptídeo de reconhecimento de ligase de biotina (BLRP), que também é mCherry positivo, permite o isolamento nuclear usando purificação baseada em afinidade ou fluorescência. A mesma equipe de pesquisa também gerou uma linha de camundongo semelhante na qual a membrana nuclear é marcada apenas com mCherry sem biotina8. Essas duas linhagens de camundongos geneticamente modificados dão acesso para caracterizar perfis epigenômicos e transcriptômicos emparelhados de tipos específicos de células em interesse.
A via de sinalização do ouriço (Hh) desempenha um papel crítico no desenvolvimento tecidual9. GLI1, um membro da família GLI, atua como um ativador transcricional e medeia a sinalização Hh. As células Gli1+ podem ser encontradas em muitos órgãos secretores de hormônios, incluindo a glândula adrenal e o testículo. Para isolar DNAs e RNAs específicos do tipo celular de células Gli1+ usando o modelo de camundongo NuTRAP, camundongos Gli1-CreERT2 foram cruzados com os camundongos NuTRAP. Camundongos Shh-CreERT2 também foram cruzados com os camundongos NuTRAP com o objetivo de isolar células expressivas de ouriço sônico (Shh). O protocolo a seguir mostra como usar o Gli1-CreERT2; Camundongos NuTRAP para isolar RNAs ligados a ribossomos de células Gli1+ em testículos de camundongos adultos.

<table><tbody><tr><td>Actb</td><td>eurofins</td><td>qPCR primers</td><td>ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (primer direto / primer reverso)</td></tr> <tr><td>Bioanalisador</td> Instrumento de bioanalisador <td></td><td>Agilent</td><td>2100</td></tr><tr><td>Mini Inibidor de Protease sem EDTA Cocktail</td><td>Millipore</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>cicloheximida</td><td>Millipore</td><td>239764-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Cyp11a1</td><td>eurofins</td><td>qPCR primers</td><td>CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (primer direto/primer reverso)</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DTT, Ditiotreitol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 ímã</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>GFP anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de moedor de vidro</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>heparina</td><td>BEANTOWN CHEMICAL</td><td>139975-250MG</td><td></td></tr><<tr><td>em>Hsd3b</td><td>eurofins</td><td>qPCR primers</td><td>GACAGGAGCAGGAGGGTGTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (primer direto/primer reverso)</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Biosciences</td><td>R005</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosciences</td><td>R004</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga 2 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-707-354</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Clariom S Ensaio microarrays</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Microarray serviço</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Millipore</td><td>492018-50 Ml</td><td></td></tr><tr><td>oligo (dT)20</td><td>Kit</td> de isolamento de RNA <td>Invitrogen 18418020</td><td></td></tr><tr><td>PicoPure</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>Proteína G Dynabead</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>Células de crescimento de água sem RNase</td><td></td><td>NUPW-0500</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Inibidor de ribonuclease recombinante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Sox9</td><td>eurofins</td><td>qPCR primers</td><td>TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (primer direto/primer reverso</td></tr><tr><td>Superscript IV transcriptase reversa</td><td>Invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>Sycp3</td><td>eurofins</td><td>qPCR primers</td><td>GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (primário para a frente/primário para trás)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62848</td><td></td></tr></tbody></table>

isole rnas específicos do tipo celular de amostras de tecido heterogêneo congeladas sem triagem celular

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

A heterogeneidade celular coloca desafios para a compreensão da função de tecidos complexos em um nível de transcriptoma. O uso de RNAs específicos do tipo celular evita possíveis armadilhas causadas pela heterogeneidade dos tecidos e desencadeia a poderosa análise do transcriptoma. O protocolo descrito aqui demonstra como usar o método Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) para isolar RNAs ligados a ribossomos de uma pequena quantidade de células que expressam EGFP em um tecido complexo sem classificação celular. Este protocolo é adequado para isolar RNAs específicos do tipo celular usando o modelo de camundongo NuTRAP recentemente disponível e também pode ser usado para isolar RNAs de quaisquer células que expressem EGFP.

O rato Gli1-CreERT2 (Jackson Lab Stock Number: 007913) foi cruzado pela primeira vez com o rato repórter NuTRAP (Jackson Lab Stock Number: 029899) para gerar ratos com dupla mutação. Camundongos portadores de ambos os alelos genéticos geneticamente modificados (ou seja, Gli1-CreERT2 e NuTRAP) foram injetados com tamoxifeno uma vez por dia, a cada dois dias, para três injeções. As amostras de tecido foram coletadas no 7º dia após o1º dia da injeção. A ...

Este protocolo tem como objetivo isolar mRNAs ribossomais de tradução específicos do tipo celular usando o modelo de camundongo NuTRAP.

Isole RNAs específicos do tipo celular de amostras de tecido heterogêneo congeladas sem triagem celular

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

Este protocolo visa obter RNAs específicos de tipos celulares de alta qualidade a partir de um pequeno número de células em um tecido complexo sem classificação celular. Ele emprega um modelo de rato recentemente disponível que permite aos pesquisadores isolar um RNAs ligados ao ribossomo usando GLP pull down. O método também é adequado para isolar RNAs ligados a ribossomos de quaisquer células que expressem EGFP.Para começar, adicione dois mililitros de tampão de trabalho de homogeneização gelado a um conjunto de moedores de tecido de vidro. Coloque rapidamente a amostra congelada no moedor e homogeneize o tecido com 30 golpes no gelo usando um pilão solto. transferir o homogeneizado para um tubo de fundo redondo de dois mililitros e centrifugar a 12.000 g por 10 minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de dois mililitros sem perturbar o pellet, reservando 100 microlitros como entrada. Incubar o sobrenadante com o anticorpo anti-GFP a quatro graus Celsius em um rotador de extremidade sobre extremidade durante a noite. Transfira a mistura de homogeneizados e anticorpos para um novo tubo de fundo redondo de dois mililitros contendo grânulos de proteína g lavados e incubado quatro graus Celsius no rotador a 24 RPM por duas horas.Separe as contas magnéticas do sobrenadante usando um rack magnético. Salve o sobrenadante como a fração negativa que contém os RNAs em células negativas EGFP e os RNAs em células positivas EGFP que não estão ligadas a ribossomos. Adicione um mililitro de tampão de lavagem com alto teor de sal às contas e faça um breve vórtice do tubo para lavar as contas.Em seguida, coloque o tubo em um rack magnético. Remova o tampão de lavagem e repita as etapas de lavagem mais duas vezes para obter o complexo de RNA ribossomo de contas de células positivas para EGFP. Incubar as contas com 50 microlitros de tampão de extração do kit de isolamento de RNA em um ThermoMixer por 30 minutos para liberar RNAs das contas.Separe as contas com um rack magnético e transfira o sobrenadante para um tubo de 1,5 mililitro. Centrifugar o tubo a 3000 g durante dois minutos. Em seguida, pipete o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro.Para pré-condicionar a coluna de purificação de RNA, pipete 250 microlitros de tampão condicionante para a coluna de purificação e incube por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugar a coluna a 16 000 g durante um minuto. Pipetar um volume igual de etanol a 70% para o extracto da célula e misturar bem por pipetagem.Pipetar até 200 microlitros da mistura para a coluna de purificação de RNA pré-condicionada. Para reduzir a perda de amostras não encher a coluna mais de 80% da sua capacidade. Repita esta etapa várias vezes até que todos os RNAs sejam coletados na mesma coluna de cada fração.Centrifugar a coluna por dois minutos para ligar o RNA à membrana na coluna. Em seguida, continue a centrifugação por 30 segundos. Descarte o fluxo através e pipete 100 microlitros de tampão de lavagem um na coluna.Centrifugar por um minuto e, em seguida, descartar o fluxo. Pipeta 75 microlitros de solução de DNA misturam-se diretamente na membrana da coluna de purificação. Incubar à temperatura ambiente durante 15 minutos.Em seguida, pipete 40 microlitros de tampão de lavagem um na coluna e centrifugar por mais 30 segundos. Descarte o fluxo. Pipetar 100 microlitros de tampão de lavagem dois para a coluna e centrifugar a 8 000 g durante um minuto.Descarte o fluxo. Compre PET 100 microlitros de tampão de lavagem dois na coluna e centrífuga a 16.000 g por dois minutos. Descarte o fluxo e recentrifugar a mesma coluna a 16.000 g por um minuto para remover todos os vestígios de tampão de lavagem.Transfira a coluna para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. pipeta 12 microlitros de água livre de RNase diretamente na membrana da coluna de purificação, garantindo que a ponta da pipeta não toque na membrana. Incubar à temperatura ambiente durante um minuto e centrifugar a 1000 g durante um minuto.Em seguida, a 16.000 G por um minuto para eluir o RNA. Use um bioanalisador para avaliar a qualidade e a quantidade do RNA extraído. Armazene os RNAs em um freezer de 80 graus ou envie para uma análise mais aprofundada.Ratos portadores de ambos os alelos genéticos geneticamente modificados, Gli1-CreERT2 e NuTRAP, somos injetados com tamoxifeno uma vez por dia, a cada dois dias para três injeções. A análise de imunofluorescência dos tecidos coletados mostra que o EGFP foi expresso em células intersticiais nos testículos. O EGFP também foi encontrado em células capsulares adrenais em camundongos Gli1-CreERT2, NuTRAP.Em Sonic Hedgehog-CreERT2, camundongos NuTRAP A população de células positivas para EGFP reside no córtex externo da glândula adrenal sob a cápsula, confirmando a expressão de células pré-expressas de EGFP. Após a extração dos RNAs específicos do tipo celular, o RNA extraído foi enviado para análise de microarray. Os resultados mostraram que cerca de 3000 genes foram enriquecidos na fração positiva, em comparação com os genes na fração negativa, enquanto cerca de 4.000 genes foram enriquecidos na fração negativa.Dentre os genes diferenciais expressos, os genes associados às células de Leydig Hsd11b1 e Hsd3b6 foram enriquecidos na fração positiva. Na fração negativa, os genes associados à célula de Sertoli Ouriço do Deserto e Gstm6 foram enriquecidos. Apenas alguns genes diferencialmente expressos foram identificados na comparação da fração negativa com a entrada.RT-PCR quantitativo em tempo real foi utilizado para confirmar a expressão de genes-chave nas frações positiva e negativa. Semelhante ao que foi encontrado no ensaio de microarray, as enzimas esteroidogênicas 3-beta hidroxi esteroide desidrogenase e a enzima de clivagem da cadeia lateral do colesterol foram enriquecidas na fração positiva. Enquanto isso, o marcador de células de Sertoli SRY box transcription factor nine e o marcador de células germinativas synaptonemal complex protein three foram enriquecidos na fração negativa.Ao tentar este protocolo, é importante preparar o tampão de trabalho de homogeneização fresco Adicionar TDT, riboniceração recombinante ciclo-heximida e coquetel inibidor de proteinase à solução de estoque de homogeneização somente antes do uso. Também é importante preparar o baixo teor de sal fresco e os tampões de lavagem com alto teor de sal antes do uso.

isolate-cell-type-specific-rnas-from-snap-frozen-heterogeneous-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste artigo descrevemos um método simples para a colheita de células isoladas de ratos culturas primárias neuronais e análise de transcriptoma subsequentes usando a amplificação ARNA. Esta abordagem é generalizável a qualquer tipo de célula.

Análise do transcriptoma de uma única célula

Gene análise de um subconjunto de células num tecido específico de expressão representa um grande desafio. Este artigo descreve como isolar RNA total de alta qualidade a partir de uma população de células específicas, combinando um método rápido imunomarcação com captura a laser microdissection.

Isolamento de RNA celular subpopulações específicas Utilizando captura de Laser Microdissection combinada com o rápido immunolabeling

Aqui apresentamos um protocolo para microdissecção assistida por laser de tipos específicos de células vegetais para perfil transcricional. Embora o protocolo seja adequado para diferentes espécies e tipos de células, o foco está nas células altamente inacessíveis da linha germinativa feminina, importantes para a reprodução sexual e apomítica no gênero de crucíferas Boechera.

assistida por laser Microdissecção (LAM) como ferramenta para transcricional Profiling de tipos de células individuais

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar rapidamente núcleos de alta qualidade do tecido fresco ou congelado para a sequenciação do ARN maciçamente paralelo a jusante. Inclui opções de Lise rompimento e célula tecido detergente-mecânica e hipotônica-mecânico, ambos dos quais podem ser usados para isolamento dos núcleos.

Isolamento dos núcleos de adultos da medula espinhal para a sequenciação do ARN de Single-núcleo maciçamente paralelo

Este protocolo descreve o manual de procedimento para isolar o único neurônios fluorescente etiquetados seguidos em vitro baseada na transcrição de amplificação do mRNA para a sequenciação do ARN de alta profundidade única célula de triagem.

Sequenciação do ARN de célula única de neurônios fluorescente etiquetadas do Mouse usando a classificação Manual e duplo In Vitro a transcrição com contagens absolutas sequenciamento (DIVA-Seq)

Um protocolo da microdissecção da captação do laser (LCM) foi desenvolvido para obter a quantidade suficiente de RNA de alta qualidade para a análise da expressão de gene em pilhas de osso. O estudo atual centra-se em seções do fêmur do rato. Entretanto, o protocolo de LCM relatado aqui pode ser usado para estudar a expressão de gene nas pilhas de todo o tecido duro.

Um protocolo da microdissecção da captação do laser que rende o RNA da alta qualidade dos ossos frescos-congelados do rato

Esta publicação descreve um protocolo para o isolamento de núcleos de adipócitos maduros, purificação por classificação ativada por fluorescência e transcrição de nível unicelular.

Isolamento dos núcleos tecilódico adiposos para aplicações genômicas unicelulares

O isolamento de núcleos únicos depende da dissociação e da permeabilização baseada em detergente da membrana celular, passos que precisam de otimização e são propensos a introduzir artefatos técnicos. Demonstramos um protocolo detergente e sem enzimas para o rápido isolamento de núcleos intactos diretamente de todo o tecido, produzindo núcleos adequados para RNA-seq de núcleo único (snRNA-Seq) ou ATAC-seq.

Isolamento de núcleos de tecido inteiro usando um método detergente e sem enzimas

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar núcleos de tecidos hepáticos arquivados congelados por flash para RNA-seq, ATAC-seq de núcleo único e multiômica articular (RNA-seq e ATAC-seq).

Isolamento de núcleos de tecido hepático congelado por flash para multiômica unicelular

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo a preparação de núcleos celulares. Após microdissecção e dissociação enzimática do tecido cardíaco em células únicas, as células progenitoras foram congeladas, seguidas pelo isolamento de células viáveis puras, que foram usadas para sequenciamento de RNA de núcleo único e o ensaio de núcleo único para cromatina acessível à transposase com análises de sequenciamento de alto rendimento.

Isolamento de Núcleos de Células Progenitoras Cardíacas de Camundongos para Perfil de Epigenoma e Expressão Gênica em Resolução Unicelular

O estudo descreve um protocolo simples, rápido e parcialmente automatizado para isolar núcleos de alta qualidade de tecidos congelados de mamíferos para sequenciamento de RNA de núcleo único a jusante.

Um Protocolo Simples, Rápido e Parcialmente Automatizado para o Isolamento de Núcleos Únicos de Tecidos Congelados de Mamíferos para Sequenciamento de Núcleo Único

Aprenda a isolar RNAs específicos de tipos celulares em tecidos heterogêneos congelados sem triagem celular, utilizando o modelo NuTRAP com pull-down de ribossomos. Este método permite estudar expressão gênica em células EGFP.

Isole RNAs específicos do tipo celular de amostras de tecido heterogêneo congeladas sem triagem celular

Explorar mais vídeos