Name: Cromatografia ultra-alta-performance semi-direcionada acoplada à análise de espectrometria de massa de metabólitos fenólicos no plasma de idosos adultos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Aprenda a detectar metabólitos fenólicos no plasma por UPLC-MS/MS semi-direcionada em idosos. Este método identifica compostos absorvidos após intervenção nutricional com Brosimum alicastrum.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores agradecem o apoio financeiro da CONACYT, México (CB- 2016-01-286449) e UACJ-PIVA (Projetos 313-17-16 e 335-18-13). A OAMB agradece à CONACYT por sua bolsa de doutorado. O suporte técnico do escritório de Produção Multimídia da UACJ é reconhecido com gratidão.

As amostras de plasma utilizadas neste protocolo foram coletadas em estudo prévio seguindo todas as diretrizes éticas e aprovadas pelo Comitê de Ética Institucional e Bioética (CIEB-2018-1-37) da Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. O protocolo completo para a extração e identificação dos compostos fenólicos e metabólitos no plasma pela UPLC-MS/MS está representado na Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63164/63164fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática da extração e identificação de compostos fenólicos e metabólitos no plasma pelo método UPLC-MS/MS semi-direcionado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63164/63164fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
1. Preparação da amostra
<ol><li>Armazene as amostras de plasma a -80 °C até a análise.</li>
	<li>Descongele as amostras de plasma à temperatura ambiente por 15 minutos. NOTA: As amostras podem ser colocadas em banho-maria a 37 °C para acelerar o processo (5 min).</li>
	<li>Coloque 200 μL de amostra de plasma em um microtubo de 2 mL e misture com 1.000 μL de etanol puro. Vórtice a amostra de plasma para 30 s. NOTA: Use sempre luvas ao trabalhar com amostras de plasma.</li>
	<li>Centrifugar a amostra a 6.580 x g por 5 min. Após a centrifugação, colete o supernatante com uma micropipette ou pipeta Pasteur e coloque-o em um novo microtubo. Armazene o supernatante a 4 °C.</li>
	<li>Misture a pelota da etapa anterior com 1.000 μL de 100% etanol, vórtice para 30 s e, em seguida, centrífuga a 6.580 x g por 5 min. NOTA: A pelota é fortemente embalada e precisa ser bem resuspended bem para garantir o contato entre a amostra e o etanol puro. Recomenda-se o uso de uma micropipette para lavar a pelota com etanol.</li>
	<li>Após a centrifugação, colete o supernante e misture com o sobrenatante previamente obtido a partir da Etapa 1.4. em um microtubo de 2 mL.</li>
	<li>Remova o etanol da amostra usando nitrogênio puro (99,997%) a 135 psi. Mantenha a agulha a 1 cm de distância da parte superior do microtubo para evitar a perda da amostra e lave até que a amostra esteja seca. Não é necessário calor para evaporar o etanol. NOTA: O fluxo de nitrogênio deve ser baixo para evitar a perda de amostras. Uma vez que o etanol esteja seco, mantenha o fluxo de nitrogênio por pelo menos 5 minutos para garantir o ressecamento da amostra. O protocolo pode ser pausado neste momento; as amostras devem ser armazenadas a -20 °C. Evite armazenar as amostras por mais de 12 h.</li>
	<li>Resuspenque as amostras secas em 100 μL de uma mistura de acetonitrilo: água em uma proporção de 50:50 (v:v).</li>
	<li>Filtre a amostra através de uma membrana de seringa de nylon de 0,45 μm diretamente em uma micro inserção de frasco HPLC. NOTA: As amostras do frasco podem ser armazenadas a -20 °C antes da análise. Armazene as amostras por não mais do que 8h. Recomenda-se injetar as amostras no sistema UPLC logo após a filtragem.</li>
</ol>2. Análise UPLC-MS/MS
<ol><li>Injete 3 μL de amostra em um UPLC equipado com uma coluna de fase reversa C18 (50 mm x 2,1 mm; 1,8 μm). Coloque a temperatura do autosampler a 20 °C e o termostato da coluna a 25 °C. Injete cada amostra em triplicado.</li>
	<li>Use 0,1% (v:v) ácido fórmico na água como solvente A, e 100% acetonitrilo como solvente B. Definir a taxa de fluxo em 0,4 mL/min e um programa gradiente da seguinte forma: 0-1 min 10% B, 1-4 min 30% B, 4-6 min 38% B, 6-8 min 60% B, 8-8,5 min 60% B, 8,5-9 min 10% B (Tabela 1).</li>
	<li>Ajuste o espectrômetro de massa para ionização de modo negativo. Use nitrogênio como gás de secagem a 340 °C e uma vazão de 13 L/min. Coloque a pressão do nebulizador em 60 psi. Coloque a tensão capilar em 4.000 V, a tensão fragmentor a 175 V e a tensão skimmer a 65 V. Use energia de colisão a 20 V (Tabela 2).</li>
	<li>Escaneie as massas entre 100-1100 massas para taxa de carga (m/z) e, para MS/MS, escaneie massas entre 50-1000 m/z (Tabela 2). Defina a aquisição de dados para o modo MS/MS automático. Utilize a seguinte massa de referência: 119.036 e 966.0007.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tempo (min)</td>
			<td>Solvente A (0,1 % ácido fórmico na água HPLC)</td>
			<td>Solvente B (100 % acetonitrilo)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 a 1</td>
			<td>90</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 a 4</td>
			<td>70</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 a 6</td>
			<td>62</td>
			<td>38</td>
		</tr>
<tr>
<td>6 a 8</td>
			<td>40</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>8 a 8,5</td>
			<td>40</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>8,5 a 9</td>
			<td>90</td>
			<td>10</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Gradiente de fase móvel utilizado para a separação de compostos fenólicos por UPLC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Modo de ionização</td>
			<td>Negativo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gás de secagem</td>
			<td>Nitrogênio a 340 °C, vazão 13 L/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pressão de nebulizador</td>
			<td>60 psi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tensão capilar</td>
			<td>175 V</td>
		</tr>
<tr>
<td>Massas de varredura de MS</td>
			<td>100-1100 m/z</td>
		</tr>
<tr>
<td>Massas de varredura MS/MS</td>
			<td>50-1000 m/z</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Parâmetros de ionização para a análise de MS/MS.
3. Construção de banco de dados
<ol><li>Busca por compostos fenólicos, metabólitos fenólicos ou outros compostos de interesse na literatura científica.</li>
	<li>Abra o software de gerenciamento de banco de dados incluído no sistema UPLC. Selecione | de arquivos Nova biblioteca composta de banco de dados pessoal (PCDL) | Criar novo PCDL. Selecione o tipo de PCDL: Metabolômica LC/MS. Defina um nome para o PCDL. Em seguida, selecione Criar.</li>
	<li>Na barra de ferramentas, selecione PCDL e, em seguida, a opção Permitir a edição . Em seguida, clique no botão Encontrar compostos . NOTA: Por se trata de um novo PCDL, os resultados da tabela estarão vazios. Isso mudará assim que novos compostos forem adicionados ao PCDL.<ol>
<li>Adicione compostos à biblioteca de compostos especializados do banco de dados pessoal copiando-os da biblioteca geral do instrumento. Abra o banco de dados existente do instrumento incluído no software de gerenciamento de banco de dados. Clique no botão Encontrar compostos. Na opção de pesquisa Única , insira os critérios de pesquisa compostos para encontrar o composto de interesse. NOTA: Os compostos podem ser encontrados pelo nome, fórmula molecular, massa exata e tempo de retenção.</li>
		<li>Na tabela de resultados compostos, selecione o composto de juros. Para selecionar mais de um composto, clique no primeiro composto, segure a tecla CTRL e clique em cada composto de interesse. Em seguida, clique com o botão direito do mouse em todos os compostos destacados e selecione Apêndice para PCDL.</li>
		<li>Na nova janela, pesquise e selecione o arquivo especializado de banco de dados pessoal. Marque as caixas Inclua espectros para compostos se presentes e Inclua informações de mobilidade de íons para compostos, se presente. Clique no botão Anexar . Na nova caixa de diálogo, selecione Sim para verificar os novos compostos adicionados. Selecione Não para continuar procurando por mais compostos de interesse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se os compostos de interesse não estiverem disponíveis na biblioteca geral do instrumento, adicione novos compostos manualmente.<ol>
<li>Abra o banco de dados pessoal especializado. Uma vez aberto, siga o Passo 3.3. Selecione a opção Editar compostos . Clique no botão Adicionar novo .</li>
		<li>Na parte superior da janela, complete as informações para o novo composto. Preencha a fórmula, nome, nome IUPAC, número CAS, ID Chemspider e outros identificadores.</li>
		<li>Use as informações disponíveis nas bibliotecas online gratuitas (Chemspider, PubChem e Phenol Explorer) para preencher as informações para o novo composto de interesse. Uma vez terminado, clique no botão Salvar como novo para salvar as novas informações do composto no banco de dados pessoal especializado. NOTA: Ao adicionar informações de bibliotecas gratuitas, certifique-se de incluir as informações do composto sem a presença de íons de cloreto ou iodeto. Isso pode modificar a massa exata e a fórmula molecular do composto de interesse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita o processo com todos os compostos de interesse para concluir o banco de dados pessoal especializado.</li>
</ol>4. Análise de dados
<ol><li>Utilize o software qualitativo do instrumento para identificar os compostos fenólicos e metabólitos fenólicos presentes nas amostras.</li>
	<li>Abra o arquivo de amostra. No painel cromatograma, selecione Definir Cromatogramas e extrair o cromatógrama de íon total (TIC), o íon-cromatgrama extraído de MS (EIC) e o EIC de MS/MS. Selecione a opção de cromatograma integrado.</li>
	<li>No painel Encontrar compostos , selecione Encontrar por Opções de Fórmula. Na nova janela, selecione A Fonte de Fórmula e, em seguida, a opção Banco de Dados/Biblioteca . Encontre o banco de dados pessoal criado anteriormente e clique em Abrir.</li>
	<li>Selecione a opção Formula Matching e defina uma tolerância de correspondência em massa de 5 partes por milhão (ppm). NOTA: Uma tolerância de correspondência diferente das massas pode ser definida em 10 ppm; essa diferença depende do espectrômetro de massa utilizado.</li>
	<li>Selecione a opção Íons Negativos e selecione apenas a caixa de diálogo -H . Na opção Resultados , marque o Extrato EIC, Extraia espectro limpo, extraia espectro bruto e inclua caixas de diálogo estrutura.</li>
	<li>Selecione a opção Filtros de resultado . Mark Warn se o placar for e definir a pontuação em 80,00%. Mark Não corresponde se o placar for e definir a pontuação em 75,00%. NOTA: As pontuações de correspondência/não podem ser alteradas para valores mais baixos, se necessário. Isso reduzirá a precisão da identificação.</li>
	<li>Clique no Find Compounds by Formula para identificar compostos de interesse na amostra.</li>
</ol>

<ol><li>Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+incidence%2C+and+clinical+impact+of+sarcopenia%3A+facts%2C+numbers%2C+and+epidemiology-update+2014%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cachexia%2C+Sarcopenia+and+Muscle%22%5BJournal%5D)">Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).</li>
<li>Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcopenia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Sarcopenia.</a> The Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).</li>
<li>Beaudart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrition+and+physical+activity+in+the+prevention+and+treatment+of+sarcopenia%3A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporosis+International%22%5BJournal%5D)">Nutrition and physical activity in the prevention and treatment of sarcopenia: systematic review.</a> Osteoporosis International. 28 (6), 1817-1833 (2017).</li>
<li>Ozer, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenolic+compositions+and+antioxidant+activities+of+Maya+nut+%28Brosimum+alicastrum%29%3A+Comparison+with+commercial+nuts%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Properties%22%5BJournal%5D)">Phenolic compositions and antioxidant activities of Maya nut (Brosimum alicastrum): Comparison with commercial nuts.</a> International Journal of Food Properties. 20 (11), 2772-2781 (2017).</li>
<li>Subiria-Cueto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brosimum+alicastrum+Sw.+%28Ram%C3%B3n%29%3A+An+alternative+to+improve+the+nutritional+properties+and+functional+potential+of+the+wheat+flour+tortilla%5BTitle%5D)+AND+%22Foods%22%5BJournal%5D)">Brosimum alicastrum Sw. (Ramón): An alternative to improve the nutritional properties and functional potential of the wheat flour tortilla.</a> Foods. 8 (12), 1-18 (2019).</li>
<li>Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bebida+adicionada+con+Brosimum+alicastrum+sw.%3A+Una+alternativa+para+requerimientos+dietarios+especiales%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Salud+P%C3%BAblica+y+Nutrici%C3%B3n%22%5BJournal%5D)">Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales.</a> Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).</li>
<li>Rodríguez-Tadeo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionality+of+bread+and+beverage+added+with+brosimum+alicastrum+sw.+Seed+flour+on+the+nutritional+and+health+status+of+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22Foods%22%5BJournal%5D)">Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly.</a> Foods. 10 (8), 1-21 (2021).</li>
<li>Muñoz-Bernal, ÓA., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuevo+acercamiento+a+la+interacci%C3%B3n+del+reactivo+de+Folin-Ciocalteu+con+az%C3%BAcares+durante+la+cuantificaci%C3%B3n+de+polifenoles+totales%5BTitle%5D)+AND+%22TIP+Revista+Especializada+en+Ciencias+Qu%C3%ADmico-Biol%C3%B3gicas%22%5BJournal%5D)">Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con azúcares durante la cuantificación de polifenoles totales.</a> TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 20 (2), 28-33 (2017).</li>
<li>Luca, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactivity+of+dietary+polyphenols%3A+The+role+of+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Bioactivity of dietary polyphenols: The role of metabolites.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 60 (4), 626-659 (2020).</li>
<li>Kawabata, K., Yoshioka, Y., Terao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+intestinal+microbiota+in+the+bioavailability+and+physiological+functions+of+dietary+polyphenols%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Role of intestinal microbiota in the bioavailability and physiological functions of dietary polyphenols.</a> Molecules. 24 (2), (2019).</li>
<li>de Llano, D. G., Moreno-Arribas, M. V., Bartolomé, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranberry+polyphenols+and+prevention+against+urinary+tract+Infections%3A+Relevant+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Cranberry polyphenols and prevention against urinary tract Infections: Relevant considerations.</a> Molecules. 25 (15), (2020).</li>
<li>Alsaleh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry%3A+A+guide+for+the+clinician%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+and+Experimental+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry: A guide for the clinician.</a> Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 9 (5), 597-606 (2019).</li>
<li>Wang, X., Sun, H., Zhang, A., Wang, P., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-performance+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry+as+a+sensitive+and+powerful+technology+for+metabolomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies.</a> Journal of Separation Science. 34 (24), 3451-3459 (2011).</li>
<li>Feliciano, R. P., Mills, C. E., Istas, G., Heiss, C., Rodriguez-Mateos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorption%2C+metabolism+and+excretion+of+cranberry+%28poly%29phenols+in+humans%3A+A+dose+response+study+and+assessment+of+inter-individual+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Absorption, metabolism and excretion of cranberry (poly)phenols in humans: A dose response study and assessment of inter-individual variability.</a> Nutrients. 9 (3), (2017).</li>
<li>Mateos, R., Goya, L., Bravo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+metabolism+of+hydroxycinnamic+acids+%28chlorogenic%2C+caffeic%2C+and+ferulic+acids%29+by+HepG2+cells+as+a+model+of+the+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the human liver.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (23), 8724-8732 (2006).</li>
<li>Rodriguez Lanzi,, Perdicaro, C., Antoniolli, D. J., Piccoli, A., Vazquez Prieto, M. A., Fontana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenolic+metabolites+in+plasma+and+tissues+of+rats+fed+with+a+grape+pomace+extract+as+assessed+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Phenolic metabolites in plasma and tissues of rats fed with a grape pomace extract as assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. , 28-33 (2018).</li>
<li>Hou, Y., He, D., Ye, L., Wang, G., Zheng, Q., Hao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+detection+and+identification+strategy+for+untargeted+metabolomics+based+on+UPLC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">An improved detection and identification strategy for untargeted metabolomics based on UPLC-MS.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113531(2020).</li>
<li>Nagy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+identification+of+dimethoxycinnamic+acids+in+human+plasma+after+coffee+intake+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (3), 491-497 (2011).</li>
<li>Marmet, C., Actis-Goretta, L., Renouf, M., Giuffrida, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+phenolic+acids+and+their+methylates%2C+glucuronides%2C+sulfates+and+lactones+metabolites+in+human+plasma+by+LC-MS%2FMS+after+oral+ingestion+of+soluble+coffee%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Quantification of phenolic acids and their methylates, glucuronides, sulfates and lactones metabolites in human plasma by LC-MS/MS after oral ingestion of soluble coffee.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 617-625 (2014).</li>
<li>McCord, J., Strynar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+per-and+polyfluorinated+chemical+species+with+a+combined+targeted+and+non-targeted-screening+high-resolution+mass+spectrometry+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Identifying per-and polyfluorinated chemical species with a combined targeted and non-targeted-screening high-resolution mass spectrometry workflow.</a> Journal of Visualized Experiments. 2019 (146), 1-15 (2019).</li>
<li>Muñoz-Bernal, ÓA., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytochemical+characterization+and+antiplatelet+activity+of+Mexican+red+wines+and+their+by-products%5BTitle%5D)+AND+%22South+African+Journal+of+Enology+and+Viticulture%22%5BJournal%5D)">Phytochemical characterization and antiplatelet activity of Mexican red wines and their by-products.</a> South African Journal of Enology and Viticulture. 42 (1), 77-90 (2021).</li>
<li>Muñoz-Bernal, ÓA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enriquecimiento+de+un+vino+tinto+con+un+extracto+de+compuestos+fen%C3%B3licos+provenientes+de+orujo+de+uva%3A+bioaccesibilidad%2C+an%C3%A1lisis+sensorial+y+respuesta+biol%C3%B3gica%5BTitle%5D)+AND+%22Universidad+Aut%C3%B3noma+de+Ciudad+Ju%C3%A1rez%22%5BJournal%5D)">Enriquecimiento de un vino tinto con un extracto de compuestos fenólicos provenientes de orujo de uva: bioaccesibilidad, análisis sensorial y respuesta biológica.</a> Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. , (2021).</li>
<li>Low, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+sharing+in+PredRet+for+accurate+prediction+of+retention+time%3A+Application+to+plant+food+bioactive+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Data sharing in PredRet for accurate prediction of retention time: Application to plant food bioactive compounds.</a> Food Chemistry. , 357(2021).</li>
<li>Sánchez-Patán, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbial+catabolism+of+grape+seed+flavan-3-ols+by+human+faecal+microbiota.+Targeted+analysis+of+precursor+compounds%2C+intermediate+metabolites+and+end-products%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Gut microbial catabolism of grape seed flavan-3-ols by human faecal microbiota. Targeted analysis of precursor compounds, intermediate metabolites and end-products.</a> Food Chemistry. 131 (1), 337-347 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Sandhu, A., Edirisinghe, I., Burton-Freeman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+and+urinary+%28poly%29phenolic+profiles+after+4-week+red+raspberry+%28Rubus+idaeus+L.%29+intake+with+or+without+fructo-oligosaccharide+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Plasma and urinary (poly)phenolic profiles after 4-week red raspberry (Rubus idaeus L.) intake with or without fructo-oligosaccharide supplementation.</a> Molecules. 25 (20), (2020).</li>
</ol>

Todos os autores não declaram conflito de interesses.

A identificação e quantificação dos fitoquímicos bioativos que são absorvidos após o consumo de um suplemento alimentar ou alimentar são cruciais para demonstrar e compreender os benefícios para a saúde desses compostos e dos alimentos que os contêm. No presente trabalho, foi desenvolvido o método UPLC-MS/MS, voltado apenas para a identificação dos principais compostos fenólicos e seus metabólitos que aumentaram na concentração no plasma após uma intervenção nutricional de 30 dias com dois produtos alimentícios especialm...

Sarcopenia é um transtorno esquelético progressivo relacionado à perda acelerada de músculos na população idosa. Essa condição aumenta o risco de quedas e leva a atividades limitadas da vida diária. A sarcopenia está presente em cerca de 5%-10% das pessoas com mais de 65 anos e cerca de 50% das pessoas com 80 anos ou mais de idade1. Nenhum medicamentos específicos foi aprovado para o tratamento da sarcopenia, por isso a prevenção com atividade física e uma dieta bem equilibrada é importante1,2. Intervenções nutricionais com alimentos especialmente formulados enriquecidos com proteína leiteira e aminoácidos essenciais têm mostrado resultados positivos na prevenção da sarcopenia2. Em outros estudos, os autores incluíram vitaminas e antioxidantes, como vitamina E e isoflavonas, na dieta, aumentando os benefícios para o ganho muscular na cintura e nos quadris3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) é uma árvore que cresce nas regiões tropicais mexicanas; tem sido consumida por culturas maias devido ao seu alto valor nutricional4. É uma boa fonte de proteínas, fibras, minerais e antioxidantes fenólicos, como o ácido clorogênico5. Como pode ser moído em pó e usado em produtos de panificação ou consumidos em bebidas, estudos recentes têm avaliado a incorporação da farinha de sementes de Ramón (RSF) em diferentes alimentos para melhorar seu valor nutricional. Uma bebida com sabor de cappuccino suplementada pela RSF foi formulada, que era rica em fibras alimentares e tinha mais de 6 g de proteína por porção, e era altamente aceita pelos consumidores; assim, considerou-se uma alternativa potencial para atender aos requisitos alimentares especiais6. Em um estudo de acompanhamento, a RSF também foi usada para formular um muffin e uma nova bebida rica em proteínas, fibras alimentares, micronutrientes e antioxidantes fenólicos. O muffin e a bebida foram utilizados em uma intervenção dietética para idosos, que consumiram ambos os produtos duas vezes por dia durante 30 dias. Após esse período, o estado nutricional e sarcopenico dos participantes melhorou, e o teor fenólico total do plasma aumentou7. No entanto, a determinação dos compostos fenólicos totais no plasma foi realizada por um método espectrofotométrico, de modo que a identificação dos compostos fenólicos reais que foram absorvidos não foi possível; além disso, este método não é completamente específico para compostos fenólicos, de modo que alguma superestimação pode ocorrer8.
A identificação e quantificação dos compostos fenólicos que são absorvidos após o consumo de alimentos ricos nesses antioxidantes é uma tarefa difícil, mas é necessária para demonstrar a atividade biológica desses fitoquímicos. A biodisponibilidade da maioria dos compostos fenólicos é baixa; menos de 5% deles podem ser encontrados sem transformação estrutural no plasma. Os compostos fenólicos passam por várias biotransformações, como metilação, sulfonação ou glucuronidação, que são realizadas por enterócitos e hepatócitos9. Compostos fenólicos também são biotransformados pela microbiota em catabólitos bacterianos que podem exercer seus efeitos benéficos no corpo após serem absorvidos pelo plasma10. Por exemplo, o ácido fenilacetic é um produto da transformação bacteriana de flavonoides e proanthociaanidinas oligomerícos, que podem inibir até 40% da adesão de bactérias (Escherichia coli) no trato urinário após o consumo de cranberry11.
A diversidade estrutural de compostos fenólicos de ocorrência natural, somada à diversidade de seus metabólitos e sua baixa biodisponibilidade, torna sua identificação no plasma ainda mais desafiadora. O perfil metabolômico, utilizando plataformas de análise espectroscópica, como ressonância magnética nuclear (RMN) e espectroscopia de massa tandem (MS/MS), é provavelmente a melhor abordagem para alcançar esse objetivo; infelizmente, o equipamento não é facilmente acessível, e o desenvolvimento de protocolos de análise ainda é limitado12. Vários estudos têm relatado a ESM/MS juntamente com um sistema de separação (como a cromatografia líquida) como estratégia para reduzir a complexidade dos espectros de massa em estudos metabolômicos. A recente introdução de métodos de separação de cromatografia líquida de alto desempenho (UPLC) reduziu o tempo de análise e aumentou a resolução e sensibilidade em comparação com os protocolos líquidos convencionais de alto desempenho, de modo que os sistemas UPLC-MS/MS têm sido rapidamente amplamente aceitos pela comunidade de metabolômicas analítica13. Dessa forma, alguns estudos investigaram metabólitos fenólicos e detectaram derivados colacuronidados de ácido cafeína, quercetina e ácido ferúlico, bem como derivados sulfoados de ácido seringa e vanlícita no plasma de indivíduos após a ingestão de cranberry14. Protocolos anteriores têm a intenção de encontrar compostos fenólicos e metabólitos fenólicos em biofluidos como plasma. Estes protocolos foram baseados na identificação e quantificação por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) acoplado a um detector UV-vis15. No entanto, tais protocolos exigem o uso de padrões autênticos para avaliar a identificação absoluta e quantificação precisa. Uma ampla gama de estudos identificou os metabólitos mais comuns em biofluidos (formas sulfotadas, glucuronidas e metiladas) por UPLC-MS e UPLC-MS/MS; no entanto, grande parte dos metabólitos bacterianos não foi relatada devido à falta de bancos de dados que contenham suas informações completas16. A identificação metabólica é complicada pelo custo e disponibilidade comercial das normas metabólitos. Portanto, a melhor estratégia pode ser a análise metabólica MS/MS sem alvo ou semi-direcionada, que se baseia no uso de informações de características moleculares (m/z, massa exata monoisotópica, distribuição isotópica e padrão de fragmentação) para determinar a identidade química e compara-a com bancos de dados on-line livremente disponíveis que contêm metabólitos polifenóis identificados em biofluóides após o consumo de polipólitos-richts12 . As bases de dados mais importantes utilizadas em estudos UPLC-MS/MS para identificação de compostos fenólicos e seus metabólitos são o Human Metabolome Database (HMDB), LipidBlast Library, METLIN Library e outros bancos de dados complementares, como PubChem, ChemSpider e Phenol Explorer17.
No presente estudo, foi desenvolvido um método uplc-MS/MS semi-direcionado para analisar as amostras de plasma do grupo de idosos envolvidos no estudo de consumo de muffin e bebidas contendo RSF7. Dados de diferentes bancos de dados online gratuitos de metabólitos de plasma foram coletados e integrados em um banco de dados especializado. Este banco de dados pode ser acessado automaticamente pelo software do equipamento para identificar os metabólitos polifenólicos nas cinco amostras de plasma antes e depois da intervenção nutricional de 30 dias. Isso é feito para identificar os principais compostos fenólicos, ou seus metabólitos, que são absorvidos dos alimentos funcionais especialmente formulados projetados para a prevenção da sarcopenia.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile</td><td>Tedia</td><td>Al1129-001</td><td>LC Espectrometria de massa</td></tr><tr><td>Autosampler</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4226A</td><td>1290 Infinity series</td></tr><tr><td>C18 coluna de fase reversa</td><td>Agilent Technologies</td><td>959757-902</td><td>Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 &mu; m; Centrífuga HD de resolução rápida</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5452000018</td><td>Mini Spin; Rotor F-45-12-11</td></tr><tr><td>Compartimento da coluna com termostato</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1316C</td><td>1290</td></tr><tr><td>Detector de matriz de diodos da série Infinity (UV-Vis)</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4212B</td><td>1260 Fonte</td></tr><tr><td>de ionização por eletrospray</td> da série <td>Infinity Agilent Technologies</td><td>G3251B</td><td>Pulverizador duplo Fonte ESI</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>J.T. Baker</td><td>0128-02</td><td>Reagente Baker, ACS</td></tr><tr><td>Mass Hunter Aquisição de Dados</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3338AA</td><td></td></tr><tr><td>Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3338AA</td><td></td></tr><tr><td>Mass Hunter Análise Qualitativa</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3338AA</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga</td><td>Marca</td><td>BR780546</td><td>Tubo de microcentrífuga, 2 mL com tampa</td></tr><tr><td>Pure etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-1L</td><td>200 prova, para biologia molecular</td></tr><tr><td>Q-TOF LC/MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>G6530B</td><td>6530 Bomba</td></tr><tr><td>Quaternária</td> de Massa Precisa <td>Agilent Technologies</td><td>G4204A</td><td>1290 Série Infinity</td></tr><tr><td>Filtro de seringa</td><td>Thermo Scientific</td><td>44514-NN</td><td>17 mm, 0,45 &mu; m, membrana de nylon</td></tr><tr><td>Termostato</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1330B</td><td>1290 Frasco da série Infinity</td></tr><tr><td></td><td>Agilent Technologies</td><td>8010-0199</td><td>Âmbar, silicone vermelho PFTE 2 mL com tampa de rosca e tampas azuis</td></tr><tr><td>Inserção do frasco</td><td>Agilent Technologies</td><td>5183-2089</td><td>Inserção do frasco 200 &mu; L para a abertura 2mL padrão,</td></tr><tr><td>espectrometria maciça</td> cônica<td>de Tedia</td><td></td><td>WL2212-001</td> LC da água</tr></tbody></table>

cromatografia ultra-alta-performance semi-direcionada acoplada à análise de espectrometria de massa de metabólitos fenólicos no plasma de idosos adultos

Semi-Targeted Ultra-High-Performance Chromatography Coupled to Mass Spectrometry Analysis of Phenolic Metabolites in Plasma of Elderly Adults

Um grupo de 23 idosos recebeu refeições funcionais (uma bebida e um muffin) especialmente formuladas para a prevenção da sarcopenia (perda de massa muscular relacionada à idade). Amostras de plasma foram colhidas no início da intervenção e após 30 dias de consumo das refeições funcionais. Foi realizada uma cromatografia ultra-alta performance semi-direcionada juntamente com a análise de massa tandem (UPLC-MS/MS) para identificar compostos fenólicos e seus metabólitos. As proteínas plasmáticas foram precipitadas com etanol e as amostras foram concentradas e resuspendidas na fase móvel (acetonitrilo 1:1: água) antes da injeção no instrumento UPLC-MS/MS. A separação foi realizada com uma coluna de fase inversa C18 , e os compostos foram identificados utilizando sua massa experimental, distribuição isotópica e padrão de fragmento. Os compostos de juros foram comparados aos dos bancos de dados e da biblioteca interna sem-direcionada. Os resultados preliminares mostraram que os principais metabólitos identificados após a intervenção foram ácido fenídrico, glicacitina, ácido 3-hidroxifenilvalerico e gomisina M2.

O processo passo-a-passo para a identificação de metabólitos fenólicos através da análise uplc-MS/MS semi-direcionada, em modo negativo, de amostras de plasma é retratado na Figura 2. Primeiro, o cromatógrama de íon total (TIC) do extrato de fenólicos plasmáticos (obtido após precipitação proteica da amostra de plasma total) foi obtido através do software qualitativo do instrumento. Em seguida, foi utilizado o cromatógrama de íon extraído, e o padrão exato de massa e fr...

O objetivo deste protocolo é detectar metabólitos fenólicos no plasma usando um método de espectrometria de massa cromatografia-masscamo semi-direcionada.

Cromatografia ultra-alta-performance semi-direcionada acoplada à análise de espectrometria de massa de metabólitos fenólicos no plasma de idosos adultos

A group of 23 elderly persons was given functional meals (a beverage and a muffin) specially formulated for the prevention of sarcopenia (age-related loss ...

O objetivo deste protocolo é detectar metabólitos fenólicos no plasma por um método UPLC-MS/MS semi-direcionado. As proteínas plasmáticas foram precipitadas com etanol e amostras concentradas, e reinsupedas na fase móvel, antes da injeção no equipamento UPLC. Os compostos foram identificados por meio de uma biblioteca semi-direcionada montada no laboratório, utilizando o gerente de PCDL para metabolômica, software e diferentes bancos de dados online gratuitos.Implementamos uma intervenção nutricional com uma formulação de muffin e bebidas com farinha de sementes de alicastrum de brosimum. Ao final da intervenção, o estado nutricional e sarcopênico dos participantes foi melhorado, e o teor fenólico total do plasma foi aumentado. Mas precisamos identificar quais compostos fenólicos foram absorvidos e contribuíram para o efeito positivo.A identificação e quantificação dos compostos fenólicos que são absorvidos após o consumo de alimentos ricos nesses antioxidantes é tarefa difícil, mas necessária, se for para demonstrar atividade biológica desses fitoquímicos. A biodisponibilidade da maioria dos componentes fenólicos é baixa, além disso, menos de 5% deles entram sem transformação estr

semi-targeted-ultra-high-performance-chromatography-coupled-to-mass

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

O perfil de metabólitos não direcionados por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massa (UPLC-MS) é uma técnica poderosa para investigar o metabolismo.  Este artigo descreve um fluxo de trabalho típico utilizado para o perfil de metabólitos não direcionados do soro, incluindo organização e preparação de amostras, aquisição de dados, análise de dados, controle de qualidade e identificação de metabólitos.

Grande Escala Profiling não-alvo metabolômica de soro por cromatografia líquida de ultra-espectrometria de massa (UPLC-MS)

Irrelevantes metabolômica fornece uma hipótese gerando instantâneo de um perfil metabólico. Este protocolo irá demonstrar a extracção e análise de metabolitos a partir de células, soro ou tecido. Uma gama de metabolitos são pesquisadas utilizando extracção de fase líquido-líquido, cromatografia líquida de microfluxo UltraPerformance /-espectrometria de massa de alta resolução (UPLC-HRMS), acoplado ao software de análise diferencial.

Metabolomics irrelevantes de fontes biológicas Usando UltraPerformance cromatografia líquida de alta resolução Espectrometria de Massa (UPLC-HRMS)

Metabolite perfis tem sido um ativo valioso para o estudo do metabolismo na saúde e na doença. Utilizando cromatografia normal em fases líquida acoplada à espectrometria de massa de alta resolução com mudança de polaridade e um ciclo rápido, nós descrevemos um protocolo para analisar a composição metabólica polar de material biológico com alta sensibilidade, precisão e resolução.

Uma estratégia para sensíveis, Large Scale quantitativos Metabolomics

A confiabilidade dos resultados em experimentos de metabolômica depende da eficácia e reprodutibilidade da preparação de amostras. Descrito é um método rigoroso e em profundidade que permite a extração de metabólitos a partir de fluidos biológicos com a opção de seguida, analisar-se a milhares de compostos, ou apenas as classes de compostos de interesse.

Preparação Técnica Multi-passo para recuperar várias classes compostas metabólito para em profundidade e análise metabolômica Informativo

Aqui nós descrevemos um método de alta produtividade para a fiscalização de drogas abrangente que permite a resolução melhorada e detecção de grandes painéis de drogas de abuso e seus metabolitos, com controle de qualidade baseado na injeção multisegment-capilar eletroforese / espectrometria de massa.

Vigilância de drogas de alto rendimento e abrangente utilizando espectrometria de massa Multisegment eletroforese capilar-injeção

Apresenta-se um método para a análise não direcionada de metabólitos e lipídios de grãos de trigo. O protocolo inclui um método de extração metabólica acetonitrila e metodologia de espectrometria de cromatografia líquida de fase invertida, com aquisição em modos positivos e negativos de ionização eletrospray.

Análise de metabolômica baseada em espectrometria líquida não direcionada

Ácidos fenólicos são fitoquímicos importantes que estão presentes em grãos integrais. Possuem propriedades bioativas, como funções protetoras antioxidantes. Este trabalho teve como objetivo relatar um método generalizado para a identificação do HPLC, estimativa total de teor fenólico e determinação da capacidade antioxidante de ácidos fenólicos em cereais e leguminosas.

Um método generalizado para determinar a composição livre de ácido fenólico solúvel e capacidade antioxidante de cereais e leguminosas

Este protocolo descreve o fluxo de trabalho para rotulagem metabólica de células senescentes e não-divisórias com SILAC pulsado, análise de espectrometria de massa não-alvo, e um cálculo simplificado de meias-vidas proteicas.

Medição das Taxas de Rotatividade de Proteínas em Células Cultivadas Senescentes e Não-Divisórias com Rotulagem Metabólica e Espectrometria de Massa

Descrevemos um protocolo geral que integra análise de espectrometria de massa de alta resolução e docking molecular na pesquisa da medicina tradicional chinesa.

Espectrometria de massa em tandem de alta resolução para estudar constituintes químicos de Gynura bicolor DC

flexibilidade conformacional desempenha um papel crucial na função da proteína. Aqui, nós descrevemos o uso de espectrometria de massa por ionização por electropulverização resolvida no tempo acoplado a troca de hidrogénio-deutério para sondar as rápidas mudanças estruturais que conduzem a função de proteínas ordenadas e desordenadas.

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Aprenda a detectar metabólitos fenólicos no plasma por UPLC-MS/MS semi-direcionada em idosos. Este método identifica compostos absorvidos após intervenção nutricional com Brosimum alicastrum.

Cromatografia ultra-alta-performance semi-direcionada acoplada à análise de espectrometria de massa de metabólitos fenólicos no plasma de idosos adultos (Vídeo) | JoVE Journal

Cromatografia ultra-alta-performance semi-direcionada acoplada à análise de espectrometria de massa de metabólitos fenólicos no plasma de idosos adultos

Explorar mais vídeos