Melanogaster drosophila Protocolo de injeção de larvas
19 de outubro de 2021
As moscas adultas de Drosophila melanogaster têm sido amplamente utilizadas como organismos modelo para investigar os mecanismos moleculares subjacentes às respostas imunes inatas antimicrobianas e estratégias de infecção microbiana. Para promover o estágio da larva D. melanogaster como um sistema modelo adicional ou alternativo, uma técnica de injeção larval é descrita.
Este protocolo aborda as dificuldades e desafios com a larva de microinjeção, descrevendo um método preciso que permitirá o uso da larva de melanogaster Drosophila como modelo para vários estudos imunológicos e moleculares. Esta é uma técnica de injeção simples que apresenta um método eficiente, econômico e rápido para fornecer repetidamente uma variedade de substâncias de forma uniforme, o que permite resultados consistentes e confiáveis. Comece selecionando o terceiro estágio instar larvas e lavando-as com a solução de Ringer em uma pequena placa de Petri.
Coloque um papel filtro em uma placa de Petri e umedeça-o com 5 ml de solução ringer. Em seguida, coloque as larvas no papel do filtro. Prepare os capilares usando tubos capilares de vidro de 3,5"em um puxador de micropipette.
Abra o capilar de vidro com a ajuda de fórceps de ponto médio serrilhados retos. Encha o capilar aberto com óleo mineral usando uma seringa descartável de plástico. Em seguida, ejete o óleo para fora do tubo capilar com um injetor nanoliter.
Encha o capilar com a preparação bacteriana desejada para injeção. Transfira as larvas anestesiadas para um papel filtro umedecido com a solução de Ringer. Usando fórceps, aplique pressão firme no lado dorsal da extremidade posterior das larvas, onde os espirros traqueais são aparentes.
Em seguida, insira a agulha horizontalmente, na extremidade posterior das larvas, e injete os estoques bacterianos. Remova as fórceps para evitar derramamento de hemoglifo ou intestino. Em seguida, retire a agulha previamente inserida em larvas.
Infecte 20 larvas para cada condição experimental. Usando um pincel, transfira suavemente as larvas injetadas para um papel filtro úmido separado. Adicione a solução do Ringer conforme necessário para evitar a dessacação.
Incubar a placa de Petri em uma incubadora a 25 C.Drosophila melanogaster larvas infectadas com Fotorhabdus asymbiotica exibiu uma taxa de sobrevivência de 57% durante 24 horas após a injeção, enquanto larva injetada com Escherichia coli mostrou uma taxa de sobrevivência de 85% ao mesmo tempo. A importância deste método é que a agulha é mantida aproximadamente paralela à larva. A pressão aplicada para segurar a larva é muito pequena, o que reduz a possibilidade de vazamento hemoglifo, ferimento fatal ou entrega inadequada da substância desejada.
Esta técnica pode ser aperfeiçoada com prática.
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Visão Geral
Este protocolo descreve uma técnica de injeção em larvas de Drosophila melanogaster, destinada a facilitar o uso de larvas em estudos imunológicos e moleculares. O método aborda os desafios da microinjeção em larvas e fornece uma abordagem confiável para a administração de substâncias.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Microbiologia
- Imunologia
Contexto
- Drosophila melanogaster é um organismo modelo amplamente utilizado.
- Compreender as respostas imunes inatas antimicrobianas é crucial.
- Os estágios larvais oferecem insights adicionais sobre estratégias de infecção microbiana.
- As técnicas de microinjeção são essenciais para a consistência experimental.
Objetivo do Estudo
- Promover larvas de D. melanogaster como um sistema modelo.
- Fornecer um método detalhado para microinjeção em larvas.
- Aprimorar a confiabilidade de estudos imunológicos e moleculares.
Métodos Utilizados
- Selecione larvas de terceiro estágio para injeção.
- Lave as larvas com solução de Ringer.
- Prepare capilares utilizando tubos capilares de vidro.
- Injecte substâncias de forma uniforme nas larvas.
Resultados Principais
- A técnica permite a entrega eficiente de substâncias.
- Os resultados são consistentes e confiáveis entre experimentos.
- Método econômico adequado para diversos estudos.
- Facilita a exploração das respostas imunológicas em larvas.
Conclusões
- A técnica de injeção em larvas é uma ferramenta valiosa para pesquisadores.
- Ela amplia a utilidade de D. melanogaster em estudos científicos.
- Pesquisas futuras podem aproveitar este método para obter insights mais profundos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
As larvas de Drosophila melanogaster oferecem um modelo genéticamente acessível e de baixo custo para o estudo da imunidade inata e das interações entre hospedeiro e patógeno, permitindo a validação precoce de alvos com menor impacto ético e financeiro. O protocolo de injeção em larvas melhora a reprodutibilidade em ensaios de resposta imune, apoiando a desmistificação mecanicista de candidatos antimicrobianos e imunomoduladores. Essa abordagem conecta a biologia de descoberta com a avaliação pré-clínica, fornecendo desfechos quantificáveis de sobrevivência e infecção em um sistema relevante para a doença.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas a vias imunes inatas e mecanismos de virulência.
- Valor Operacional: Oferece um sistema escalonável para validação funcional de alvos utilizando modelos de desafio microbiano.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao gerar dados quantitativos de infecção e sobrevivência para avaliação de compostos líderes.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Fornece procedimentos padronizados de preparação e injeção de larvas para exposição consistente a substâncias.
- Saída Quantitativa: Permite a medição de taxas de sobrevivência e carga de patógenos como variáveis dependentes em campanhas de triagem.
- Reprodutibilidade: Reduz a variabilidade técnica por meio de mecanismos de injeção controlados e condições ambientais padronizadas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela respostas imunes inatas relevantes ao ser humano frente a patógenos bacterianos como Photorhabdus asymbiotica e Escherichia coli.
- Continuidade Tradutiva: Facilita a progressão da validação de alvos promissores até testes de eficácia pré-clínicos em um contexto de organismo inteiro.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Esclarece as vias de defesa do hospedeiro e as contribuições dos fatores de virulência antes dos estudos em mamíferos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método de injeção em larvas insere-se na fase inicial de descoberta, apoiando a validação de alvos orientada por hipóteses e permitindo formatos de ensaio reprodutíveis para triagem de compostos antes da otimização do composto líder.
- Biologia da Descoberta: Apoia a validação funcional de alvos relacionados ao sistema imunológico por meio de desafio controlado com patógenos em larvas.
- Triagem: Gera dados de resposta à dose e de sobrevivência adequados para triagem de alto conteúdo de agentes imunomoduladores ou antimicrobianos.
- Análises: Fornece métricas quantitativas de sobrevivência (por exemplo, taxas de sobrevivência em 24 horas) que permitem comparação entre diferentes condições experimentais e tratamentos.
- Pesquisa Translacional: Estabelece um sistema relevante para doenças, útil para avaliar o impacto terapêutico sobre os desfechos de infecção antes da progressão para modelos em roedores.
- Reutilização Empresarial: Representa uma plataforma padronizada e de baixo custo, aplicável em múltiplos projetos de pesquisa em imunologia e doenças infecciosas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas interações hospedeiro-patógeno.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade e padronização entre laboratórios por meio de parâmetros definidos de injeção e controles ambientais.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência das decisões de avanço ou interrupção ao fornecer sinais precoces de eficácia e toxicidade em um modelo de animal inteiro.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com base em dados de sobrevivência e eliminação da infecção.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em manipulação de larvas, anestesia e técnicas de microinjeção.
- Depende do acesso a puxadores de micropipetas, injetores de nanolitros e ferramentas para preparação de capilares de vidro.
- Necessita da preparação padronizada de solução de Ringer e incubação em ambiente controlado a 25°C para resultados consistentes.
- Envolve considerações de adaptação ao testar diferentes cepas microbianas ou viscosidades de substâncias.
- Limitado pelo tamanho das larvas e pelas restrições de volume de injeção, o que pode restringir a administração de moléculas grandes ou partículas.
