Name: Ex Vivo Perfusão hepática através do Portal Veia em Rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Aprenda a técnica de perfusão hepática ex vivo pela veia porta em ratos para estudos metabólicos em tempo real. Este método permite controlar nutrientes e hormônios, auxiliando na pesquisa de doenças como diabetes, NAFLD e NASH.

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Este trabalho foi apoiado por financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (R01-DK105346, P41-GM122698, 5U2C-DK119889). Uma parte deste trabalho foi realizada no McKnight Brain Institute no National High Magnetic Laboratory's Advanced Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy Facility (AMRIS), que é apoiado pelo National Science Foundation Cooperative Agreement No. DMR-1644779 e o Estado da Flórida.

Experimentos envolvendo camundongos foram tratados em conformidade com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Flórida (número de protocolo #201909320). A cepa do mouse utilizada foi C57BL/6J; todos os ratos eram machos. Este método é geralmente aplicável para estudos usando outras cepas de rato padrão também. Esta cirurgia é realizada de forma ideal por dois indivíduos que trabalham juntos.
1. Configuração inicial
<ol><li>Fígados perfusos com perfusato contendo eletrólitos Krebs-Henseleit6(25 mM NaHCO3, 112 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM cada um de MgSO4, KH2PO4, e 0,5 mM de sódio-EDTA, 1,25 mM CaCl2), 6 mM de lactato de sódio, 0,6 mM piruvato de sódio, 0,2 mM [U-13C] propionato de sódio, 10% (v/v) D2O, e ácidos graxos mistos de 0,63 mM (contendo ácido palmítico (22,1% do total), ácido palmitoleico (5,2%), ácido esteárico (2,7%), ácido oleico (27%), ácido linoleico (37,7%), ácido γ-linolenic (2,4%) e ácido decosahexanoico (2,8%)) juntamente com 2% (w/v) albumina de soro bovino. Defina o pH final de perfusato para 7,3 usando HCl (e NaOH, se necessário).</li>
</ol>2. Configuração pré-cirurgia
<ol><li>Monte duas seringas de 1 mL com uma agulha 23G de 19,05 mm de comprimento. Encha uma seringa com 0,01 mL de heparina de 1000 unidades/mL e 0,19 mL de soro fisiológico (0,9% (w/v) NaCl na água; Tabela 1).</li>
	<li>Encha a segunda seringa com 0,2 mL de lidocaína de 2% e 0,6 mL de soro fisiológico (Tabela 1). Em outra seringa de 1 mL com agulha de 27 G 38,1 mm, encha com o perfusado e mantenha a 37 °C.</li>
</ol>3. Configuração da coluna perfusate
<ol><li>Coloque a garrafa de vidro contendo 500 mL de perfusato no banho de água (Figura 1B). Ligue o banho de água e afina a temperatura para ~42 °C. A temperatura mais alta no banho de água permite manter 37 °C na coluna de perfusão.</li>
	<li>Uma vez que a água aqueça até 42 °C, ligue as duas bombas para circular o perfusato da garrafa ao longo do oxigenador de filme fino e da coluna de vidro de 100 cm coberta de água (Figura 1A-E).</li>
	<li>Ligue o gás oxigenante (95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono) para pressurizar o oxigenador7 (Figura 1C). Ajuste a altura da coluna perfusa para atingir uma taxa de fluxo de 8 mL/min com o cateter ligado (ver etapa 9 para medição da taxa de fluxo)5,8,9. NOTA: A taxa de fluxo refere-se à taxa em que o perfusato está sendo expelido pelo fígado.</li>
</ol>4. Anesthetização do mouse
<ol><li>Don PPE conforme exigido pelo protocolo IACUC e outras diretrizes de segurança apropriadas. NOTA: As seguintes etapas foram otimizadas para ratos com idades entre 9 e 13 semanas.</li>
	<li>Coloque o rato na câmara isoflurane. Transforme o gás de entrega em 100% oxigênio, uma taxa de fluxo de 1 L/min, e o isoflurane para 2%10. Espere até que a respiração desacelere e esteja estável. NOTA: Para que o camundongo atinja um plano cirúrgico estável, como evidenciado por uma taxa respiratória lenta e constante e falta de reflexo de beliscão do dedo do pé, a taxa de fluxo de oxigênio pode ser ajustada para ~1,5 L/min a ~3 L/min e a concentração de isoflurane de 1 a 3%. A taxa de entrega de gás transportador e concentração de isoflurane depende da idade e peso do animal e fatores como ruído e luz.</li>
	<li>Desinfete o abdômen com 70% de álcool. Administre a heparina através de uma injeção subcutânea profunda na camada de gordura abdominal (Figura 2). Coloque o rato de volta na câmara de anestesia por 10 minutos. NOTA: A depilação não é necessária, pois este procedimento é terminal.</li>
</ol>5. Céliotomia
<ol><li>Transfira o rato da câmara de anestesia para a plataforma de cirurgia e coloque-o na posição supina (Figura 3).</li>
	<li>Coloque o nariz do mouse em um cone de nariz e tape as patas para baixo. Tome cuidado para não aplicar qualquer tensão no pescoço que possa levar a sufocamento.</li>
	<li>Administrar lidocaína através de uma injeção subcutânea bilateralmente na região da crista ilíaca anterior11 (Figura 3). Realize um teste de beliscar o dedo do pé para confirmar a ausência de todos os reflexos da dor.</li>
	<li>Realizar céliotomia para expor os órgãos internos (Figura 4). Faça uma incisão de 3 cm de largura (a largura de todo o abdômen do mouse). NOTA: A largura mudará com a idade e a dieta do mouse.</li>
	<li>Expanda a incisão usando um hemostat que puxa a tração apertando o processo xifoide (Figura 4).</li>
</ol>6. Cannulação da veia portal
<ol><li>Use um aplicador de ponta de algodão para limpar os intestinos pequenos e grandes que cobrem a veia portal. Posicione uma sutura de seda sob o arco da veia portal proximal ao fígado (Figura 4A).</li>
	<li>Dependendo da estrutura anatômica, coloque a segunda sutura de seda proximal ou distal da veia mesentérica inferior distal do fígado (Figura 4A)12,13. Use uma sutura 2-0 para ambas as suturas.</li>
	<li>Uma vez que as suturas estejam no lugar, cannulate a veia portal com um cateter 22G14 (Figura 4B). Ao inserir o cateter, mantenha o bisel apontado para cima. Digite a veia do portal em não mais do que um ângulo de 15°.</li>
	<li>Amarre a primeira sutura após o batedor do cateter. Após a veia do portal ser cânulada, ancorra o cateter 2-3 mm distal do ramo da veia portal com a sutura de seda (Figura 4B). NOTA: O assistente deve rolar ombros e pulsos para evitar desalojar o cateter ou rasgar a veia do portal. Cada sutura requer dois nós.</li>
	<li>Em seguida, fixe a porção inferior do cateter com a segunda sutura. Com a ajuda do assistente cirúrgico, amarre um nó com a sutura para fixar o cateter à porção distal da veia portal e do tecido circundante.</li>
</ol>7. Ressecção da cannulação venosa do porta-cabeça do porta-fígado
<ol><li>Depois que o cateter estiver preso, insira uma seringa de 1 mL com uma agulha 27G que tem 38,1 mm de comprimento no cateter para lavar sangue e bolhas de ar. NOTA: Geralmente há um fluxo de sangue fora do cateter da pressão.</li>
	<li>Use um tubo de silicone O.D. de 1 mm x 5 mm com uma torneira fixa para acoplar a coluna de perfusão (Figura 1A) ao cateter permitindo o fluxo do tampão para o fígado marcando o início da perfusão. Inicie um temporizador neste momento para marcar o início da perfusão.</li>
	<li>Alivie o aumento da pressão vascular fazendo uma incisão, usando uma tesoura, na veia cava inferior.</li>
	<li>Confirme o fluxo de perfusato através do fígado observando a mudança homogênea na cor do fígado de rosa/vermelho para um amarelo pálido. Uma vez confirmado o fluxo, extir nosso estômago, intestino delgado, intestino grosso e o rim direito do tecido circundante.</li>
	<li>Com a ajuda do assistente cirúrgico, manole o fígado ao redor da cavidade abdominal e torácica enquanto o cirurgião corta o peritônio parietal e tecido torácico para ressecar o fígado</li>
	<li>Por último, levante o fígado para cima e corte os tecidos conjuntivos restantes segurando o fígado no lugar com uma tesoura. Manipular lentamente o fígado para facilitar a visão. Remova qualquer pele que grude no fígado enxaguando com perfusato antes de encapsá-lo dentro do tubo NMR. NOTA: Neste procedimento, apenas o fígado é removido. Todos os outros órgãos são deixados no corpo do animal. O ducto biliar pode ser removido com base no protocolo do experimento. Embora para este experimento, foi deixado no lugar.</li>
</ol>8. Pendurando o fígado da coluna
<ol><li>Uma vez que o cirurgião entrega o fígado e a tubulação ao assistente, o assistente desconecta a tubulação do cateter e da coluna.</li>
	<li>Encha o cateter com perfusato até que um menisco seja formado na parte superior do cateter. Coloque o cateter na coluna para que o fígado fique pendurado e perusada. NOTA: A conta de perfusato no cateter fornece volume suficiente para o fígado funcionar até que esteja conectado. O cateter ligado ao fígado é pressionado na parte inferior da coluna.</li>
	<li>Enrosque um tubo de 20 mm de RMN na coluna de vidro de 100 cm para encapsular o fígado (Figura 5). Para evitar a torção do fígado e da veia portal, aparafusar lentamente o tubo NMR. Se a torção ocorrer e o fluxo for interrompido, desaparafusar e resempar o tubo NMR. Isso vai remediar a oclusão e o fluxo retornará.</li>
	<li>Perfunda o fígado por 30-60 min com base nos detalhes do estudo. NOTA: O tempo é baseado no experimento de perfusão. Para este experimento, o volume de negócios metabólico foi medido dentro de 30 minutos. A perfusão hepática pode levar até 10 minutos para chegar a um estado estável. O tempo para o estado estável começa uma vez que a veia cava inferior foi cortada e o fluxo hepático é estabelecido.</li>
</ol>9. Medição de fluxo
<ol><li>Coloque um barco de pesagem em um equilíbrio de carga superior e zero o equilíbrio. Coloque a tubulação da bomba de rolo puxando perfusato eferente do NMR para o barco de pesagem e inicie o temporizador.</li>
	<li>Pesar a massa de líquido acumulada ao longo de 1 min, o que produz a vazão do fígado. Coloque o tubo de volta no recipiente de resíduos/coletas.</li>
</ol>10. Medição de oxigênio
NOTA: As medições do medidor de oxigênio foram configuradas de acordo com as instruções do fabricante15.
<ol><li>Coloque o eletrodo contendo 20 μL de solução saturada de 50% KCl na cúpula de platina e coloque cinco gotas de 10 μL ao redor do anel de platina inferior do eletrodo.</li>
	<li>Remova o adesivo do papel do cigarro. Coloque um pedaço de membrana de politetrafluoroetileno sobre o papel do cigarro.</li>
	<li>Coloque as duas peças em cima do eletrodo. Coloque um pequeno o-ring ao redor do topo do eletrodo. Corte o papel para colocar o anel de platina inferior no eletrodo. NOTA: Alguma saliência é aceitável. É essencial cobrir a prata do eletrodo.</li>
	<li>Coloque o o-ring maior no eletrodo. Junte o eletrodo à câmara de água e aperte a base para manter o eletrodo no lugar. Ligue o banho de água e deixe aquecer até 37 °C.</li>
	<li>Abra o software do medidor de oxigênio. Clique em Calibrar > água saturada de ar. Coloque a velocidade do agitador para 75 e a temperatura a 37 °C.</li>
	<li>Encha um frasco de 50 mL no meio do caminho com água e agite vigorosamente por 2 minutos. Esta é a água saturada de ar, use-a como 100% padrão. Encha a câmara do medidor de oxigênio com ~2 mL de água e coloque a rolha de duas peças.</li>
	<li>Clique em Ok na tela e deixe o sinal para planar. Uma vez que o sinal tenha atingido um platô, clique em Ok. Descarte o líquido na câmara e seque com papel de tecido.</li>
	<li>Repetição de passos 10.6-10.7 mas com sulfito de sódio de 200 mM (padrão de 0%). Clique em Salvar calibração. NOTA: Não é necessário tremer vigorosamente para o padrão de 0%.</li>
	<li>Durante a perfusão, use duas seringas de 5 mL. Uma seringa para circulação perfusada (oxigênio em) e a segunda para perfusato eferente do tubo NMR (saída de oxigênio).</li>
	<li>Ao elaborar o perfusato para as medidas de dentro e para fora, desenhe 3-4 mL cada vez. NOTA: Esta coluna tem tubos de vidro para permitir o acesso ao tubo NMR para retirar o perfusato que fluiu através do fígado.</li>
	<li>Meça o perfusato circulante, primeiro assim como a água na etapa 10.6 e descarte na etapa 10.7. Repita os mesmos passos para o perfusato eferente.</li>
	<li>Realize medições de oxigênio a cada 10 minutos.</li>
</ol>

<ol><li>Ragavan, M., McLeod, M. A., Giacalone, A. G., Merritt, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+Dihydroxyacetone+Is+a+Sensitive+Probe+of+Hepatic+Gluconeogenic+State%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized Dihydroxyacetone Is a Sensitive Probe of Hepatic Gluconeogenic State.</a> Metabolites. 11 (7), 441(2021).</li>
<li>Lumata, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+%2813%29C+Magnetic+Resonance+and+Its+Use+in+Metabolic+Assessment+of+Cultured+Cells+and+Perfused+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized (13)C Magnetic Resonance and Its Use in Metabolic Assessment of Cultured Cells and Perfused Organs.</a> Methods in Enzymology. 561, 561-573 (2015).</li>
<li>Moreno, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+detection+of+hepatic+gluconeogenic+and+glycogenolytic+states+using+hyperpolarized+%5B2-13C%5D+dihydroxyacetone%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time detection of hepatic gluconeogenic and glycogenolytic states using hyperpolarized [2-13C] dihydroxyacetone.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35859-35867 (2014).</li>
<li>Moreno, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperpolarized+%CE%B4-%5B1-13C%5D+gluconolactone+as+a+probe+of+the+pentose+phosphate+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+in+Biomedicine%22%5BJournal%5D)">Hyperpolarized δ-[1-13C] gluconolactone as a probe of the pentose phosphate pathway.</a> NMR in Biomedicine. 30 (6), (2017).</li>
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<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Hepatocytes+and+Sinusoidal+Endothelial+Cells+from+Mouse+Liver+Perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).</li>
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 <a target="_blank" href="https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf">https://www.chem.ucla.edu/dept/Faculty/merchant/pdf/electrode_prep_maintenance.pdf</a> (2006).</li>
<li>Heparin. , DrugBank Online. Available from: 
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<li>Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+anesthesia+and+euthanasia+on+metabolomics+of+mammalian+tissues%3A+studies+in+a+C57BL%2F6J+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model.</a> PloS One. 10 (2), 0117232(2015).</li>
</ol>

Os autores não declaram conflito de interesses. Os financiadores não tiveram papel na concepção do estudo; na coleta, análises ou interpretação de dados; na escrita do manuscrito; ou na decisão de publicar os resultados.

Este procedimento cirúrgico é desafiador e requer uma prática extensiva para alcançar resultados reprodutíveis. O gás isoflurane e portador deve ser ajustado conforme necessário para manter a viabilidade do animal através da maior parte do procedimento cirúrgico possível. Ambiente, hora do dia, idade, peso e vários outros fatores afetarão a anestesia. Peso, dieta, variedade de camundongos e idade podem afetar a cirurgia, pois o acúmulo de gordura pode interferir na visualização da veia portal. Ao bater as patas para baix...

Perfusões ex vivo são cruciais no estudo do metabolismo hepático, e a perfusão pela veia portal é o padrão para esses estudos. Para estudar o metabolismo hepático isoladamente, o fígado deve ser ressecado do corpo para evitar complicações decorrentes do metabolismo em outros órgãos (ou seja, metabolismo do corpo inteiro) e exercer controle sobre a disponibilidade hormonal (insulina, glucagon, etc.). Essa abordagem pode ser essencial para entender os efeitos de doenças como diabetes, NAFLD e NASH no metabolismo hepático, bem como mecanismos de ação medicamentosa. Este artigo serve como um guia para ressecção hepática e perfusão. Desenvolvemos um procedimento simplificado para realizar esses estudos hepáticos metabólicos com rigor e reprodutibilidade suficientes. Se a cirurgia não for realizada corretamente, há variabilidade pronunciada nos dados metabólicos obtidos. Descrevemos um método organizado para realizar cateterismo venoso portal e ressecção hepática no contexto de estudos metabólicos in situ em um espectrômetro de ressonância magnética nuclear (RMN), conforme descrito na literatura 1,2,3,4,5.
Atualmente, não há literatura descrevendo uma perfusão ex vivo hepática usando uma coluna de vidro dentro de uma RMN. Também não há uma publicação de vídeo ou texto que forneça um exemplo claro de como realizar o procedimento com o fígado do rato, especificamente, demonstrando como cateterizar a veia do portal, ressecar um fígado, transferir e pendurar o fígado em uma coluna de vidro. Como o camundongo geneticamente modificado é onipresentemente usado para estudar o metabolismo hepático, este é um procedimento essencial que merece uma descrição completa. As cirurgias de perfusão hepática não são novas, mas este artigo é um método padrão-ouro acompanhado de um vídeo demonstrando a excelência técnica descrita neste artigo para ajudar todos os interessados neste procedimento. O método aqui apresentado seria melhor aplicado ao metabolismo em tempo real para detectar a função e a rotatividade de metabólitos em modelos de doenças.
Este método usa uma coluna de vidro de 100 cm com jaqueta de água, que permite que o fígado fique pendurado na parte inferior da cânula encapsulada por perfusato dentro de um tubo NMR. A água aquecida na jaqueta de vidro é usada para controlar a temperatura perfusada. Um oxigenador de camada fina é pressurizado com 95%/5% O2/CO2 para controle de pH. Usando três bombas separadas, a altura da coluna perfusada é definida, o que proporciona pressão constante ao fígado. As taxas de fluxo não são controladas além da aplicação de pressão constante (Figura 1). Para confirmar que o fígado está funcionando adequadamente, as medidas de oxigênio são tomadas juntamente com as taxas de fluxo. Em nossas mãos, este conjunto de pré-condições leva a experimentos de RMN altamente repetitivos para a avaliação da função metabólica hepática.

<table><tbody><tr><td>1 mL Luer-Lock Seringa Descartável Estéril de Uso Único</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Marca Não Específica</td></tr><tr><td>100 cm Coluna de Vidro Jaqueta de Água</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sutura de Seda 2-0</td> Feita <td>Sob Medida Braintree Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Calibre 22 Catherter 1 pol. Sem segurança</td><td>Terumo</td><td>SRFF2225</td><td></td></tr><tr><td>23 G 0,75 pol. Agulhas Hipodeméricas</td><td>Exel International</td><td>26407</td><td></td></tr><tr><td>27 G 1.5 pol. Agulhas Hypodemeric Exel</td><td>International</td><td>26426</td><td></td></tr><tr><td>4x4 pol. Plataforma Cirúrgica</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Toalhete Personalizado com Álcool 70%</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Marca Não Específica</td></tr><tr><td>Banho-maria Circulante</td><td>MS Lauda</td><td>N/A</td><td>Modelo já não fabricado</td></tr><tr><td>Aplicador de Ponta de Algodão</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Marca Não Específica</td></tr><tr><td>Tesoura de Operação Delicada; Reto; Afiado-afiado; Comprimento da lâmina de 30 mm; 4 3/4 "</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5/45 Fórceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 7 - Fórceps Fino</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>Hemostats</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>13015-14</td><td></td></tr><tr><td>Heparina Sódio Injetável 1000 unidades / mL</td><td>RX Genéricos</td><td>71288-0402-02</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Patterson Veterinary</td><td>14043-0704-06</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaína HCl 2%</td> <td>VEDCO Inc.</td><td>50989-0417-12</td><td></td></tr><tr><td>Oxigenador de Membrana de Camada Fina</td><td>Radnoti</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum Tesoura; Curvo; Cego; Comprimento da lâmina de 27 mm; 5 "</td><td>Roboz</td><td>RS-6013</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Medidor de Oxigênio</td><td>Hanstech Instruments Ltd.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Solução Salina 0,9%</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Solução salina é feita em escala de laboratório</td></tr><tr><td></td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Marca não específica</td></tr><tr><td>&nbsp; Sistemas de Bomba de Console Analógico de Velocidade Variável</td><td>Cole Palmer</td><td>N/A</td><td>Os modelos são personalizados por aplicação</td></tr><tr><td>Pesar barcos</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Marca não específica</td></tr></tbody></table>

ex vivo perfusão hepática através do portal veia em rato

Ex Vivo Hepatic Perfusion Through the Portal Vein in Mouse

Doenças metabólicas como diabetes, pré-diabetes, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) e esteatohepatite não alcoólica (NASH) estão se tornando cada vez mais comuns. Perfusões hepáticas ex vivo permitem uma análise abrangente do metabolismo hepático usando ressonância magnética nuclear (RMN), em condições nutricionais que podem ser rigorosamente controladas. Como nas simulações de silico permanecem um meio principalmente teórico de avaliar as ações hormonais e os efeitos da intervenção farmacêutica, o fígado perfumado continua sendo um dos leitos de teste mais valiosos para a compreensão do metabolismo hepático. Como esses estudos orientam insights básicos sobre fisiologia hepática, os resultados devem ser precisos e reprodutíveis. O maior fator na reprodutibilidade da perfusão hepática ex vivo é a qualidade da cirurgia. Por isso, introduzimos um método organizado e simplificado para realizar perfusões de fígado de camundongos ex vivo no contexto de experimentos in situ NMR. Descrevemos também uma aplicação única e discutimos questões comuns encontradas nesses estudos. O objetivo geral é fornecer um guia descomplicado para uma técnica que refinamos ao longo de vários anos que consideramos o padrão dourado para obter resultados reprodutíveis em ressecções hepáticas e perfusões no contexto de experimentos in situ NMR. A distância até o centro do campo para o ímã, bem como a inacessibilidade do tecido à intervenção durante o experimento NMR torna nossos métodos novos.

A função hepática é avaliada principalmente pelo consumo de oxigênio e taxa de fluxo. Uma taxa de fluxo de 4-8 mL/min e o consumo de oxigênio de 1 μmol/min.g é típico. Essas medidas variam dependendo de condições experimentais específicas e diferenças biológicas.
A quantidade exata de isoflurane utilizada dependerá do tipo de sistema de anestesia que está sendo usado, bem como do ambiente e idade/peso do camundongo. Durante a cirurgia, o isoflurane e o gás de parto não mudam, embora algumas al...

O protocolo descreve um método simples de ressecção de um fígado de rato intacto para estudos metabólicos através da perfusão venosa portal.

Ex Vivo Perfusão hepática através do Portal Veia em Rato

Metabolic diseases such as diabetes, pre-diabetes, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and nonalcoholic steatohepatitis (NASH) are becoming ...

Este vídeo demonstra um procedimento simplificado desenvolvido para realizar estudos hepáticos metabólicos com rigor e reprodutibilidade suficientes, que podem servir de guia para realizar a ressecção hepática para seus estudos de perfusão viva. A técnica é melhor aplicada ao metabolismo em tempo real para detectar a função, em metabólitos de rotatividade em modelos de doenças. A perfusão permite o controle preciso de nutrientes e hormônios disponíveis para o fígado.Embora a técnica não seja direcionada para a terapia, as perfusões hepáticas podem ser fundamentais na compreensão da etiologia e do impacto de doenças, como diabetes, NAFLD e NASH no metabolismo hepático. À medida que novos fármacos são desenvolvidos, os métodos para avaliar o metabolismo de energia central hepática tornam-se essenciais. Este método pode ser usado com modelos de diversas doenças, incluindo cânceres e em vários estágios diferentes de progressão da doença.Para começar, coloque o nariz do rato em um cone de nariz após a indução da anestesia, e amarre suas patas. Administrar lidocaína através de uma injeção subcutânea bilateralmente na região da crista ilíaca anterior. Realize um teste de beliscar o dedo d

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo descreve um procedimento para perfusão hepática de camundongo através da veia porta usando solução de colagenase antes de isolar as células hepáticas.

Perfusão hepática murina in vivo: um método para infundir o fígado de roedor com solução através da veia porta

Os macrófagos hepáticos, denominados células de Kupffer, são responsáveis pela captura de nanopartículas circulantes. Descrevemos aqui um método, de alta pureza e rendimento celular, para isolamento de células de Kupffer. O ensaio LDH modificado é usado aqui para medir a toxicidade induzida por nanotubos de carbono em células de Kupffer.

Kupffer isolamento celular para Nanoparticle Toxicity Testing

O objetivo do presente protocolo é obter alta viabilidade e alto rendimento de hepatócitos e células endoteliais sinusoidais do fígado. Isso é realizado pela perfusing o fígado com uma solução de colagenase tipo IV através da veia portal, seguida por centrifugação diferencial para obter hepatócitos e células endoteliais sinusoidais.

Purificação de hepatócitos e células endoteliais sinusoidais de fígado de rato perfusão

Há uma escassez de doadores de fígado significativo, e expandiram-se critérios para doadores de fígado. Normotérmica ex vivo fígado perfusão (NEVLP) foi desenvolvido para avaliar e modificar a função do órgão. Este estudo demonstra um modelo do rato de NEVLP e testa a capacidade do peguilado-catalase, para atenuar a lesão hepática de preservação.

Um pequeno modelo Animal de perfusão de fígado normotérmica Ex Vivo

Um protocolo é descrito para a perfusão in situ do corpo inferior do camundongo, incluindo a bexiga, a próstata, órgãos sexuais, osso, músculo e pele do pé.

Estabelecendo in Situ Circuito Fechado Perfusão de Órgãos Abdominais Inferiores e Membros Traseiros em Camundongos

O ácido graxo β-oxidação é uma via metabólica essencial responsável pela geração de energia em muitos tipos diferentes de células, incluindo hepatócitos. Aqui, descrevemos um método para medir o ácido graxo β-oxidação em hepatócitos primários recém-isolados usando ácido palmítico de 14C.

Medição do ácido graxo β-oxidação em uma suspensão de hepatócitos de rato recém-isolados

O presente protocolo otimiza os métodos de perfusão/decelularização hepática in situ e microscopia de dois fótons para estabelecer uma plataforma confiável para visualizar a dinâmica do remodelamento da matriz extracelular (MEC) durante a esteato-hepatite não alcoólica (EHNA).

Imagem 3D da Matriz Extracelular Hepática em Modelo de Esteatohepatite Não Alcoólica em Camundongos

Hepatócitos carregados de lipídios são inerentes à regeneração hepática, mas geralmente são perdidos após a centrifugação do gradiente de densidade. Aqui, apresentamos um protocolo de isolamento celular otimizado que retém hepatócitos esteatóticos, produzindo populações representativas de hepatócitos regeneradores após hepatectomia parcial em camundongos.

Isolamento de Hepatócitos Regeneradores após Hepatectomia Parcial em Camundongos

Um sistema normotérmico ex vivo de perfusão hepática (NEVLP) foi criado para fígados de camundongos. Este sistema requer experiência em microcirurgia, mas permite resultados reprodutíveis de perfusão. A capacidade de utilizar fígados de camundongos facilita a investigação de vias moleculares para identificar novos aditivos de perfusato e permite a execução de experimentos focados no reparo de órgãos.

Perfusão de máquina hepática normotérmica ex vivo em camundongos

Aqui, apresentamos um método robusto de perfusão in situ do fígado de camundongos para estudar a regulação aguda e direta do metabolismo hepático sem perturbar a arquitetura hepática, mas na ausência de fatores extra-hepáticos.

Produção Hepática de Glicose, Urateagênese e Lipólise Quantificada usando o Modelo de Fígado de Camundongo Perfundido

Aqui, descrevemos uma plataforma que permite imagens in vivo não invasivas de esferoides hepáticos enxertados na câmara anterior do olho do camundongo. O fluxo de trabalho abrange desde a geração de esferoides de células hepáticas primárias até o transplante para o olho do camundongo e imagens in vivo em resolução celular por microscopia confocal.

Imagens in vivo de esferoides hepáticos enxertados na câmara anterior do olho do camundongo

Aprenda a técnica de perfusão hepática ex vivo pela veia porta em ratos para estudos metabólicos em tempo real. Este método permite controlar nutrientes e hormônios, auxiliando na pesquisa de doenças como diabetes, NAFLD e NASH.

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