Name: Detecção de esporozoítos de Plasmodium em mosquitos Anopheles usando um ensaio imunoenzimático (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprenda a detectar esporozoítos de Plasmodium em mosquitos Anopheles usando ensaio ELISA. Este método de alta sensibilidade permite processar múltiplas amostras simultaneamente para pesquisa de transmissão da malária.

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Agradecemos ao Sr. Kirakorn Kiatibutr, MVRU, pelo treinamento e orientação. Agradecemos também à Sra. Pinyapat Kongngen, MVRU, por sua assistência técnica na preparação da Figura 2. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas e do Instituto Nacional de Saúde (U19 AI089672).

1. Preparação de reagentes
NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista de equipamentos, reagentes e outros consumíveis usados neste protocolo e a Tabela 1 para obter uma lista de soluções e sua composição.
<ol><li>Captura e mAbs conjugados com peroxidase<ol><li>Para reconstituir o mAb, ressuspenda o mAb liofilizado em uma mistura 1:1 de água destilada: glicerol a 0,5 mg/mL. Fazer alíquotas conforme necessário para evitar congelamento e descongelamento repetidos e armazená-las a -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Buffer de bloqueio (BB)<ol><li>Prepare o tampão de bloqueio dissolvendo 5 g de caseína grau ELISA em 100 mL de NaOH 0,1 N. Adicione 900 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) (ver Tabela 1) para trazer o volume final para 1,0 L.</li>
		<li>Adicione 0,02 g de vermelho de fenol como indicador e ajuste o pH para 7,4 com HCl. Armazene BB a 4 ° C por até uma semana ou alíquota em 50 mL para armazenamento de longo prazo a -20 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Controles positivos<ol><li>Para reconstituir os controles positivos, reidratar as proteínas liofilizadas adicionando 1.000 μL de BB. Elaborar alíquotas das soluções de controlo positivo de stock conforme necessário e armazená-las a -20 °C.</li>
		<li>Para a diluição em série, diluir ainda mais cada controlo positivo até à concentração final de trabalho em BB do seguinte modo: Pf, 2 pg/μl; Pv (VK210), 182 (pg/μL); Pv (VK247), 89 pg/μL. NOTA: As concentrações exactas dos controlos positivos podem variar de um lote para outro. Consulte a ficha de informações do produto para obter a concentração exata necessária. As concentrações de controle positivo, a partir da concentração de trabalho acima, são 2, 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06 pg/μL para Pf; 182, 91, 46, 23, 11, 5,7 pg/μL para PV210; e 89, 45, 22, 11, 5,6, 2,8 pg/μL PV247.</li>
	</ol></li>
	<li>Controlos negativos NOTA: O controle negativo ideal é o homogeneizado cabeça-tórax de mosquitos Anopheles fêmeas preparados de forma idêntica às amostras de teste. No entanto, o BB também pode ser usado como controle negativo.<ol><li>Com BB como controle negativo, use o limite de absorbância de 2 vezes para leituras positivas confiáveis.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação da amostra do mosquito
<ol><li>Separe a cabeça e o tórax de cada mosquito adulto coletado do abdômen com uma lâmina de barbear estéril. Coloque a cabeça e o tórax em um tubo de moagem de centrífuga pré-rotulado de 1,5 mL. Cabeças de piscina e toráceos de até 10 mosquitos, se desejar. NOTA: Para a preparação da amostra, normalmente, a glândula salivar de um mosquito infectado será dissecada e submetida a CS-ELISA. No entanto, a cabeça e o tórax dos mosquitos coletados também podem ser usados para realizar o CS-ELISA diretamente (sem dissecar as glândulas salivares)12,13,19.</li>
	<li>Adicione 50 μL de tampão de moagem (GB) em cada tubo e homogeneize a amostra com um pilão limpo (lavado com sabão). Enxágue o pilão usado com 250 μL de GB no tubo que contém o(s) mosquito(s) homogeneizado(s) até um volume final de ~300 μL.</li>
	<li>Manter a amostra num congelador (-20 °C) até à utilização ou proceder imediatamente à realização do ELISA.</li>
</ol>3. ELISA de esporozoíto
<ol><li>Preencha a planilha ELISA de esporozoítos (consulte o Material Suplementar 1). Prepare uma placa ELISA para cada CSP (Pf, Pv-210 ou Pv-247).</li>
	<li>Preparar a solução de trabalho de mAb de captura dissolvendo o anticorpo em PBS: 4 μg/ml Pf; 2 μg/mL Pv-210; 2 μg/mL de Pv-247. Calcule os volumes necessários com base na adição de 5 mL por placa. Vortex a solução suavemente.</li>
	<li>Pipetar 50 μL de cada solução de mAb de trabalho da etapa 3.2 em cada poço da placa ELISA. Cubra o prato com uma tampa de plástico e incube por 30 min ou durante a noite em temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspire o conteúdo do poço e bata o prato de cabeça para baixo em toalhas de papel pelo menos 5 vezes para remover todo o líquido. NOTA: Se um sistema de aspiração (sucção a vácuo multicanal conectada a pontas limpas) não estiver disponível, despeje os anticorpos na pia e bata no prato em toalhas de papel.</li>
	<li>Adicione 200 μL de BB para encher todos os poços na placa. Cubra o prato com uma tampa de plástico. Incubar a placa durante 1 h à temperatura ambiente. Aspire ou despeje o conteúdo do poço. Bata o prato de cabeça para baixo em toalhas de papel 5 vezes para remover todo o líquido.</li>
	<li>Carregue o homogeneizado de mosquitos e o controle na placa da seguinte maneira.<ol><li>Adicionar 50 μL do controlo positivo aos alvéolos H1 e H2.</li>
		<li>Adicione 50 μL de BB aos poços nas colunas 1 e 2 da linha C a G. Em seguida, adicione 50 μL do controle positivo nos poços G1 e G2. Fazer uma diluição em série do controlo positivo a partir de G1 e G2, seguida de F1 e F2 até C1 e C2. NOTA: Todos os alvéolos de controle positivo devem conter 50 μL.</li>
		<li>Adicione 50 μL de BB (controle negativo) aos poços A1, A2, B1 e B2.</li>
		<li>Adicione 50 μL de cada amostra homogeneizada a um poço desconhecido (Unk).</li>
		<li>Cubra a placa e incube por 2 h em temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Após aproximadamente 2 h, comece a preparar os substratos. Para o kit de 2 componentes do substrato ABTS, misture o substrato A e o substrato B na proporção de 1:1. NOTA: Uma placa completa de 96 poços requer 5 mL de substrato A e 5 mL de substrato B.</li>
	<li>Prepare as soluções de trabalho de mAbs marcados com peroxidase para Pf, Pv-210 e Pv-247 adicionando BB ao mAb conjugado reconstituído para obter uma concentração de trabalho de 1 μg / mL.<ol><li>Calcule os volumes necessários com base na adição de 5 mL de solução conjugada de mAb de trabalho por placa.</li>
		<li>Teste a atividade da peroxidase misturando 5 μL do mAb marcado com peroxidase feito na etapa 3.8 com 100 μL do substrato feito na etapa 3.7 em um tubo separado de 1,5 mL. Vórtice suavemente. NOTA: Deve haver uma rápida mudança de cor de claro para verde, indicando que a enzima peroxidase e os substratos estão funcionando.</li>
	</ol></li>
	<li>Aspire ou despeje o conteúdo do poço e bata o prato de cabeça para baixo em toalhas de papel 5 vezes para remover todo o líquido.</li>
	<li>Lave os poços duas vezes com 200 μL de PBS-Tween, aspire o conteúdo do poço e bata na placa 5 vezes cada.</li>
	<li>Adicione 50 μL de mAb marcado com peroxidase feito na etapa 3.8 a cada poço. Cubra a placa e incube por 1 h em temperatura ambiente no escuro. Aspire ou despeje o conteúdo do poço e bata o prato de cabeça para baixo em uma toalha de papel 5 vezes.</li>
	<li>Lave os poços 3 vezes com 200 μL de PBS-Tween, aspire o conteúdo do poço e bata na placa 5 vezes cada.</li>
	<li>Adicione 100 μL da solução de substrato preparada na etapa 3.7 a cada poço. Cubra a placa e incube por 30 min em temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Após 30 min, leia a absorbância a 405-414 nm usando um leitor de placas ELISA. NOTA: Siga as instruções específicas para o leitor de placas ELISA usado. Para obter detalhes sobre as instruções do software usado para este protocolo, consulte Material Suplementar S2. Deve haver uma mudança de cor perceptível de claro para verde nos poços de controle positivo.</li>
</ol>4. Análise
<ol><li>Detecção de amostras positivas.<ol><li>Rotular as amostras com valores de absorbância acima do limite (duas vezes o valor médio de absorbância das amostras negativas) como positivas.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificando o CSP<ol><li>Estimar a concentração de CSP na amostra utilizando a curva-padrão construída a partir da série de diluições de controlo do seguinte modo.<ol><li>Crie a curva padrão plotando os valores de absorbância (eixo y) dos controles diluídos em série em relação às suas concentrações (eixo x).</li>
			<li>Execute a regressão linear para determinar o melhor ajuste usando y = A + Bx, onde A e B são parâmetros livres.</li>
			<li>Determinar a concentração de CSP para cada amostra positiva resolvendo a equação para um determinado valor de absorvância.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Bray, R. S., Garnham, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life-cycle+of+primate+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22British+Medical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">The life-cycle of primate malaria parasites.</a> British Medical Bulletin. 38 (2), 117-122 (1982).</li>
<li>Held, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primate+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Primate malaria.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 162 (1), 587-593 (1969).</li>
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<li>Marie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+real-time+quantitative+PCR+to+measure+the+wild+Plasmodium+falciparum+infectivity+rate+in+salivary+glands+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a real-time quantitative PCR to measure the wild Plasmodium falciparum infectivity rate in salivary glands of Anopheles gambiae.</a> Malaria Journal. 12, 224(2013).</li>
<li>Arevalo-Herrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoreactivity+of+sera+from+low+to+moderate+malaria-eEndemic+areas+against+Plasmodium+vivax+rPvs48%2F45+proteins+produced+in+Escherichia+coli+and+chinese+hamster+ovary+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoreactivity of sera from low to moderate malaria-eEndemic areas against Plasmodium vivax rPvs48/45 proteins produced in Escherichia coli and chinese hamster ovary systems.</a> Frontiers in Immunology. 12, 634738(2021).</li>
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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

O CSP-ELISA, fornece um método altamente específico e econômico para detectar Plasmodium CSP. Permite a discriminação entre esporozoítos de P. falciparum e P. vivax, bem como entre os dois subtipos, VK210 e VK247, de P vivax 11,13,14,15. Certos pontos críticos devem ser considerados para obter resultados confiáveis e reprodutíveis. Todas as soluções devem ser...

Os esporozoítos de Plasmodium são o estágio infeccioso dos parasitas da malária nos mosquitos. Os esporozoítos são entregues aos humanos por meio de picadas de mosquito. No mosquito, os esporozoítos se formam primeiro dentro dos oocistos na parede do intestino médio. Uma vez prontos, eles são liberados na hemocele e viajam para as glândulas salivares do mosquito. Lá, eles amadurecem e ficam prontos para a transmissão aos humanos durante a alimentação sanguínea. Nos humanos, os esporozoítos são depositados na derme. Em seguida, entram no vaso sanguíneo e percorrem a circulação sanguínea até chegar ao fígado e estabelecer infecção nos hepatócitos 1,2.
Três métodos diferentes foram usados para determinar a infecção por esporozoítos das glândulas salivares do mosquito. O primeiro método é a dissecção das glândulas salivares seguida de exame direto dos esporozoítos ao microscópio óptico. Este método é o padrão-ouro para detectar e quantificar esporozoítos nas glândulas salivares do mosquito Anopheles 3. No entanto, requer um técnico bem treinado tanto em dissecção quanto em exame microscópico. Além disso, não pode ser usado para determinar espécies de Plasmodium e subtipagem de CSP (para P. vivax)4,5. O segundo método usa a reação em cadeia da polimerase (PCR) para detectar DNA de Plasmodium na parte superior do corpo do mosquito6. Dada a especificidade da PCR, tanto a espécie quanto a subtipagem do parasita são possíveis 7,8,9,10. Embora a PCR seja cada vez mais usada, ela requer equipamentos relativamente caros e pessoal bem treinado. O último método, o ELISA para detectar a proteína circunsporozoíta específica do Plasmodium (CSP), tem sido o esteio por três décadas 11,12,13. A CSP está presente tanto nos esporozoítos de oocistos quanto nos esporozoítos das glândulas salivares12,14. Usando anticorpos específicos, este método permite a identificação de espécies de Plasmodium e subtipagem de CSP de esporozoítos de P. vivax. A justificativa para este ensaio é a necessidade de um ensaio simples de alto rendimento para examinar um grande número de mosquitos selvagens para entender a transmissão da malária (ou seja, determinar a taxa de infecção por esporozoítos).
O método ELISA tem duas vantagens principais sobre o exame microscópico. Primeiro, permite que os pesquisadores mantenham amostras de mosquitos até que estejam prontas para o processamento de amostras. Em segundo lugar, o método ELISA pode ser usado para diferenciar espécies de Plasmodium por meio de anticorpos monoclonais específicos da espécie. Além disso, o ELISA pode acomodar um número maior de espécimes de mosquitos, permitindo um rendimento muito maior15. Em comparação com a PCR, que detecta DNA de esporozoítos, o procedimento ELISA leva mais tempo, mas custa menos16. O ensaio ELISA descrito aqui foi desenvolvido para determinar a infectividade do mosquito e detectar separadamente CSP de P. falciparum e cada uma das duas variantes CSP de P. vivax, VK210 e VK247. Este método ELISA tem sido utilizado em muitos estudos para determinar a dinâmica sazonal da infecção por mosquitos e identificar as espécies dos principais vetores da malária no campo 12,13,17,18. Para realizar este ensaio, um laboratório padrão equipado com um leitor de placas ELISA é suficiente.
A abordagem geral está resumida na Figura 1. Neste ELISA sanduíche, o anticorpo monoclonal primário (captura) (mAb) específico para cada espécie/subtipo de Plasmodium é usado primeiro para revestir a placa ELISA. Cada placa é revestida com um único mAb de captura. A função do mAb é capturar o antígeno CSP correspondente nos homogeneizados do mosquito. Após a captura do antígeno e a lavagem da placa, um segundo anticorpo específico do CSP marcado com peroxidase é usado para detectar a presença de CSP ligado ao mAb de captura. A reação química catalisada pela peroxidase resulta no desenvolvimento de cor em poços positivos para CSP.

<table><tbody><tr><td><forte>Equipamento</forte>Leitor de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>placas ELISA</td><td>BioTek Instrument, Inc.</td><td>Synergy H1</td><td>A absorbância é medida usando o modo de detecção de absorbância UV-VIS</td></tr><tr><td>Pilão do moedor</td><td>Axygen</td><td>PES-15-B-SI</td><td>Para homogeneizar a cabeça do mosquito/tórax</td></tr><tr><td><forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABTS substrato 2 componentes</td><td>KPL</td><td>50-62-00</td><td>Para detecção acionada por peroxidase</td></tr><tr><td>Tampão de bloqueio (BB)</td><td></td><td></td><td>Nota: solução</td></tr><tr><td>Captura e anticorpos monoclonais conjugados com peroxidase (mAbs)</td><td></td><td></td><td>Nota: Os mAbs podem ser obtidos na forma liofilizada como parte dos Kits de Reagentes ELISA de Esporozoíto (MRA-890 para P. falciparum e MRA-1028K para P. vivax) da BEI Resources (https://www.beiresources.org.)</td></tr><tr><td>Caseína</td><td>Sigma aldrich</td><td>9000-71-9</td><td>Para bloquear a preparação do tampão Tampão</td></tr><tr><td>de moagem (GB)</td><td></td><td></td><td>Nota: solução</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Para preparação de tampão de moagem</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma aldrich</td><td>7447-40-7</td><td>Para tampão de fosfato preparação salina</td></tr><tr><td>KH2PO4 </td><td>Sigma aldrich</td><td>7778-77-0</td><td>Para preparação salina de tampão fosfato</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma aldrich</td><td>7558-79-4</td><td>Para preparação salina de tampão fosfato</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>Para preparação salina de tampão fosfato</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma aldrich</td><td>1310-73-2</td><td>Para preparação de tampão de fosfato</td></tr><tr><td>PBS-Tween</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pf captura mAb</td><td>CDC</td><td>Pf-CAP</td><td>Para capturar proteína Pf circumsporozoíto</td></tr><tr><td>Pf peroxidase mAb</td><td>CDC</td><td>Pf-HRP</td><td>Para detecção de proteína Pf circunsporozoíto</td></tr><tr><td>Pf controle positivo</td><td>CDC</td><td>Pf-PC</td><td>Pf controle positivo</td></tr><tr><td>Vermelho de fenol</td><td>Sigma aldrich</td><td>143-74-8</td><td>Para bloquear a preparação do tampão</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td>Nota: solução</td></tr><tr><td>Controles</td><td></td><td></td> positivos <td>Nota: solução</td></tr><tr><td>Pv210 captura mAb</td><td>CDC</td><td>Pv210-CAP</td><td>Para capturar proteína circunsporozoíta Pv210</td></tr><tr><td>Pv210 peroxidase mAb</td><td>CDC</td><td>Pv210-HRP</td><td>Para detectar proteína circunsporozoíta Pv210</td></tr><tr><td>Controle positivo</td><td>CDC</td><td>Pv210-PC</td><td>Controle positivo Pv210</td></tr><tr><td>Pv247 captura mAb</td><td>CDC</td><td>Pv247-CAP</td><td>Para capturar proteína circunsporozoíta Pv247</td></tr><tr><td>Pv247 peroxidase mAb</td><td>CDC</td><td>Pv247-HRP</td><td>Para detecção de proteína circunsporozoíta Pv247</td></tr><tr><td>Controle positivo CDC</td><td></td><td>Pv247-PC</td><td>Pv247 controle positivo</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma aldrich</td><td>9005-64-5</td><td>Para preparação PBS-Tween</td></tr><tr><td><forte>Consumíveis</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reservatórios de pipetagem descartáveis</td><td>Genérico</td><td></td><td>Para reagentes de trabalho</td></tr><tr><td>Placas ELISA: 96 bem claro fundo redondo PVS</td><td>Corning Life Science</td><td>2797</td><td>Para ELISA</td></tr><tr><td>Luvas: luvas descartáveis e luvas de congelamento</td><td>Genérico</td><td></td><td>Para proteção pessoal</td></tr><tr><td>Bata de laboratório</td><td>Genérica</td><td></td><td>para proteção pessoal</td></tr><tr><td>Pipeta multicanal P30-300</td><td>Genérica</td><td></td><td>Para transferência de solução</td></tr><tr><td>Conjunto de pipetas, P2, P20, P200 e P1000</td><td>Genérica</td><td></td><td>Para transferência de solução</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta 10 &micro; L, 200 &micro; L e 1000 &micro; L</td><td>Genérico</td><td></td><td>Para transferência de solução</td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas 5 mL, 10 mL</td><td>Genérico</td><td></td><td>Para transferência de solução</td></tr><tr><td>Pipetas de transferência</td><td>Genérico</td><td></td><td>Para transferência de solução</td></tr></tbody></table>

detecção de esporozoítos de plasmodium em mosquitos anopheles usando um ensaio imunoenzimático

Detection of Plasmodium Sporozoites in Anopheles Mosquitoes using an Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Os esporozoítos de Plasmodium são o estágio infeccioso dos parasitas da malária que infectam humanos. Os esporozoítos que residem nas glândulas salivares das fêmeas dos mosquitos Anopheles são transmitidos aos humanos por meio de picadas de mosquito durante a alimentação do sangue. A presença de esporozoítos nas glândulas salivares do mosquito define a infecciosidade do mosquito. Para determinar se um mosquito Anopheles carrega esporozoítos de Plasmodium, o método de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) tem sido a ferramenta padrão para detectar a proteína circunsporozoíta de Plasmodium (CSP), a principal proteína de superfície dos esporozoítos. Nesse método, a cabeça e o tórax de cada mosquito são separados do abdômen, homogeneizados e submetidos a um ELISA sanduíche para detectar a presença de CSP específico para Plasmodium falciparum e cada um dos dois subtipos, VK210 e VK247, de Plasmodium vivax. Este método tem sido usado para estudar a transmissão da malária, incluindo a dinâmica sazonal da infecção por mosquitos e as espécies dos principais vetores da malária nos locais de estudo.

Os resultados representativos do ELISA são mostrados na Figura 2. Neste experimento, o ELISA de P. falciparum detectou infecção por esporozoítos no poço A7. O poço positivo pode ser detectado visualmente por sua cor verde fraca (Figura 2A). O valor de absorbância deste poço estava acima do limite de corte (duas vezes o valor médio dos quatro poços de controle negativo) (Figura 2B). A distribuição dos valores de absorbância ...

Este protocolo descreve um ensaio de imunoabsorção enzimática em sanduíche para detectar esporozoítos de glândulas salivares em mosquitos. Usando anticorpos monoclonais facilmente disponíveis, o método permite a detecção econômica e de alto rendimento de mosquitos portadores de Plasmodium falciparum ou Plasmodium vivax. O método é adequado para pesquisas de transmissão da malária, incluindo pesquisas vetoriais.

Detecção de esporozoítos de Plasmodium em mosquitos Anopheles usando um ensaio imunoenzimático

Plasmodium sporozoites are the infective stage of malaria parasites that infect humans. The sporozoites residing in the salivary glands of female ...

A técnica ELISA é realmente útil para detectar o parasita da malária no mosquito vetor com alta sensibilidade e especificidade, e capaz de processar muitas amostras ao mesmo tempo. Essa técnica permite que os pesquisadores mantenham amostras de mosquitos até que estejam prontas para o processamento de amostras, e pode ser realizada para diferenciar espécies de Plasmodium usando anticorpos monoclonais específicos da espécie. Prepare a amostra separando a cabeça e o tórax dos mosquitos do abdômen e coloque-os em um tubo de moagem de centrífuga pré-rotulado de 1,5 mililitro.Adicione 50 microlitros de tampão de moagem a cada tubo e homogeneize a amostra com um pilão. Enxágüe o pilão com 250 microlitros de tampão de moagem e adicione a solução ao tubo para aumentar o volume final para 300 microlitros. Prepare uma placa ELISA para proteína circunsporozoíta e preencha a planilha ELISA de esporozoíto.Prepare a solução de anticorpos em PBS e adicione cinco mililitros da solução por placa. Pipetar 50 microlitros da solução de anticorpos em cada poço da placa ELISA. Coloque uma tampa no prato e incube por 30 minutos ou durante a noite em temperatura ambiente.Aspire a solução no poço e bata o prato em uma toalha de papel cinco vezes para remover o líquido. Adicione 200 microlitros de tampão de bloqueio nas placas do poço e cubra com uma tampa. Incube por uma hora em temperatura ambiente e aspire o conteúdo do poço.Novamente bata o prato em uma toalha de papel para remover o líquido. Adicione 50 microlitros de controle positivo aos poços H um e H dois. Em seguida, adicione 50 microlitros de tampão de bloqueio nos poços nas colunas um e dois das linhas C a G. Adicione 50 microlitros do controle positivo nos poços G um e G dois.Diluir em série o controlo positivo a partir de G um e G dois, seguido de F um e F dois até C um e C dois. Adicione 50 microlitros do controle negativo aos poços A um, A dois, B um e B dois. Extraia 50 microlitros da solução homogeneizada e adicione-a a um poço desconhecido.Cubra o prato e incube-o em temperatura ambiente por duas horas. Preparar a solução de substrato misturando os substratos A e B na proporção de um para um. Determine o volume necessário com base na adição de cinco mililitros de solução de anticorpo conjugado de trabalho a cada placa.Avalie a atividade da peroxidase adicionando cinco microlitros da solução de anticorpo marcada com peroxidase a 100 microlitros da solução de substrato em um tubo de 1,5 mililitro. Aspire o conteúdo do poço e remova o líquido colocando o prato de cabeça para baixo sobre uma toalha de papel. Lave os poços duas vezes com 200 microlitros de PBS Tween.Aspire o conteúdo do poço e bata na placa cinco vezes. Adicione 50 microlitros de solução de anticorpos marcados com peroxidase a cada poço. Em seguida, incube no escuro por uma hora em temperatura ambiente.Aspire o conteúdo do poço e bata no prato em uma toalha de papel cinco vezes. Lave os poços com 200 microlitros de PBS Tween três vezes, aspire o conteúdo e bata na placa cinco vezes. Adicione 100 microlitros da solução de substrato a cada poço.Cubra o prato e incube no escuro por 30 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, leia a absorbância em 405 a 414 nanômetros usando um leitor de placas ELISA. Rotular as amostras com absorbância com um valor acima do limite como positivo e determinar a concentração de CSP na amostra usando o padrão.Plote os valores de absorbância versus concentração da solução para gerar uma curva padrão. Determine o melhor ajuste usando o método de regressão linear. Resolva a equação de cada valor de absorbância para uma amostra positiva para determinar a concentração de CSP.Após 30 minutos de realização de ELISA com ABTS, a infecção por esporozoítos pôde ser detectada pelo aparecimento de uma leve cor verde no poço. O controle positivo não apresentou nenhuma mudança de cor no poço. Os valores de absorbância para os poços negativo e positivo foram determinados.O poço positivo exibiu um valor de absorbância acima do limite de corte, enquanto os controles negativos demonstraram valores significativamente menores. Além disso, os valores de absorbância dos outros 80 poços desconhecidos também foram obtidos. A linha sólida representa a absorbância média dos alvéolos de controle negativo e a linha tracejada representa o limiar de positividade.Usando a curva padrão, a concentração de CSP no poço A sete foi determinada em 0,35 picogramas por microlitro Esta etapa do processamento de ELISA deve ser realizada rapidamente para evitar vetores inespecíficos. Além disso, todas as amostras e soluções devem ser mantidas na geladeira para evitar o crescimento microbiano. Recomenda-se que os pesquisadores confirmem as detecções positivas por outros métodos, como PCR.Isso melhorará significativamente a confiança, especialmente quando a única leitura for valorizada acima do limite. Essa técnica permitiu que os pesquisadores realizassem levantamentos em larga escala de possíveis infecções nos mosquitos, o que é importante para identificar o vetor principal.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Uma vez que um gene é identificada como potencialmente refratário para a malária, deve ser avaliado pelo seu papel na prevenção de infecções Plasmodium dentro do mosquito. Este protocolo ilustra como a extensão de infecções plasmodium de mosquitos podem ser ensaiadas. As técnicas de preparação da cultura gametócitos, membrana alimentarem de sangue humano os mosquitos, e assaying títulos viral no intestino médio do mosquito são demonstradas.

Protocolo para Infecções Plasmodium falciparum em mosquitos e Infecção Determinação Fenótipo

Uma maneira rápida e acessível para extrair qualidade parasita da malária e de DNA a partir de amostras do mosquito vetor é descrito. Capitalizando propriedades quelantes de resina Chelex, o método simples que permite a determinação do genótipo de parasitas da malária, em fases de glândulas de mosquitos mid-intestinal e de saliva, bem como a identificação molecular...

Um Protocolo de Chelex simples para extração de DNA de<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Este vídeo demonstra um ensaio para imunizar um modelo de camundongo com esporozoítos vivos atenuados. Os esporozoítos de Plasmodium atenuados por radiação são injetados no lado dorsal da orelha do camundongo. Após injeções em vários locais em ambas as orelhas, o camundongo pode se recuperar.

Imunização intradérmica com esporozoítos vivos atenuados em modelo de camundongo

Os mosquitos transmissores da malária têm uma série de características epidemiologicamente importantes que só podem ser detectadas usando técnicas moleculares. Utilizando uma plataforma de genotipagem SNP baseada em MALDI-TOF, desenvolvemos um ensaio para detectar simultaneamente várias características-chave (espécie, resistência a inseticidas, infecção parasitária e escolha do hospedeiro) de vetores da malária.

Um ensaio para detecção multi-malária mosquitos transmissores

Descrevemos aqui um protocolo para isolar células mieloides da pele de camundongos e drenar linfonodos após injeção intradérmica de esporozoítos de Plasmodium. A citometria de fluxo das células coletadas fornece um ensaio confiável para caracterizar a resposta inflamatória da pele e dos linfonodos de drenagem ao parasita.

Isolamento de células mielóides de rato Pele e Drenagem Linfonodo Seguindo intradérmica imunização com vivos atenuados<em&gt; Plasmodium</em&gt; Esporozoítos

Descrevemos um modelo de camundongo de malária cerebral experimental e mostramos como a patologia inflamatória e microvascular pode ser rastreada in vivo usando ressonância magnética.

In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology em um Modelo de Malária Cerebral Experimental Usando Ressonância Magnética

Devido às semelhanças marcantes do ciclo de vida e biologia de parasitas da malária de roedores para parasitas da malária humana, modelos de malária de roedores tornaram-se indispensáveis para a pesquisa da malária. Neste documento, padronizamos algumas das técnicas mais importantes utilizadas na análise fenotípica de espécies selvagens e transgênicas de malária por roedores.

Análise fenotípica de roedores malária parasita assexuada e estágios do sangue sexual e estágios do mosquito

Corrente multiplexado diagnósticos para detectar Zika, chikungunya, vírus da dengue exigem a preparação de amostras complexas e instrumentação cara e são difíceis de usar em ambientes de recursos baixos. Mostramos um diagnóstico que utiliza amplificação isotérmica com sondas displaceable vertente destino específico para detectar e diferenciar estes vírus com alta sensibilidade e especificidade.

Multiplexado amplificação isotérmica com base em plataforma de diagnóstica para detectar Dengue 1, Chikungunya e Zika

O ensaio padrão de alimentação de membrana (SMFA) é considerado como o padrão-ouro para a avaliação e identificação de potenciais compostos antimaláricos. Este sistema de alimentação artificial é usado para infectar mosquitos para avaliar ainda mais os efeitos desses compostos na intensidade e prevalência do parasita Plasmodium falciparum .

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Na infecção por Mycoplasma pneumoniae, os exames de sorologia podem gerar bons resultados, porém com baixa especificidade devido à reação cruzada imunológica. O ELISA interno de captura de antígenos, descrito neste artigo, garante alta especificidade de espécies e tem se mostrado um teste de triagem confiável para o diagnóstico preciso de M. pneumoniae.

Ensaio de imunoadsorção enzimática de captura de antígenos para detecção específica de Mycoplasma pneumoniae

A malária é transmitida através da inoculação do estágio de esporozoíto do Plasmodium por mosquitos infectados. O Plasmodium Transgênico nos permitiu compreender melhor a biologia da malária e contribuiu diretamente para os esforços de desenvolvimento de vacinas contra a malária. Aqui, descrevemos uma metodologia simplificada para gerar esporozoítos transgênicos de Plasmodium berghei .

Geração de Esporozoítos Geneticamente Modificados de Plasmodium berghei

Aprenda a detectar esporozoítos de Plasmodium em mosquitos Anopheles usando ensaio ELISA. Este método de alta sensibilidade permite processar múltiplas amostras simultaneamente para pesquisa de transmissão da malária.

Detecção de esporozoítos de Plasmodium em mosquitos Anopheles usando um ensaio imunoenzimático

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