Name: Cromatografia ultra-alta-performance semi-direcionada acoplada à análise de espectrometria de massa de metabólitos fenólicos no plasma de idosos adultos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Aprenda a detectar metabólitos fenólicos no plasma por UPLC-MS/MS semi-direcionada em idosos. Este método identifica compostos absorvidos após intervenção nutricional com Brosimum alicastrum.

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Os autores agradecem o apoio financeiro da CONACYT, México (CB- 2016-01-286449) e UACJ-PIVA (Projetos 313-17-16 e 335-18-13). A OAMB agradece à CONACYT por sua bolsa de doutorado. O suporte técnico do escritório de Produção Multimídia da UACJ é reconhecido com gratidão.

As amostras de plasma utilizadas neste protocolo foram coletadas em estudo prévio seguindo todas as diretrizes éticas e aprovadas pelo Comitê de Ética Institucional e Bioética (CIEB-2018-1-37) da Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. O protocolo completo para a extração e identificação dos compostos fenólicos e metabólitos no plasma pela UPLC-MS/MS está representado na Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63164/63164fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática da extração e identificação de compostos fenólicos e metabólitos no plasma pelo método UPLC-MS/MS semi-direcionado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63164/63164fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
1. Preparação da amostra
<ol><li>Armazene as amostras de plasma a -80 °C até a análise.</li>
	<li>Descongele as amostras de plasma à temperatura ambiente por 15 minutos. NOTA: As amostras podem ser colocadas em banho-maria a 37 °C para acelerar o processo (5 min).</li>
	<li>Coloque 200 μL de amostra de plasma em um microtubo de 2 mL e misture com 1.000 μL de etanol puro. Vórtice a amostra de plasma para 30 s. NOTA: Use sempre luvas ao trabalhar com amostras de plasma.</li>
	<li>Centrifugar a amostra a 6.580 x g por 5 min. Após a centrifugação, colete o supernatante com uma micropipette ou pipeta Pasteur e coloque-o em um novo microtubo. Armazene o supernatante a 4 °C.</li>
	<li>Misture a pelota da etapa anterior com 1.000 μL de 100% etanol, vórtice para 30 s e, em seguida, centrífuga a 6.580 x g por 5 min. NOTA: A pelota é fortemente embalada e precisa ser bem resuspended bem para garantir o contato entre a amostra e o etanol puro. Recomenda-se o uso de uma micropipette para lavar a pelota com etanol.</li>
	<li>Após a centrifugação, colete o supernante e misture com o sobrenatante previamente obtido a partir da Etapa 1.4. em um microtubo de 2 mL.</li>
	<li>Remova o etanol da amostra usando nitrogênio puro (99,997%) a 135 psi. Mantenha a agulha a 1 cm de distância da parte superior do microtubo para evitar a perda da amostra e lave até que a amostra esteja seca. Não é necessário calor para evaporar o etanol. NOTA: O fluxo de nitrogênio deve ser baixo para evitar a perda de amostras. Uma vez que o etanol esteja seco, mantenha o fluxo de nitrogênio por pelo menos 5 minutos para garantir o ressecamento da amostra. O protocolo pode ser pausado neste momento; as amostras devem ser armazenadas a -20 °C. Evite armazenar as amostras por mais de 12 h.</li>
	<li>Resuspenque as amostras secas em 100 μL de uma mistura de acetonitrilo: água em uma proporção de 50:50 (v:v).</li>
	<li>Filtre a amostra através de uma membrana de seringa de nylon de 0,45 μm diretamente em uma micro inserção de frasco HPLC. NOTA: As amostras do frasco podem ser armazenadas a -20 °C antes da análise. Armazene as amostras por não mais do que 8h. Recomenda-se injetar as amostras no sistema UPLC logo após a filtragem.</li>
</ol>2. Análise UPLC-MS/MS
<ol><li>Injete 3 μL de amostra em um UPLC equipado com uma coluna de fase reversa C18 (50 mm x 2,1 mm; 1,8 μm). Coloque a temperatura do autosampler a 20 °C e o termostato da coluna a 25 °C. Injete cada amostra em triplicado.</li>
	<li>Use 0,1% (v:v) ácido fórmico na água como solvente A, e 100% acetonitrilo como solvente B. Definir a taxa de fluxo em 0,4 mL/min e um programa gradiente da seguinte forma: 0-1 min 10% B, 1-4 min 30% B, 4-6 min 38% B, 6-8 min 60% B, 8-8,5 min 60% B, 8,5-9 min 10% B (Tabela 1).</li>
	<li>Ajuste o espectrômetro de massa para ionização de modo negativo. Use nitrogênio como gás de secagem a 340 °C e uma vazão de 13 L/min. Coloque a pressão do nebulizador em 60 psi. Coloque a tensão capilar em 4.000 V, a tensão fragmentor a 175 V e a tensão skimmer a 65 V. Use energia de colisão a 20 V (Tabela 2).</li>
	<li>Escaneie as massas entre 100-1100 massas para taxa de carga (m/z) e, para MS/MS, escaneie massas entre 50-1000 m/z (Tabela 2). Defina a aquisição de dados para o modo MS/MS automático. Utilize a seguinte massa de referência: 119.036 e 966.0007.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tempo (min)</td>
			<td>Solvente A (0,1 % ácido fórmico na água HPLC)</td>
			<td>Solvente B (100 % acetonitrilo)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 a 1</td>
			<td>90</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 a 4</td>
			<td>70</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 a 6</td>
			<td>62</td>
			<td>38</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 a 8</td>
			<td>40</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>8 a 8,5</td>
			<td>40</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>8,5 a 9</td>
			<td>90</td>
			<td>10</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Gradiente de fase móvel utilizado para a separação de compostos fenólicos por UPLC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Modo de ionização</td>
			<td>Negativo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gás de secagem</td>
			<td>Nitrogênio a 340 °C, vazão 13 L/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pressão de nebulizador</td>
			<td>60 psi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tensão capilar</td>
			<td>175 V</td>
		</tr>
<tr>
<td>Massas de varredura de MS</td>
			<td>100-1100 m/z</td>
		</tr>
<tr>
<td>Massas de varredura MS/MS</td>
			<td>50-1000 m/z</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Parâmetros de ionização para a análise de MS/MS.
3. Construção de banco de dados
<ol><li>Busca por compostos fenólicos, metabólitos fenólicos ou outros compostos de interesse na literatura científica.</li>
	<li>Abra o software de gerenciamento de banco de dados incluído no sistema UPLC. Selecione | de arquivos Nova biblioteca composta de banco de dados pessoal (PCDL) | Criar novo PCDL. Selecione o tipo de PCDL: Metabolômica LC/MS. Defina um nome para o PCDL. Em seguida, selecione Criar.</li>
	<li>Na barra de ferramentas, selecione PCDL e, em seguida, a opção Permitir a edição . Em seguida, clique no botão Encontrar compostos . NOTA: Por se trata de um novo PCDL, os resultados da tabela estarão vazios. Isso mudará assim que novos compostos forem adicionados ao PCDL.<ol>
<li>Adicione compostos à biblioteca de compostos especializados do banco de dados pessoal copiando-os da biblioteca geral do instrumento. Abra o banco de dados existente do instrumento incluído no software de gerenciamento de banco de dados. Clique no botão Encontrar compostos. Na opção de pesquisa Única , insira os critérios de pesquisa compostos para encontrar o composto de interesse. NOTA: Os compostos podem ser encontrados pelo nome, fórmula molecular, massa exata e tempo de retenção.</li>
		<li>Na tabela de resultados compostos, selecione o composto de juros. Para selecionar mais de um composto, clique no primeiro composto, segure a tecla CTRL e clique em cada composto de interesse. Em seguida, clique com o botão direito do mouse em todos os compostos destacados e selecione Apêndice para PCDL.</li>
		<li>Na nova janela, pesquise e selecione o arquivo especializado de banco de dados pessoal. Marque as caixas Inclua espectros para compostos se presentes e Inclua informações de mobilidade de íons para compostos, se presente. Clique no botão Anexar . Na nova caixa de diálogo, selecione Sim para verificar os novos compostos adicionados. Selecione Não para continuar procurando por mais compostos de interesse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se os compostos de interesse não estiverem disponíveis na biblioteca geral do instrumento, adicione novos compostos manualmente.<ol>
<li>Abra o banco de dados pessoal especializado. Uma vez aberto, siga o Passo 3.3. Selecione a opção Editar compostos . Clique no botão Adicionar novo .</li>
		<li>Na parte superior da janela, complete as informações para o novo composto. Preencha a fórmula, nome, nome IUPAC, número CAS, ID Chemspider e outros identificadores.</li>
		<li>Use as informações disponíveis nas bibliotecas online gratuitas (Chemspider, PubChem e Phenol Explorer) para preencher as informações para o novo composto de interesse. Uma vez terminado, clique no botão Salvar como novo para salvar as novas informações do composto no banco de dados pessoal especializado. NOTA: Ao adicionar informações de bibliotecas gratuitas, certifique-se de incluir as informações do composto sem a presença de íons de cloreto ou iodeto. Isso pode modificar a massa exata e a fórmula molecular do composto de interesse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita o processo com todos os compostos de interesse para concluir o banco de dados pessoal especializado.</li>
</ol>4. Análise de dados
<ol><li>Utilize o software qualitativo do instrumento para identificar os compostos fenólicos e metabólitos fenólicos presentes nas amostras.</li>
	<li>Abra o arquivo de amostra. No painel cromatograma, selecione Definir Cromatogramas e extrair o cromatógrama de íon total (TIC), o íon-cromatgrama extraído de MS (EIC) e o EIC de MS/MS. Selecione a opção de cromatograma integrado.</li>
	<li>No painel Encontrar compostos , selecione Encontrar por Opções de Fórmula. Na nova janela, selecione A Fonte de Fórmula e, em seguida, a opção Banco de Dados/Biblioteca . Encontre o banco de dados pessoal criado anteriormente e clique em Abrir.</li>
	<li>Selecione a opção Formula Matching e defina uma tolerância de correspondência em massa de 5 partes por milhão (ppm). NOTA: Uma tolerância de correspondência diferente das massas pode ser definida em 10 ppm; essa diferença depende do espectrômetro de massa utilizado.</li>
	<li>Selecione a opção Íons Negativos e selecione apenas a caixa de diálogo -H . Na opção Resultados , marque o Extrato EIC, Extraia espectro limpo, extraia espectro bruto e inclua caixas de diálogo estrutura.</li>
	<li>Selecione a opção Filtros de resultado . Mark Warn se o placar for e definir a pontuação em 80,00%. Mark Não corresponde se o placar for e definir a pontuação em 75,00%. NOTA: As pontuações de correspondência/não podem ser alteradas para valores mais baixos, se necessário. Isso reduzirá a precisão da identificação.</li>
	<li>Clique no Find Compounds by Formula para identificar compostos de interesse na amostra.</li>
</ol>

<ol><li>Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+incidence%2C+and+clinical+impact+of+sarcopenia%3A+facts%2C+numbers%2C+and+epidemiology-update+2014%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cachexia%2C+Sarcopenia+and+Muscle%22%5BJournal%5D)">Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).</li>
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<li>Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bebida+adicionada+con+Brosimum+alicastrum+sw.%3A+Una+alternativa+para+requerimientos+dietarios+especiales%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Salud+P%C3%BAblica+y+Nutrici%C3%B3n%22%5BJournal%5D)">Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales.</a> Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).</li>
<li>Rodríguez-Tadeo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionality+of+bread+and+beverage+added+with+brosimum+alicastrum+sw.+Seed+flour+on+the+nutritional+and+health+status+of+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22Foods%22%5BJournal%5D)">Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly.</a> Foods. 10 (8), 1-21 (2021).</li>
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</ol>

Todos os autores não declaram conflito de interesses.

A identificação e quantificação dos fitoquímicos bioativos que são absorvidos após o consumo de um suplemento alimentar ou alimentar são cruciais para demonstrar e compreender os benefícios para a saúde desses compostos e dos alimentos que os contêm. No presente trabalho, foi desenvolvido o método UPLC-MS/MS, voltado apenas para a identificação dos principais compostos fenólicos e seus metabólitos que aumentaram na concentração no plasma após uma intervenção nutricional de 30 dias com dois produtos alimentícios especialm...

Sarcopenia é um transtorno esquelético progressivo relacionado à perda acelerada de músculos na população idosa. Essa condição aumenta o risco de quedas e leva a atividades limitadas da vida diária. A sarcopenia está presente em cerca de 5%-10% das pessoas com mais de 65 anos e cerca de 50% das pessoas com 80 anos ou mais de idade1. Nenhum medicamentos específicos foi aprovado para o tratamento da sarcopenia, por isso a prevenção com atividade física e uma dieta bem equilibrada é importante1,2. Intervenções nutricionais com alimentos especialmente formulados enriquecidos com proteína leiteira e aminoácidos essenciais têm mostrado resultados positivos na prevenção da sarcopenia2. Em outros estudos, os autores incluíram vitaminas e antioxidantes, como vitamina E e isoflavonas, na dieta, aumentando os benefícios para o ganho muscular na cintura e nos quadris3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) é uma árvore que cresce nas regiões tropicais mexicanas; tem sido consumida por culturas maias devido ao seu alto valor nutricional4. É uma boa fonte de proteínas, fibras, minerais e antioxidantes fenólicos, como o ácido clorogênico5. Como pode ser moído em pó e usado em produtos de panificação ou consumidos em bebidas, estudos recentes têm avaliado a incorporação da farinha de sementes de Ramón (RSF) em diferentes alimentos para melhorar seu valor nutricional. Uma bebida com sabor de cappuccino suplementada pela RSF foi formulada, que era rica em fibras alimentares e tinha mais de 6 g de proteína por porção, e era altamente aceita pelos consumidores; assim, considerou-se uma alternativa potencial para atender aos requisitos alimentares especiais6. Em um estudo de acompanhamento, a RSF também foi usada para formular um muffin e uma nova bebida rica em proteínas, fibras alimentares, micronutrientes e antioxidantes fenólicos. O muffin e a bebida foram utilizados em uma intervenção dietética para idosos, que consumiram ambos os produtos duas vezes por dia durante 30 dias. Após esse período, o estado nutricional e sarcopenico dos participantes melhorou, e o teor fenólico total do plasma aumentou7. No entanto, a determinação dos compostos fenólicos totais no plasma foi realizada por um método espectrofotométrico, de modo que a identificação dos compostos fenólicos reais que foram absorvidos não foi possível; além disso, este método não é completamente específico para compostos fenólicos, de modo que alguma superestimação pode ocorrer8.
A identificação e quantificação dos compostos fenólicos que são absorvidos após o consumo de alimentos ricos nesses antioxidantes é uma tarefa difícil, mas é necessária para demonstrar a atividade biológica desses fitoquímicos. A biodisponibilidade da maioria dos compostos fenólicos é baixa; menos de 5% deles podem ser encontrados sem transformação estrutural no plasma. Os compostos fenólicos passam por várias biotransformações, como metilação, sulfonação ou glucuronidação, que são realizadas por enterócitos e hepatócitos9. Compostos fenólicos também são biotransformados pela microbiota em catabólitos bacterianos que podem exercer seus efeitos benéficos no corpo após serem absorvidos pelo plasma10. Por exemplo, o ácido fenilacetic é um produto da transformação bacteriana de flavonoides e proanthociaanidinas oligomerícos, que podem inibir até 40% da adesão de bactérias (Escherichia coli) no trato urinário após o consumo de cranberry11.
A diversidade estrutural de compostos fenólicos de ocorrência natural, somada à diversidade de seus metabólitos e sua baixa biodisponibilidade, torna sua identificação no plasma ainda mais desafiadora. O perfil metabolômico, utilizando plataformas de análise espectroscópica, como ressonância magnética nuclear (RMN) e espectroscopia de massa tandem (MS/MS), é provavelmente a melhor abordagem para alcançar esse objetivo; infelizmente, o equipamento não é facilmente acessível, e o desenvolvimento de protocolos de análise ainda é limitado12. Vários estudos têm relatado a ESM/MS juntamente com um sistema de separação (como a cromatografia líquida) como estratégia para reduzir a complexidade dos espectros de massa em estudos metabolômicos. A recente introdução de métodos de separação de cromatografia líquida de alto desempenho (UPLC) reduziu o tempo de análise e aumentou a resolução e sensibilidade em comparação com os protocolos líquidos convencionais de alto desempenho, de modo que os sistemas UPLC-MS/MS têm sido rapidamente amplamente aceitos pela comunidade de metabolômicas analítica13. Dessa forma, alguns estudos investigaram metabólitos fenólicos e detectaram derivados colacuronidados de ácido cafeína, quercetina e ácido ferúlico, bem como derivados sulfoados de ácido seringa e vanlícita no plasma de indivíduos após a ingestão de cranberry14. Protocolos anteriores têm a intenção de encontrar compostos fenólicos e metabólitos fenólicos em biofluidos como plasma. Estes protocolos foram baseados na identificação e quantificação por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) acoplado a um detector UV-vis15. No entanto, tais protocolos exigem o uso de padrões autênticos para avaliar a identificação absoluta e quantificação precisa. Uma ampla gama de estudos identificou os metabólitos mais comuns em biofluidos (formas sulfotadas, glucuronidas e metiladas) por UPLC-MS e UPLC-MS/MS; no entanto, grande parte dos metabólitos bacterianos não foi relatada devido à falta de bancos de dados que contenham suas informações completas16. A identificação metabólica é complicada pelo custo e disponibilidade comercial das normas metabólitos. Portanto, a melhor estratégia pode ser a análise metabólica MS/MS sem alvo ou semi-direcionada, que se baseia no uso de informações de características moleculares (m/z, massa exata monoisotópica, distribuição isotópica e padrão de fragmentação) para determinar a identidade química e compara-a com bancos de dados on-line livremente disponíveis que contêm metabólitos polifenóis identificados em biofluóides após o consumo de polipólitos-richts12 . As bases de dados mais importantes utilizadas em estudos UPLC-MS/MS para identificação de compostos fenólicos e seus metabólitos são o Human Metabolome Database (HMDB), LipidBlast Library, METLIN Library e outros bancos de dados complementares, como PubChem, ChemSpider e Phenol Explorer17.
No presente estudo, foi desenvolvido um método uplc-MS/MS semi-direcionado para analisar as amostras de plasma do grupo de idosos envolvidos no estudo de consumo de muffin e bebidas contendo RSF7. Dados de diferentes bancos de dados online gratuitos de metabólitos de plasma foram coletados e integrados em um banco de dados especializado. Este banco de dados pode ser acessado automaticamente pelo software do equipamento para identificar os metabólitos polifenólicos nas cinco amostras de plasma antes e depois da intervenção nutricional de 30 dias. Isso é feito para identificar os principais compostos fenólicos, ou seus metabólitos, que são absorvidos dos alimentos funcionais especialmente formulados projetados para a prevenção da sarcopenia.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile</td><td>Tedia</td><td>Al1129-001</td><td>LC Espectrometria de massa</td></tr><tr><td>Autosampler</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4226A</td><td>1290 Infinity series</td></tr><tr><td>C18 coluna de fase reversa</td><td>Agilent Technologies</td><td>959757-902</td><td>Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 &mu; m; Centrífuga HD de resolução rápida</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5452000018</td><td>Mini Spin; Rotor F-45-12-11</td></tr><tr><td>Compartimento da coluna com termostato</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1316C</td><td>1290</td></tr><tr><td>Detector de matriz de diodos da série Infinity (UV-Vis)</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4212B</td><td>1260 Fonte</td></tr><tr><td>de ionização por eletrospray</td> da série <td>Infinity Agilent Technologies</td><td>G3251B</td><td>Pulverizador duplo Fonte ESI</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>J.T. Baker</td><td>0128-02</td><td>Reagente Baker, ACS</td></tr><tr><td>Mass Hunter Aquisição de Dados</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3338AA</td><td></td></tr><tr><td>Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3338AA</td><td></td></tr><tr><td>Mass Hunter Análise Qualitativa</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3338AA</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga</td><td>Marca</td><td>BR780546</td><td>Tubo de microcentrífuga, 2 mL com tampa</td></tr><tr><td>Pure etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-1L</td><td>200 prova, para biologia molecular</td></tr><tr><td>Q-TOF LC/MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>G6530B</td><td>6530 Bomba</td></tr><tr><td>Quaternária</td> de Massa Precisa <td>Agilent Technologies</td><td>G4204A</td><td>1290 Série Infinity</td></tr><tr><td>Filtro de seringa</td><td>Thermo Scientific</td><td>44514-NN</td><td>17 mm, 0,45 &mu; m, membrana de nylon</td></tr><tr><td>Termostato</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1330B</td><td>1290 Frasco da série Infinity</td></tr><tr><td></td><td>Agilent Technologies</td><td>8010-0199</td><td>Âmbar, silicone vermelho PFTE 2 mL com tampa de rosca e tampas azuis</td></tr><tr><td>Inserção do frasco</td><td>Agilent Technologies</td><td>5183-2089</td><td>Inserção do frasco 200 &mu; L para a abertura 2mL padrão,</td></tr><tr><td>espectrometria maciça</td> cônica<td>de Tedia</td><td></td><td>WL2212-001</td> LC da água</tr></tbody></table>

cromatografia ultra-alta-performance semi-direcionada acoplada à análise de espectrometria de massa de metabólitos fenólicos no plasma de idosos adultos

Semi-Targeted Ultra-High-Performance Chromatography Coupled to Mass Spectrometry Analysis of Phenolic Metabolites in Plasma of Elderly Adults

Um grupo de 23 idosos recebeu refeições funcionais (uma bebida e um muffin) especialmente formuladas para a prevenção da sarcopenia (perda de massa muscular relacionada à idade). Amostras de plasma foram colhidas no início da intervenção e após 30 dias de consumo das refeições funcionais. Foi realizada uma cromatografia ultra-alta performance semi-direcionada juntamente com a análise de massa tandem (UPLC-MS/MS) para identificar compostos fenólicos e seus metabólitos. As proteínas plasmáticas foram precipitadas com etanol e as amostras foram concentradas e resuspendidas na fase móvel (acetonitrilo 1:1: água) antes da injeção no instrumento UPLC-MS/MS. A separação foi realizada com uma coluna de fase inversa C18 , e os compostos foram identificados utilizando sua massa experimental, distribuição isotópica e padrão de fragmento. Os compostos de juros foram comparados aos dos bancos de dados e da biblioteca interna sem-direcionada. Os resultados preliminares mostraram que os principais metabólitos identificados após a intervenção foram ácido fenídrico, glicacitina, ácido 3-hidroxifenilvalerico e gomisina M2.

O processo passo-a-passo para a identificação de metabólitos fenólicos através da análise uplc-MS/MS semi-direcionada, em modo negativo, de amostras de plasma é retratado na Figura 2. Primeiro, o cromatógrama de íon total (TIC) do extrato de fenólicos plasmáticos (obtido após precipitação proteica da amostra de plasma total) foi obtido através do software qualitativo do instrumento. Em seguida, foi utilizado o cromatógrama de íon extraído, e o padrão exato de massa e fr...

O objetivo deste protocolo é detectar metabólitos fenólicos no plasma usando um método de espectrometria de massa cromatografia-masscamo semi-direcionada.

Cromatografia ultra-alta-performance semi-direcionada acoplada à análise de espectrometria de massa de metabólitos fenólicos no plasma de idosos adultos

A group of 23 elderly persons was given functional meals (a beverage and a muffin) specially formulated for the prevention of sarcopenia (age-related loss ...

O objetivo deste protocolo é detectar metabólitos fenólicos no plasma por um método UPLC-MS/MS semi-direcionado. As proteínas plasmáticas foram precipitadas com etanol e amostras concentradas, e reinsupedas na fase móvel, antes da injeção no equipamento UPLC. Os compostos foram identificados por meio de uma biblioteca semi-direcionada montada no laboratório, utilizando o gerente de PCDL para metabolômica, software e diferentes bancos de dados online gratuitos.Implementamos uma intervenção nutricional com uma formulação de muffin e bebidas com farinha de sementes de alicastrum de brosimum. Ao final da intervenção, o estado nutricional e sarcopênico dos participantes foi melhorado, e o teor fenólico total do plasma foi aumentado. Mas precisamos identificar quais compostos fenólicos foram absorvidos e contribuíram para o efeito positivo.A identificação e quantificação dos compostos fenólicos que são absorvidos após o consumo de alimentos ricos nesses antioxidantes é tarefa difícil, mas necessária, se for para demonstrar atividade biológica desses fitoquímicos. A biodisponibilidade da maioria dos componentes fenólicos é baixa, além disso, menos de 5% deles entram sem transformação estrutural em plasma. A maioria passa por várias biotransformações, como metilação, sulfonação ou glucuronidação.Uma ampla gama de estudos identificou os metabólitos mais comuns em biofluidos por UPLC-MS e UPLC-MS/MS. No entanto, grande parte do metabólito da bactéria não é relatado à falta de bancos de dados que contenham suas informações completas. A identificação metabólica é complicada pelo custo e disponibilidade comercial das normas metabólitos.Portanto, a melhor estratégia pode ser a análise metabólica MS/MS sem alvo ou semi-direcionada. Esta análise baseia-se no uso de informações de características moleculares, massa para taxa de carga de massa exata monoisotópica, distribuição isotópica e padrão de fragmentação. Para determinar a identidade química e compará-la com bancos de dados on-line disponíveis gratuitamente que contêm metabólitos polifenóis identificados em biofluidos após o consumo de dietas ricas em polifenóis.No presente estudo, desenvolvemos um método uplc-MS/MS semi-direcionado para analisar as amostras de plasma de um grupo de idosos envolvidos em uma intervenção nutricional. Armazene amostras de plasma a menos 80 graus Celsius até a análise. Descongele amostras de plasma à temperatura ambiente por 15 minutos ou a 37 Celsius por cinco minutos.Coloque 200 microliters de amostra de plasma em um microtubo de dois milímetros e misture com 1000 microliters de etanol puro. Amostra de plasma de vórtice por 30 segundos. Amostra de centrífuga a 6.580 força centrífuga por cinco minutos.Após a centrifugação, colete o supernatante com uma micropipette ou pipeta Pasteur e coloque-o em um novo microtubo. Reserve o supernatante. Misture uma pelota com 1000 microliters etanol puro, vértice por 30 segundos e, em seguida, centrífuga nas mesmas condições.Colete o supernatante e misture com o primeiro supernante. Remova o etanol da amostra usando nitrogênio puro a 135 psi. Mantenha a agulha a um centímetro de distância do topo do microtubo para evitar a perda da amostra e lave até que uma amostra esteja seca.Resuspend amostras secas em 100 microliters de um é para uma mistura de acetonitrilo com água. Filtre através de uma membrana de seringa de nylon de 45 micro diretamente em uma micro inserção de frasco HPLC Insira três microliters de amostra no UPLC equipados com uma coluna de fase reversa C 18. Coloque a temperatura do autosampler em 20 Celsius e o termostato da coluna a 25 Celsius.Injete cada amostra em triplicado. Use ácido fórmico de 0,1% na água como solvente A, e 100% acetonitrilo como solvente B.Coloque a taxa de fluxo em 0,4 milímetros por minuto e um programa de gradiente da seguinte forma, de zero a um minuto 10%B, de um a quatro minutos 30%B, de quatro a seis minutos 38%B, de seis a oito minutos 60% B, oito a 8,5 minutos 60% B, 8,5 a nove minutos 10%B. Coloque o espectrômetro de massa em ionização de modo negativo.Use nitrogênio como gás de secagem a 300 Celsius e vaze a 13 litros por minuto. Coloque a pressão do nebulizador em 30 psi. Coloque uma tensão capilar a 4.000 volts, tensão fragmentor a 175 volts e tensão skimmer a 65 volts.Escaneie as massas entre 100 e 1100 m/z e para a espectrometria de massa, escaneie massas entre 50 a 1000 m/z. Defina a aquisição de dados no modo MS/MS automático. Utilize a seguinte massa de referência, 119.036 e 966.0007.Busca por compostos fenólicos, metabólitos fenólicos e outros compostos de interesse pela literatura científica. Abra o software de gerenciamento de banco de dados incluído no sistema UPLC. Selecione arquivo e selecione nova biblioteca de compostos de banco de dados pessoal, PCDL.Em seguida, selecione, crie novo PCDL. Selecione o tipo de metabolômica PCDL LC/MS. Defina o nome para PCDL.Em seguida, selecione criar. Na barra de ferramentas, selecione PCDL e, em seguida, a opção permitir edição. Em seguida, clique no botão encontrar compostos.Os compostos podem ser adicionados à biblioteca pessoal de duas maneiras, primeiro copiando-os da biblioteca geral do instrumento. Para isso, abra os instrumentos existentes no banco de dados incluídos na gestão de dados até agora. Clique no botão encontrar compostos.Na única opção de pesquisa, insira os critérios de pesquisa compostos para encontrar o composto de interesse. Na tabela de resultados compostos, selecione o composto de juros. Para selecionar mais de um composto, clique no primeiro composto e, em seguida, segure a tecla CTRL e, em seguida, clique em cada composto de interesse.Em seguida, clique com o botão direito do mouse em todos os compostos destacados e selecione Apêndice para PCDL. Na nova janela, pesquise e selecione o arquivo especializado de banco de dados pessoal. Marque a caixa inclua espectros para compostos se presentes.Clique no botão Anexar. Na nova caixa de diálogo, selecione Sim para verificar os novos compostos adicionados. Selecione Não para continuar procurando por mais compostos de interesse.Em segundo lugar, novos compostos podem ser adicionados manualmente se não estiverem disponíveis na biblioteca geral do instrumento. Para isso aberto, o banco de dados pessoal especializado. Uma vez aberto, selecione PCDL e, em seguida, a opção permitir edição.Selecione a opção compostos de edição. Clique no novo botão adicionar. Na parte superior da janela, complete as informações do novo composto.Preencha a fórmula, nome, nome IUPAC, número CAS, ID Chemspider e outros identificadores. Usando informações disponíveis nas bibliotecas online gratuitas, Chemspider, PubChem e Phenol Explorer para preencher as informações do novo composto de interesse. Uma vez terminado, clique no botão salvar como novo para salvar as novas informações do composto no banco de dados pessoal especializado.Repita o processo com todos os compostos de interesse para concluir o banco de dados pessoal especializado. Use o software qualitativo do instrumento para identificar compostos fenólicos e metabólitos fenólicos. Abra o arquivo de amostra.No painel Cromatógrama, selecione definir Cromatógramas e extrair o cromatógrama de íon total TIC, íon-cromatgrama extraído de MS EIC e EIC de MS/MS. Selecione a opção de cromatograma de íon integrado. No painel encontrar compostos, selecione encontrar por opções de fórmula.Na nova janela, selecione a fonte de fórmula e, em seguida, a opção de biblioteca de corte de banco de dados. Encontre o banco de dados pessoal criado anteriormente e clique em aberto. Selecione a opção de correspondência de fórmulas e defina uma tolerância de correspondência em massa de cinco partes por milhão, ppm.Selecione a opção íons negativos e selecione apenas a caixa de diálogo menos H. Na opção de resultados, marque o extrato de EIC, extraia espectro limpo, extraia espectro bruto e inclui caixas de diálogo estruturadas. Selecione a opção filtros de resultados.E então marque avisar se a pontuação for, em seguida, definir a pontuação match em 80%Em seguida, a marca não corresponder se a pontuação é e definir a pontuação em 75%Em seguida, clique nos compostos de encontrar por fórmula para identificar compostos de interesse na amostra. O processo passo a passo para a identificação de metabólitos fenólicos através da análise semi-direcionada UPLC MS/MS de amostras de plasma é mostrado na próxima figura. Primeiro, o total de íon-cromatgrama foi obtido utilizando-se um banco de dados PCDL auto-criado que continha 645 compostos fenólicos e seus metabólitos, obtidos a partir de bancos de dados on-line gratuitos.Em seguida, o padrão de extração de íon-cromatógrafo e fragmentação, ou os íons com menos de cinco ppm de massa, foram obtidos tolerância de correspondência. Finalmente, a distribuição isotópica dos picos detectados foi comparada com a dos compostos teóricos. A partir desta análise, foram identificados 25 compostos fenólicos e metabólitos nas amostras de plasma.Para avaliar a eficácia do método de desenho na identificação dos compostos fenólicos absorventes ou seus metabólitos, foram analisadas cinco amostras dos participantes do estudo obtidas anteriormente e após a intervenção de 30 dias. A abundância relativa de cada composto foi calculada dividindo a área sob a curva após o tratamento por AUC antes do tratamento. A tabela quatro mostra a lista de 12 compostos de fenol que mostraram um aumento no plasma após o consumo de 30 dias da farinha de alicastrum de brosimum contendo alimentos.O ácido fenílaceso foi apenas metabólito encontrado consistentemente em maior concentração após o tratamento. Glycitin, uma isoflavona glicosilada, e três ácidos hidroxifenilvalericos aumentaram em três das cinco amostras, mas diminuíram nas outras duas. Gomisin M2, um lignan, foi detectado em três das cinco amostras somente após a intervenção nutricional.Os outros compostos fenólicos e metabólitos foram encontrados apenas em uma amostra e somente após o tratamento. O método desenvolvido presente, mostra que na maioria das partes foi bem adequado para o objetivo para o qual foi criado. A amostra por tratamento foi simples e eficaz.Foram realizadas separação DA UPLC e identificação semi-direcionada de metabólitos fenólicos.

semi-targeted-ultra-high-performance-chromatography-coupled-to-mass

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Cromatografia ultra-alta-performance semi-direcionada acoplada à análise de espectrometria de massa de metabólitos fenólicos no plasma de idosos adultos

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