Isole RNAs específicos do tipo celular de amostras de tecido heterogêneo congeladas sem triagem celular
8 de dezembro de 2021
Este protocolo tem como objetivo isolar mRNAs ribossomais de tradução específicos do tipo celular usando o modelo de camundongo NuTRAP.
Este protocolo visa obter RNAs específicos de tipos celulares de alta qualidade a partir de um pequeno número de células em um tecido complexo sem classificação celular. Ele emprega um modelo de rato recentemente disponível que permite aos pesquisadores isolar um RNAs ligados ao ribossomo usando GLP pull down. O método também é adequado para isolar RNAs ligados a ribossomos de quaisquer células que expressem EGFP.
Para começar, adicione dois mililitros de tampão de trabalho de homogeneização gelado a um conjunto de moedores de tecido de vidro. Coloque rapidamente a amostra congelada no moedor e homogeneize o tecido com 30 golpes no gelo usando um pilão solto. transferir o homogeneizado para um tubo de fundo redondo de dois mililitros e centrifugar a 12.000 g por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Em seguida, transfira o sobrenadante para um novo tubo de dois mililitros sem perturbar o pellet, reservando 100 microlitros como entrada. Incubar o sobrenadante com o anticorpo anti-GFP a quatro graus Celsius em um rotador de extremidade sobre extremidade durante a noite. Transfira a mistura de homogeneizados e anticorpos para um novo tubo de fundo redondo de dois mililitros contendo grânulos de proteína g lavados e incubado quatro graus Celsius no rotador a 24 RPM por duas horas.
Separe as contas magnéticas do sobrenadante usando um rack magnético. Salve o sobrenadante como a fração negativa que contém os RNAs em células negativas EGFP e os RNAs em células positivas EGFP que não estão ligadas a ribossomos. Adicione um mililitro de tampão de lavagem com alto teor de sal às contas e faça um breve vórtice do tubo para lavar as contas.
Em seguida, coloque o tubo em um rack magnético. Remova o tampão de lavagem e repita as etapas de lavagem mais duas vezes para obter o complexo de RNA ribossomo de contas de células positivas para EGFP. Incubar as contas com 50 microlitros de tampão de extração do kit de isolamento de RNA em um ThermoMixer por 30 minutos para liberar RNAs das contas.
Separe as contas com um rack magnético e transfira o sobrenadante para um tubo de 1,5 mililitro. Centrifugar o tubo a 3000 g durante dois minutos. Em seguida, pipete o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mililitro.
Para pré-condicionar a coluna de purificação de RNA, pipete 250 microlitros de tampão condicionante para a coluna de purificação e incube por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, centrifugar a coluna a 16 000 g durante um minuto. Pipetar um volume igual de etanol a 70% para o extracto da célula e misturar bem por pipetagem.
Pipetar até 200 microlitros da mistura para a coluna de purificação de RNA pré-condicionada. Para reduzir a perda de amostras não encher a coluna mais de 80% da sua capacidade. Repita esta etapa várias vezes até que todos os RNAs sejam coletados na mesma coluna de cada fração.
Centrifugar a coluna por dois minutos para ligar o RNA à membrana na coluna. Em seguida, continue a centrifugação por 30 segundos. Descarte o fluxo através e pipete 100 microlitros de tampão de lavagem um na coluna.
Centrifugar por um minuto e, em seguida, descartar o fluxo. Pipeta 75 microlitros de solução de DNA misturam-se diretamente na membrana da coluna de purificação. Incubar à temperatura ambiente durante 15 minutos.
Em seguida, pipete 40 microlitros de tampão de lavagem um na coluna e centrifugar por mais 30 segundos. Descarte o fluxo. Pipetar 100 microlitros de tampão de lavagem dois para a coluna e centrifugar a 8 000 g durante um minuto.
Descarte o fluxo. Compre PET 100 microlitros de tampão de lavagem dois na coluna e centrífuga a 16.000 g por dois minutos. Descarte o fluxo e recentrifugar a mesma coluna a 16.000 g por um minuto para remover todos os vestígios de tampão de lavagem.
Transfira a coluna para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. pipeta 12 microlitros de água livre de RNase diretamente na membrana da coluna de purificação, garantindo que a ponta da pipeta não toque na membrana. Incubar à temperatura ambiente durante um minuto e centrifugar a 1000 g durante um minuto.
Em seguida, a 16.000 G por um minuto para eluir o RNA. Use um bioanalisador para avaliar a qualidade e a quantidade do RNA extraído. Armazene os RNAs em um freezer de 80 graus ou envie para uma análise mais aprofundada.
Ratos portadores de ambos os alelos genéticos geneticamente modificados, Gli1-CreERT2 e NuTRAP, somos injetados com tamoxifeno uma vez por dia, a cada dois dias para três injeções. A análise de imunofluorescência dos tecidos coletados mostra que o EGFP foi expresso em células intersticiais nos testículos. O EGFP também foi encontrado em células capsulares adrenais em camundongos Gli1-CreERT2, NuTRAP.
Em Sonic Hedgehog-CreERT2, camundongos NuTRAP A população de células positivas para EGFP reside no córtex externo da glândula adrenal sob a cápsula, confirmando a expressão de células pré-expressas de EGFP. Após a extração dos RNAs específicos do tipo celular, o RNA extraído foi enviado para análise de microarray. Os resultados mostraram que cerca de 3000 genes foram enriquecidos na fração positiva, em comparação com os genes na fração negativa, enquanto cerca de 4.000 genes foram enriquecidos na fração negativa.
Dentre os genes diferenciais expressos, os genes associados às células de Leydig Hsd11b1 e Hsd3b6 foram enriquecidos na fração positiva. Na fração negativa, os genes associados à célula de Sertoli Ouriço do Deserto e Gstm6 foram enriquecidos. Apenas alguns genes diferencialmente expressos foram identificados na comparação da fração negativa com a entrada.
RT-PCR quantitativo em tempo real foi utilizado para confirmar a expressão de genes-chave nas frações positiva e negativa. Semelhante ao que foi encontrado no ensaio de microarray, as enzimas esteroidogênicas 3-beta hidroxi esteroide desidrogenase e a enzima de clivagem da cadeia lateral do colesterol foram enriquecidas na fração positiva. Enquanto isso, o marcador de células de Sertoli SRY box transcription factor nine e o marcador de células germinativas synaptonemal complex protein three foram enriquecidos na fração negativa.
Ao tentar este protocolo, é importante preparar o tampão de trabalho de homogeneização fresco Adicionar TDT, riboniceração recombinante ciclo-heximida e coquetel inibidor de proteinase à solução de estoque de homogeneização somente antes do uso. Também é importante preparar o baixo teor de sal fresco e os tampões de lavagem com alto teor de sal antes do uso.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para isolar mRNAs ribossomais específicos de tipos celulares utilizando o modelo de camundongo NuTRAP, permitindo a extração de RNAs de alta qualidade de pequenas populações celulares sem a necessidade de separação celular. O método é particularmente útil para estudar células que expressam EGFP e identificar genes diferencialmente expressos associados a tipos celulares específicos.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Biologia celular
- Biologia molecular
Antecedentes
- O modelo de camundongo NuTRAP permite o isolamento de RNA ligado aos ribossomos.
- Essa abordagem evita as complicações da separação celular em tecidos heterogêneos.
Métodos Utilizados
- Co-precipitação com GLP para isolamento de RNA ligado ao ribossomo
- Modelo de camundongo NuTRAP
- Análise por microarranjo e RT-PCR para validação da expressão gênica
Resultados Principais
- Aproximadamente 3000 genes foram enriquecidos na fração positiva de RNA, enquanto 4000 genes foram enriquecidos na fração negativa.
- Genes específicos relacionados às células de Leydig e às células de Sertoli foram identificados nas respectivas frações de RNA.
- Genes de enzimas-chave mostraram enriquecimento compatível com os achados da microarray.
Conclusões
- O estudo demonstra um método confiável para o isolamento de RNAs específicos de tipos celulares.
- Os resultados contribuem para a compreensão da expressão gênica em tipos celulares testiculares distintos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de RNAs específicos de tipos celulares a partir de tecidos heterogêneos sem a separação celular aborda um desafio fundamental na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas. O método NuTRAP baseado em TRAP permite o perfilamento transcritômico reprodutível e quantitativo de populações celulares definidas, proporcionando confiança preditiva no estágio inicial de descoberta. Essa abordagem reduz o ruído biológico e melhora a continuidade translacional da descoberta até a validação pré-clínica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas em tipos celulares específicos dentro de tecidos complexos.
- Valor Operacional: Evita artefatos decorrentes da separação celular, preservando os estados nativos de RNA para validação confiável de alvos.
- Valor Preditivo: Apoia a descoberta de biomarcadores e a elucidação de vias em sistemas relevantes para doenças.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera entradas padronizadas de RNA ligado a ribossomos para o desenvolvimento de ensaios subsequentes.
- Valor Operacional: Fornece saídas reprodutíveis e quantitativas adequadas para prontidão em triagem de alto rendimento.
- Escalabilidade: Compatível com material inicial limitado, permitindo reutilização em múltiplos modelos que expressam EGFP.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a relevância para a doença ao capturar transcriptomas específicos de tipos celulares a partir de contextos teciduais nativos.
- Valor Operacional: Fornece continuidade do estágio de descoberta até a validação pré-clínica, utilizando uma lógica consistente de isolamento de RNA.
- Redução de Riscos: Reduz a ambiguidade mecanicista nos resultados do engajamento de alvos e nos ensaios fenotípicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a identificação do alvo até a otimização do composto inicial, especialmente quando a resolução por tipo celular é fundamental para uma compreensão mecanicista. Ele permite a verificação de hipóteses e a redução de riscos biológicos antes das campanhas de triagem de compostos.
- Biologia da Descoberta: Permite testes de hipóteses precisos em tecidos heterogêneos mediante o isolamento de RNAs em tradução de populações celulares definidas.
- Triagem: Gera pools padronizados de RNA associado a ribossomos, adequados para validação de ensaios e testes de reprodutibilidade.
- Análises: Fornece dados quantitativos de expressão gênica (por exemplo, microarranjos, RT-PCR) que permitem comparação entre condições e priorização de alvos.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais ao trabalho pré-clínico, preservando sinais específicos de tipo celular em órgãos complexos como testículo e glândula adrenal.
- Reutilização Empresarial: Adaptável a múltiplas linhagens com promotor Cre e NuTRAP, posicionando-se como uma plataforma escalável para análises ômicas específicas de tipo celular.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos ao reduzir sinais confundidores provenientes de tecidos heterogêneos.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e padronização entre laboratórios por meio de etapas padronizadas de lise, IP e recuperação de RNA.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de avançar/não avançar ao fornecer dados transcriptômicos mais limpos e interpretáveis para triagem de portfólio.
- Impacto no Portfólio: Permite o avanço ajustado ao risco ao isolar sinais verdadeiramente específicos de tipo celular, reduzindo falsos positivos na validação subsequente.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em manipulação de tecidos, imunoprecipitação e técnicas de preservação de RNA.
- Depende do acesso a suportes magnéticos, ThermoMixers, centrífugas e colunas de purificação de RNA.
- Necessita da preparação padronizada de tampões (homogeneização, lavagem, eluição) frescos antes do uso para prevenir a atividade de RNase.
- As considerações para adaptação incluem a validação dos níveis de expressão de EGFP e da eficiência de ligação ao ribossomo em novos modelos com promotor Cre.
- As limitações práticas incluem restrições na quantidade de tecido de entrada e a necessidade de concentrações otimizadas de anticorpos e microesferas.
