Name: Modelo de Lesão por Arma Branca do Adulto Óptico Utilizando Zebrafish e Medaka para Análise Comparativa da Capacidade Regenerativa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Aprenda o modelo de lesão por punção no tecto óptico de zebrafish adultos para estudar mecanismos moleculares da regeneração neural. Este método simples avalia proliferação e diferenciação de células gliais radiais.

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Este trabalho foi apoiado pelo JSPS KAKENHI Grant Number 18K14824 e 21K15195 e uma bolsa interna da AIST, Japão.

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada. Zebrafish e medaka foram mantidos de acordo com procedimentos padronizados28.
1. Ferimento por arma branca no tecto óptico adulto
<ol><li>Preparar uma solução estoque de tricaína a 0,4% (p/v) para anestesia. Para uma solução-mãe de 100 ml, dissolver 400 mg de metanossulfonato de tricaína (ver Tabela de Materiais) em 90 ml de água destilada e ajustar o pH para 7,0 utilizando um tampão Tris HCl 1 M (pH 9,0). Uma vez ajustado o pH, adicionar água até 100 mL, fazer alíquotas apropriadas e armazená-las a -20 °C.</li>
	<li>Para anestesiar o peixe-zebra adulto ou medaka, preparar uma solução de tricaína a 0,02 % (p/v) diluindo a solução-mãe de tricaína a 0,4 % com água de instalações para peixes.</li>
	<li>Anestesiar os peixes com solução de tricaína a 0,02%; Ficam anestesiados quando não se movem ou não respondem ao toque (1-2 min).</li>
	<li>Coloque o peixe anestesiado em uma bandeja de isopor (ver Tabela de Materiais) e fixe o peixe na vertical entre duas agulhas de 30 G inseridas verticalmente no isopor.</li>
	<li>Segure o corpo do peixe para evitar que a cabeça do peixe se mova e insira verticalmente uma agulha de 30 G através do crânio na região medial de um dos hemisférios do tecto óptico (Figura 1A,B). A profundidade de inserção é de ~0,75 mm, quase igual à metade do comprimento do bisel de 30 G. Esta profundidade de inserção induz lesão cerebral em zebrafish e medaka devido ao tamanho corporal semelhante desses peixes. NOTA: Medaka tem escamas no crânio. Coçar e remover as escamas usando a agulha 30 G para induzir com eficiência e precisão a lesão por arma branca (Figura 1C).</li>
	<li>Transfira os peixes feridos para um tanque de peixes com água fresca e mova o tanque para o sistema de criação de peixes assim que eles se recuperarem totalmente da anestesia. NOTA: Os peixes se recuperarão e começarão a se mover livremente dentro de alguns minutos.</li>
	<li>Para a análise da linhagem após a lesão, preparar água fresca de instalação de peixes contendo 5 mM de bromodeoxiuridina (BrdU) (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, incubar os peixes com esta solução de 5 mM BrdU por um período de tempo pré-determinado13,19 (conforme determinado por um planejamento experimental). Em seguida, dissecar esses peixes de acordo com a etapa 2 e avaliar a incorporação de BrdU e a identidade da linhagem celular, conforme apropriado. Observação : esta etapa é uma etapa opcional para análise de linhagem celular. Para detectar sinais BrdU, execute a recuperação de antígeno como mostrado na etapa 4.3.</li>
</ol>2. Dissecção cerebral
<ol><li>Preparar solução de tricaína a 0,02%, uma bandeja de isopor para dissecção e uma seringa de 10 mL contendo solução salina tamponada com fosfato (1x PBS) com um tubo de extensão e agulhas de 30 G (ver Tabela de Materiais) para perfusão intracárdica.</li>
	<li>Anestesiar os peixes feridos em pontos de tempo selecionados.</li>
	<li>Coloque papel toalha na bandeja de isopor e coloque o peixe anestesiado sobre o papel toalha.</li>
	<li>Segure o corpo do peixe no lugar inserindo verticalmente duas agulhas de 30 G em cada lado da nadadeira anal (Figura 2A).</li>
	<li>Realizar incisão ventral do ânus ao coração (Figura 2B) e manter o coração visível inserindo mais duas agulhas de 30G de cada lado deste órgão (Figura 2C). NOTA: O coração é coberto pela camada epitelial prateada da hipoderme, tanto no peixe-zebra quanto no medaka (Figura 2C).</li>
	<li>Remover suavemente a camada epitelial de prata com a ponta da pinça (Figura 2D).</li>
	<li>Inserir a agulha 30G no ventrículo, mantendo o bisel para cima, e incidir no átrio com a pinça (Figura 2E). Pressione cuidadosamente a seringa para empurrar o PBS 1x e confirme se o átrio lavou o sangue. NOTA: Para evitar que a agulha penetre no ventrículo, insira cuidadosamente a agulha até a profundidade do meio bisel e, em seguida, ajuste a profundidade de inserção. Se a perfusão for bem feita, as brânquias ficam brancas (Figura 2F,G).</li>
	<li>Pare a perfusão depois que o sangue for drenado e as brânquias ficarem brancas.</li>
	<li>Retire as agulhas que fixam o corpo do peixe no lugar e fixe o peixe ventralmente para baixo (Figura 2H). Cortar a medula espinhal e remover o crânio do tecto óptico e do telencéfalo (Figura 2I). Em seguida, corte os nervos ópticos e disseque o cérebro cuidadosamente. NOTA: Cuidado com os nervos ópticos durante a dissecção, porque os nervos estão conectados ao tecto. Quando o nervo óptico é puxado, o tecto óptico pode ser descolado do cérebro. Se a remoção de sangue não estiver completa, o cérebro parece rosa claro (o cérebro direito na Figura 2J).</li>
	<li>Transfira os cérebros para tubos de 1,5 ml com 1 ml de paraformaldeído a 4 % em 1x PBS e fixe-os durante a noite a 4 °C.</li>
</ol>3. Preparação das secções congeladas
<ol><li>Lave os cérebros fixos três vezes em 1x PBS por 5 min cada.</li>
	<li>Para criar os cérebros, transfira-os para tubos de 1,5 ml com 1 ml de sacarose a 30 % (p/v) em 1x PBS e incube-os durante a noite a 4 °C. Preparar o composto de incorporação (mistura 2:1 de composto OCT e 30% de sacarose, ver Tabela de Materiais) combinando 30 mL de OCT e 15 mL de sacarose a 30%. Conservar a 4 °C. NOTA: Para remover as bolhas do composto misturado, centrifugar os tubos de 50 mL a 10.000 x g por 2 min à temperatura ambiente ou colocar os tubos na vertical durante a noite.</li>
	<li>Incubar um bloco de alumínio durante a noite a -80 °C para arrefecer o criomolde (ver Tabela de Materiais) imediatamente após o cérebro dissecado ser incorporado no criomolde com o composto incorporador. NOTA: O nitrogênio líquido também pode ser usado para resfriar o bloco de alumínio. Nesse caso, o bloco de alumínio deve ser colocado em uma caixa de isopor preenchida com nitrogênio líquido suficiente para cobrir o bloco de alumínio pouco antes de incorporar. Após confirmar a sublimação do nitrogênio líquido, coloque o criomold sobre o bloco de alumínio pré-resfriado. É melhor confirmar quantos criomoldes podem ser colocados no bloco de alumínio de uma só vez. É aconselhável usar nitrogênio líquido ou um bloco pré-resfriado adicional para garantir espaço suficiente para resfriar todas as amostras rapidamente.</li>
	<li>Coloque o bloco de alumínio pré-resfriado em uma caixa de isopor. Use uma caixa de isopor com tampa para evitar que o bloco de alumínio aqueça.</li>
	<li>Para cortes coronais, incorporar o cérebro em um criomold e ajustar a orientação usando pinça sob o microscópio (Figura 3A).</li>
	<li>Coloque o criomold sobre o bloco de alumínio pré-resfriado na caixa de isopor e deixe o composto OCT congelar (Figura 3B). Quando o composto OCT começa a congelar, torna-se branco.</li>
	<li>Aplique um pequeno círculo de composto OCT em um disco de amostra e monte o criobloco para prender o criobloco ao disco da amostra.</li>
	<li>Coloque o disco da amostra no criostato e congele completamente o composto de OCT.</li>
	<li>Coloque o disco da amostra na cabeça da amostra no criostato.</li>
	<li>Defina a orientação do criobloco e corte a OCT para remover quaisquer regiões extras. NOTA: Ajuste a orientação do plano de corte durante o corte do telencéfalo. A lâmina é equipada com um criostato. É possível ajustar a orientação do plano de corte alterando o ângulo da cabeça do corpo de prova.</li>
	<li>Cortar secções seriais de 14 μm de espessura através de todo o tecto óptico utilizando um criostato. Conservar as lâminas a -25 °C. NOTA: O armazenamento a longo prazo deve ser a -80 °C.</li>
</ol>4. Imunomarcação fluorescente
<ol><li>Lâminas de vidro seco em um rack deslizante por 30 min à temperatura ambiente (RT). Lave as lâminas em 1x PBS por 30 min no RT. Se a imunomarcação com anticorpos anti-PCNA ou BrdU for realizada, prossiga para a etapa 4.2 ou etapa 4.3.</li>
	<li>Preparar 500 ml de citrato de sódio 10 mM num copo de 500 ml e aquecer o tampão citrato a 85 °C num agitador magnético de placa quente, em seguida, colocar as lâminas num suporte de coloração de lâminas e incubar o rack no tampão citrato a 85 °C durante 30 minutos. Para evitar a ebulição, mantenha a temperatura em torno de 85 °C. Após a recuperação do antígeno, lavar as lâminas três vezes em Triton a 0,1% em 1x PBS (PBSTr), com cada lavagem levando 5 min em RT. NOTA: Esta etapa é uma etapa opcional para a recuperação do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA).</li>
	<li>Preparar uma solução de HCl 2 N diluindo 12 N HCl em água destilada. Usando um bloqueador de líquidos (ver Tabela de Materiais), desenhe uma linha como uma barreira hidrofóbica para manter a solução de HCl 2 N ao redor das seções.<ol><li>Coloque as lâminas em bandejas de imunomarcação e aplique 200-300 μL da solução de HCl 2N. Incubar os tabuleiros a 37 °C durante 30 min. Após a recuperação do antigénio, lavar três vezes em PBSTr a 0,1 % com cada lavagem a tomar 5 minutos em RT. NOTA: Esta etapa é uma etapa opcional para a recuperação de antígeno BrdU.</li>
	</ol></li>
	<li>Absorva e retire a solução restante com papel toalha. Em seguida, use um bloqueador líquido para desenhar uma barreira hidrofóbica para manter a solução de anticorpos ao redor das seções, conforme necessário.</li>
	<li>Coloque as lâminas em bandejas e aplique 200-300 μL de solução bloqueadora, 3% (v/v) de soro de cavalo em PBSTr) em cada lâmina e incube as lâminas por 1 h no TR.</li>
	<li>Lave os cortes com PBSTr por 5 min no RT e repita três vezes.</li>
	<li>Preparar os anticorpos primários (ver Tabela de Materiais) utilizando a solução de bloqueio (200-300 μL de solução de anticorpos para cada lâmina). Retire o PBSTr restante com papel toalha e coloque as lâminas nas bandejas de imunomarcação. Aplicar a solução primária de anticorpos em cada lâmina e incubar tabuleiros durante a noite a 4 °C.</li>
	<li>Lave os cortes com PBSTr por 5 min no RT e repita três vezes.</li>
	<li>Preparar a solução de anticorpos secundários fluorescentes (ver Tabela de Materiais) utilizando o tampão de bloqueio (1:500). Retire o PBSTr restante com papel toalha e coloque as lâminas nas bandejas de imunomarcação. Aplique a solução de anticorpos secundários em todas as bandejas de lâmina e sombra com papel alumínio. Incubar por 1-2 h no TR.</li>
	<li>Lave os cortes com PBSTr por 5 min em TR três vezes sem expô-los à luz.</li>
	<li>Preparar a solução Hoechst (diluição de 1:500 em 1x PBS, ver Tabela de Materiais) para coloração nuclear. Retire o PBSTr restante com papel toalha e coloque as lâminas nas bandejas de imunomarcação. Aplique a solução Hoechst em cada lâmina e cubra as bandejas com papel alumínio. Incubar por 30 min no TR.</li>
	<li>Lave as seções com 1x PBS por 10 min no RT sem expô-las à luz.</li>
	<li>Absorva e remova o 1x PBS restante usando papel toalha e monte as seções em lâminas usando um meio de montagem solúvel em água (consulte a Tabela de Materiais) para imunomarcação fluorescente. Coloque lentamente uma tampa de 24 x 45 mm nas seções. Conservar a 4 °C, sem expor as lâminas à luz.</li>
	<li>Observar e obter imagens dos cortes sob microscopia fluorescente ou microscopia confocal.</li>
</ol>

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<li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+neuroepithelial-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li>
<li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish%3A+a+new+tool+for+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li>
<li>Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+glial+cell-specific+ablation+in+the+adult+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain.</a> Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).</li>
<li>Godoy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neurons+regenerate+following+chemogenetic+ablation+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio).</a> Scientific Reports. 10 (1), 12825(2020).</li>
<li>Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+brain+ischemia-reperfusion+model+induced+by+hypoxia-reoxygenation+using+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Bulletin%22%5BJournal%5D)">In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae.</a> Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Descreve-se aqui um conjunto de métodos que podem ser utilizados para induzir lesões por arma branca no tecto óptico, utilizando uma agulha para facilitar a avaliação da proliferação e diferenciação do CGR após lesão cerebral. A facada mediada por agulha é um método simples e eficientemente implementado que pode ser aplicado a muitas amostras experimentais usando um conjunto padrão de ferramentas. Modelos de lesão por arma branca para várias regiões do cérebro do peixe-zebra foram desenvolvidos <s...

O peixe-zebra (Danio rerio) tem maior capacidade de regeneração do sistema nervoso central (SNC) quando comparado a outros mamíferos 1,2,3. Recentemente, para melhor compreender os mecanismos moleculares subjacentes a esse aumento da capacidade regenerativa, análises comparativas da regeneração tecidual utilizando tecnologia de sequenciamento de última geração têm sidorealizadas4,5,6. As estruturas cerebrais do peixe-zebra e dos tetrápodes são bastante diferentes 7,8,9. Isso significa que vários modelos de lesão cerebral usando peixes pequenos com estruturas cerebrais e características biológicas semelhantes foram desenvolvidos para facilitar a investigação dos mecanismos moleculares subjacentes que contribuem para esse aumento da capacidade regenerativa.
Além disso, o medaka (Oryzias latipes) é um animal de laboratório popular com baixa capacidade de regeneração cardíaca e neuronal10,11,12,13 em comparação com o peixe-zebra. Zebrafish e medaka têm estruturas cerebrais e nichos semelhantes para células-tronco neurais adultas (NSCs)14,15,16,17. Em zebrafish e medaka, o tecto óptico inclui dois tipos de NSCs, células-tronco neuroepiteliais e células gliais radiais (RGCs)15,18. Uma lesão por arma branca no tecto óptico de zebrafish adultos foi previamente desenvolvida, e este modelo foi usado para investigar os mecanismos moleculares que regulam a regeneração cerebral nesses animais 19,20,21,22,23. Este modelo de lesão por arma branca induziu neurogênese regenerativa a partir de CGRs 19,24,25. Esta lesão por arma branca no tecto óptico é um método robusto e reprodutível13,19,20,21,22,23,24,25. Quando o mesmo modelo de lesão foi aplicado ao medaka adulto, a baixa capacidade neurogênica dos CGRs no tecto óptico de medaka foi revelada através da análise comparativa da proliferação e diferenciação do CGR após alesão13.
Modelos de lesão por arma branca no tecto óptico também foram desenvolvidos em modelos de mummichog26, mas detalhes da lesão tectômica não foram bem documentados quando comparados com lesão telencálica27. A lesão por arma branca no tecto óptico utilizando zebrafish e medaka permite a investigação das respostas celulares diferenciais e expressão gênica entre espécies com capacidade regenerativa diferencial. Este protocolo descreve como realizar uma lesão por arma branca no tecto óptico usando uma agulha de injeção. Este método pode ser aplicado a pequenos peixes como zebrafish e medaka. Os processos de preparação de amostras para análise histológica e análise de proliferação e diferenciação celular usando imunohistoquímica fluorescente e criossecções são explicados aqui.

<table><tbody><tr><td>Seringa de 10 mL</td><td>TERUMO</td><td>SS-10ESZ</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris-HCl (pH 9.0)</td><td>NIPPON GENE</td><td>314-90381</td><td></td></tr><tr><td>30 G agulha</td><td>Dentronics</td><td>HS-2739A</td><td></td></tr><tr><td>4% Solução Tampão de Fosfato de Paraformaldeído</td><td>Wako</td><td>163-20145</td><td></td></tr><tr><td>Bloco</td><td></td><td></td> de alumínio <td>115 x 80 x 37 mm (L x P x A) é tamanho suficiente para congelar 6 criomoldes</td></tr><tr><td>Anti-BLBP</td><td>Millipore</td><td>ABN14</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anti-BrdU</td><td>Abcam</td><td>ab1893</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Anti-HuC</td><td>Invitrogen</td><td>A21271</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Anti-PCNA</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-56</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Brmodeoxiuridina</td><td>Wako</td><td>023-15563</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal C1 plus</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>Sakura Finetek Japan</td><td>4565</td><td>10 x 10 x 5 mm (L x P x A)</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM1960</td><td></td></tr><tr><td>Danio rerio Cepas WT Tubo de extensão RW</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>TERUMO</td><td>SF-ET3520</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount (TM) Meio de montagem aquoso, para uso com tecidos corados com corante fluorescente</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>DUMONT</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-rato de cabra (H + L) anticorpo secundário altamente adsorvido de cabra, Alexa Fluor Plus 488</td><td>Invitrogen</td><td>A32723</td><td></td></tr><tr><td>IgG de cabra anti-coelho (H + L) anticorpo secundário altamente adsorvido de cabra, Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 solução</td><td>Dojindo</td><td>23491-52-3</td><td></td></tr><tr><td>ácido clorídrico</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de Incubação para 10 lâminas Laranja Escuro</td><td>COSMO BIO CO., LTD.</td><td>10DO</td><td></td></tr><tr><td>MAS revestimento de vidro deslizante</td><td>Matsunami vidro</td><td>MAS-01</td><td></td></tr> Micro vidro de <tr><td>cobertura</td><td>Matsunami</td><td>C024451</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Solução de bloqueio de soro de cavalo</td><td>normal VECTOR LABRATORIES</td><td>S-2000-20</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T Composto</td><td>Sakura Finetek Japão</td><td>83-1824</td><td></td></tr><tr><td>Oryzias latipes Estirpes WT Caneta</td> PAP Cab <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bloqueador Superlíquido</td><td>DAIDO SANGYO</td><td>PAP-S</td> Phosphate Buffered Saline (PBS) Comprimidos<td></td></tr><tr><td>, pH 7,4</td><td>TaKaRa</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja</td><td></td><td></td> de isopor <td>100 x 100 x 10 mm (L x P x A) folha de isopor está disponível como bandeja</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td>30 % (p/v) Sacarose em PBS</td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td> <td>nacarai tesque</td><td>14805-24</td><td></td></tr><tr><td>Citrato Trissódico Di-hidratado</td><td>Wako</td><td>191-01785</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako</td><td>04605-250</td><td></td></tr></tbody></table>

modelo de lesão por arma branca do adulto Óptico utilizando zebrafish e medaka para análise comparativa da capacidade regenerativa

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

Enquanto o peixe-zebra tem uma capacidade superior de regenerar seu sistema nervoso central (SNC), o medaka tem uma menor capacidade regenerativa do SNC. Um modelo de lesão cerebral foi desenvolvido no tecto óptico adulto de zebrafish e medaka e análises histológicas e moleculares comparativas foram realizadas para elucidar os mecanismos moleculares que regulam a alta capacidade regenerativa deste tecido entre essas espécies de peixes. Aqui é apresentado um modelo de lesão por arma branca para o tecto óptico adulto usando agulha e análises histológicas para proliferação e diferenciação das células-tronco neurais (NSCs). Uma agulha foi inserida manualmente na região central do tecto óptico e, em seguida, os peixes foram perfundidos intracárdicos e seus cérebros dissecados. Esses tecidos foram então criossecados e avaliados por imunomarcação contra os marcadores apropriados de proliferação e diferenciação do NSC. Este modelo de lesão tectum fornece resultados robustos e reprodutíveis tanto em zebrafish quanto em medaka, permitindo comparar as respostas do NSC após a lesão. Este método está disponível para pequenos teleósteos, incluindo zebrafish, medaka e killifish africano, e nos permite comparar sua capacidade regenerativa e investigar mecanismos moleculares únicos.

A lesão por arma branca no tecto óptico com inserção de agulha no hemisfério direito (Figura 1, Figura 4A e Figura 5A) induz várias respostas celulares, incluindo a proliferação de células gliais radiais (CGR) e a geração de neurônios recém-nascidos. Similarmente, populações envelhecidas de zebrafish e medaka foram usadas para neutralizar quaisquer efeitos do envelhecimento na resposta regenerativa. Em seguida, foi realizada imunoma...

Um modelo de lesão cerebral mecânica em peixes-zebra adultos é descrito para investigar os mecanismos moleculares que regulam sua alta capacidade regenerativa. O método explica para criar uma lesão por facada no tecto óptico de várias espécies de pequenos peixes para avaliar as respostas regenerativas usando imunomarcação fluorescente.

Modelo de Lesão por Arma Branca do Adulto Óptico Utilizando Zebrafish e Medaka para Análise Comparativa da Capacidade Regenerativa

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

A lesão por arma branca é um método de lesão mecânica que induz ablação celular inespecífica. Este método facilita a avaliação da proliferação e diferenciação do CGR após lesão cerebral. A lesão por arma branca mediada por agulha é um método simples e eficientemente implementado para induzir lesão cerebral.Este método pode ser aplicado a muitas amostras experimentais usando um conjunto padrão de ferramentas. A capacidade regenerativa do peixe-zebra foi ilustrada usando o modelo de lesão por arma branca. Novos conhecimentos sobre o mecanismo molecular que regula a regeneração neuronal contribuem para a terapia regenerativa no sistema nervoso central.Comece colocando um peixe-zebra adulto anestesiado ou medaka em uma bandeja de isopor. Fixe o peixe na vertical entre duas agulhas de calibre 30 inseridas verticalmente no isopor. Segure o corpo do peixe para evitar que a cabeça do peixe se mova e, em seguida, insira verticalmente uma agulha de calibre 30 através do crânio na região medial de uma das esferas do tecto óptico.Em seguida, transfira os peixes feridos para um tanque de peixes com água fresca da instalação de peixes. Uma vez que os peixes tenham se recuperado totalmente da anestesia, mova o tanque para o sistema de reprodução. Coloque papel toalha na bandeja de isopor para colocar o peixe anestesiado.Em seguida, mantenha o corpo do peixe no lugar inserindo verticalmente duas agulhas de calibre 30 em cada lado da nadadeira anal. Uma vez que o peixe é colocado, faça uma incisão ventral do ânus para o coração. Mantenha o coração visível inserindo duas agulhas de calibre 30 de cada lado.Em seguida, use a ponta da pinça para remover a camada epitelial prateada. Insira a agulha de calibre 30 no ventrículo, mantendo o bisel para cima, e faça uma incisão no átrio usando a pinça. Em seguida, empurre PBS para o átrio pressionando a seringa para lavar o sangue do átrio.Quando o sangue é drenado e as brânquias ficam brancas, interrompa a perfusão PBS. Mais tarde, remova as agulhas que fixam o corpo do peixe no lugar e fixe o peixe ventralmente para baixo. Depois de cortar a medula espinhal e remover o crânio do tecto óptico e telencéfalo, cortar os nervos ópticos e dissecar o cérebro.Em seguida, transfira os cérebros para tubos de 1,5 mililitro com um mililitro de paraformaldeído a 4% em PBS, para fixar durante a noite a quatro graus Celsius. Depois de lavar os cérebros fixos três vezes em PBS por cinco minutos cada, transfira os cérebros em tubos de 1,5 mililitro com um mililitro de sacarose de 30% do peso em volume em PBS como um crioprotetor e incube-os durante a noite a quatro graus Celsius. Prepare o composto de incorporação combinando 30% de sacarose com 30 mililitros de temperatura de corte ideal, ou OCT, composto e armazene o composto a quatro graus Celsius.Para resfriar o criomold uma vez, incube um bloco de alumínio durante a noite a 80 graus Celsius negativos e coloque o bloco pré-resfriado em uma caixa de isopor com tampa para evitar o aquecimento. Para cortes coronais, incorporar o cérebro dissecado em um criomoldo ajustando a orientação usando pinça sob o microscópio. Em seguida, coloque o criomold no bloco de alumínio pré-resfriado na caixa de isopor e deixe o composto OCT congelar e ficar branco.À medida que o composto congela, aplique um pequeno círculo de composto OCT em um disco de amostra antes de montar o criobloco no disco da amostra. Ao colocar o disco da amostra no criostato, congele o composto de OCT. Em seguida, coloque o disco da amostra na cabeça da amostra no criostato.Depois de definir a orientação do criobloco, corte o OCT para remover quaisquer regiões extras. Corte seções seriais de 14 micrômetros de espessura através de todo o tecto óptico usando um criostático e armazene as lâminas a menos 25 graus Celsius. A proliferação de células gliais radiais, ou RGC, no tecido cerebral do peixe-zebra foi avaliada.A maioria dos CGRs estava proliferando com antígeno celular negativo no hemisfério contralateral não lesado. Dois dias após a lesão, a proliferação do RGC foi induzida no lado lesado do tecto medaka. Após a lesão cerebral, a linhagem celular e a diferenciação do RGC foram avaliadas com a marcação com bromodeoxiuridina, ou BrdU.A análise representativa mostra neurônios recém-nascidos sete dias após a lesão no peixe-zebra e medaka lesionados. Uma das etapas críticas nas lesões por arma branca é a inserção manual da agulha. Uma lesão consistente é necessária para criar resultados reprodutíveis.Corantes fluorescentes são eficazes como marcadores de feridas. A extensão da difusão do corante fluorescente indica a localização e a profundidade da lesão por arma branca. Esta técnica é potencialmente adaptada a outras espécies de peixes pequenos, e a adaptação ao medaka permite comparações da capacidade regenerativa.

stab-wound-injury-model-adult-optic-tectum-using-zebrafish-medaka-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo demonstra um procedimento para induzir degeneração da retina em peixes-zebra adultos usando lesão a laser. O laser tem como alvo as células fotorreceptoras da retina, desencadeando a morte celular e um processo degenerativo. Esse dano ativa as células da glia de Müller (MG), levando à sua desdiferenciação em progenitores de células-tronco que auxiliam na regeneração da retina.

Modelagem da degeneração e regeneração da retina em peixe-zebra usando uma lesão focal a laser

Após transecção espinhal, adulto zebrafish tem recuperação funcional por seis semanas após a lesão. Para tirar proveito da transparência larval e recuperação mais rápida, apresentamos um método para seccionar a medula espinhal larval. Após transecção, observamos recuperação sensorial começando em 2 dias após a lesão, e movimento C-curva por 3 dias após a lesão.

Transecção medular nos larval Zebrafish

Para lançar luz sobre os mecanismos celulares e moleculares da neurogênese e regeneração do peixe-zebra adulto, desenvolvemos um protocolo para cirurgia invasiva causando lesões mecânicas no telencéfalo adulto do peixe-zebra e subsequente monitoramento de alterações no hemisfério esfaqueado por imuno-histoquímica ou hibridização in situ.

Stab ferida ferimento do peixe-zebra adulto Telencéfalo: Um método para investigar Vertebrados Cérebro Neurogênese e Regeneração

Aqui apresentamos um método confiável para estudar a regeneração renal adulta induzindo lesão renal aguda por injeção de gentamicina. Mostramos que a lesão depende da dosagem de gentamicina e da temperatura ambiente usando hibridização in situ para rotular lhx1a+ em desenvolvimento de novos néfrons.

A regeneração renal em Zebrafish Adulto por lesão induzida pela gentamicina

Este artigo descreve um método para criar uma lesão mecânica do vaso em embriões de peixe-zebra. Este modelo de lesão fornece uma plataforma para estudar hemostasia, inflamação relacionada a lesões e cicatrização de feridas em um organismo ideal para microscopia em tempo real.

Lesão Vessel Mecânica em embriões Zebrafish

regeneração de retina de peixe-zebra foi principalmente estudada usando retinas fixos. No entanto, os processos dinâmicos, como a migração nuclear interkinetic ocorrer durante a resposta regenerativa e exigem processamento de imagem de células vivas para investigar os mecanismos subjacentes. Aqui, descrevemos as condições de cultura e de imagem para monitorar Migração Nuclear Interkinetic (INM) em tempo real através de microscopia multiphoton.

Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

O peixe-zebra é um popular modelo animal para estudar os mecanismos da degeneração/regeneração da retina em vertebrados. Este protocolo descreve um método para induzir lesões localizadas perturbar a retina exterior com danos mínimos à retina interna. Posteriormente, acompanhamos na vivo a morfologia da retina e a resposta de glia Müller em toda a regeneração da retina.

Ativação de células da Müller Glia em um modelo de regeneração no Zebrafish e degeneração retiniana induzida por Laser

Aqui, descrevemos 3 modelos de lesão de zebrafish adultos e seu uso combinado com tratamento de drogas imunossupressoras. Nós fornecemos orientação nas imagens de regenerar tecidos e na detecção de mineralização óssea nele.

Modelos de lesão adulto Zebrafish para estudar os efeitos de prednisolona na regeneração de tecido ósseo

Modificamos o modelo de queda de peso de Marmarou para o zebrafish adulto para examinar uma amplitude de patologias após lesão cerebral traumática por força bruta (TCE) e os mecanismos subjacentes à regeneração neuronal subsequente. Este modelo de TBI de força bruta é escalável, induz um TCE leve, moderado ou grave, e recapitula a heterogeneidade da lesão observada no TBI humano.

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O artigo explica como remover cirurgicamente os olhos das larvas vivas de zebrafish como o primeiro passo para investigar como a entrada da retina influencia o crescimento e o desenvolvimento do tectum óptico. Além disso, o artigo fornece informações sobre anestesia larval, fixação e dissecção cerebral, seguida de imunohistoquímica e imagem confocal.

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Este protocolo se concentra em danificar a superfície ocular do zebrafish através da abrasão para avaliar o subsequente fechamento da ferida no nível celular. Esta abordagem explora uma rebarba ocular para remover parcialmente o epitélio corneo e usa microscopia eletrônica de varredura para rastrear mudanças na morfologia celular durante o fechamento da ferida.

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Aprenda o modelo de lesão por punção no tecto óptico de zebrafish adultos para estudar mecanismos moleculares da regeneração neural. Este método simples avalia proliferação e diferenciação de células gliais radiais.

Modelo de Lesão por Arma Branca do Adulto Óptico Utilizando Zebrafish e Medaka para Análise Comparativa da Capacidade Regenerativa (Vídeo) | JoVE Journal

Modelo de Lesão por Arma Branca do Adulto Óptico Utilizando Zebrafish e Medaka para Análise Comparativa da Capacidade Regenerativa

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