Preparação Biológica e Técnica Mecânica para Determinar Propriedades Viscoelásticas de Fibras Zonulares

A importância do nosso método reside na sua capacidade de responder à pergunta, quais são as propriedades viscoelásticas das fibras zonulares, as fibras que suspendem a lente dentro do olho? A principal vantagem de nossa técnica é que ela pode quantificar as propriedades viscoelásticas das pequenas e delicadas fibraszonulares de camundongos com e sem modificações genéticas direcionadas. Mutações em genes que codificam proteínas microfibrilas estão por trás de várias condições sindêmicas herdadas.

Usando nossa técnica, podemos investigar como mutações específicas alteram as propriedades biomecânicas dos microfibrils. Para começar, pós-eutanásia do mouse, remova os olhos usando fórceps finos. Insira a ponta de uma agulha de fixação através da parede do olho e posicione-a no centro do humor vítreo, tomando cuidado para não danificar a lente.

Transfira cuidadosamente o olho empalado para um tubo cheio de 4% de paraformaldeído e salina tamponada de fosfato. Abra a válvula que conecta a agulha a um reservatório fixado localizado 25 centímetros acima da amostra, que mantém uma pressão positiva equivalente a 15 a 20 milímetros de mercúrio dentro do olho durante o período de fixação e deixe a amostra para corrigir durante a noite. No dia seguinte, remova a agulha de fixação e lave o olho por 10 minutos em soro fisco tamponado.

Ao empregar uma tesoura cirúrgica oftálmica e um microscópio estéreo, faça uma incisão de espessura total na parede do olho perto da cabeça do nervo óptico. Estenda o corte para a frente em direção ao equador e, em seguida, em torno da circunferência equatorial do olho, poupando cuidadosamente os delicados processos ciliares e fibraszonulares associadas. Exponha a superfície posterior da lente removendo a parte de trás do globo.

Remova o olho dissecado da solução tampão usando fórceps e coloque-o em uma limpeza de tarefa seca com a córnea voltada para baixo. Arraste suavemente a córnea sobre a superfície da limpeza para secá-la. Aplique uma gota de cola instantânea no fundo de uma placa de Petri de 50 milímetros e fixe a plataforma a ela.

Coloque o prato na placa do palco do microscópio estéreo para que o poço com a cola esteja à vista. Para acomodar o olho nos poços de plataforma da placa de Petri, adicione três microliters de cola instantânea. Coloque-o cuidadosamente no poço e ajuste rapidamente para que a parte de trás da lente fique virada para cima.

Seque o lado exposto da lente manchando suavemente com o canto de uma limpeza seca. Para medir a resposta viscoelástica zonular, ligue a balança, coloque a placa de Petri na escala e inicie o programa de registro de escala e o software da câmera. Ligue o controlador servomotor.

Inicie a aplicação do controlador no computador e defina os parâmetros de movimento com incrementos de 50 micrômetros. Crie 90 graus de dobra em uma haste capilar. Coloque o capilar dobrado no suporte da sonda capilar e aperte os parafusos de fixação.

Na ponta capilar, adicione uma pequena pérola de cola de cura UV. Mova a ponta da sonda capilar usando os ajustes manuais no manipulador e coloque-a diretamente sobre a parte superior da lente. Através da inspeção visual frontal e da vista lateral usando uma câmera de microscópio, examine que a parte inferior da cola UV aparece centrada sobre a parte superior da lente.

Ao olhar através da câmera, baixe a ponta da sonda até que a cola UV faça contato com a lente e cubra de 1/3 a 1/2 de sua superfície superior. Cure a cola usando uma fonte de luz UV quase visível direcional de 380 a 400 nanômetros e uma intensidade de cerca de um miliwatt. Adicione a solução PBS à placa de Petri até que o olho esteja coberto a uma profundidade de pelo menos dois milímetros.

Coloque uma lente cilíndrica na frente do microscópio e de uma forma próxima à placa de Petri sem tocá-la. Ao mesmo tempo, inicie o registro em um programa de temporizador. Tire uma foto do olho e da sonda usando a câmera.

Após 60 segundos, comece um deslocamento de 50 micrômetros. Repita a cada 60 segundos até que o experimento seja concluído como indicado pela quebra de todas as fibras zonulares. Salve os dados de registro de escala após a conclusão de uma execução e exporte-os para um formato de planilha compatível.

Além disso, salve as imagens das lentes obtidas durante a execução. Importe os dados em uma planilha. Usando a leitura da primeira e última escala, interpolar a deriva na leitura de fundo ao longo do tempo devido à evaporação, em seguida, subtrair o fundo interpolado da leitura em cada ponto de tempo.

Após a realização do ensaio e correção para evaporação, o gráfico dos dados viscoelásticos é invertido. A magnitude das forças instantâneas e relaxadas aumenta a cada passo até cerca de 1.000 segundos, em seguida, cai à medida que as fibraszonulares começam a quebrar até que o ponto de tempo de 1.500 segundos é atingido quando todas as fibras são quebradas. Para esta demonstração, também foram comparadas as respostas viscoelásticas para tipo selvagem e camundongos deficientes magp-1.

No tempo inicial de zero a 600 segundos, os gráficos se assemelham uns aos outros sugerindo que as propriedades viscoelásticas das fibras zonulares não foram significativamente alteradas. No entanto, no rato nocaute MAGP-1, as fibras quebram prematuramente. As forças de quebra de fibras zonulares foram obtidas com o método pull-up para ratos magp-1 versus tipo selvagem em estágios de um mês e um ano de idade.

Os resultados indicaram que a força das fibras aumenta com a idade para ratos do tipo selvagem. Qualquer contato acidental com a placa de Petri durante esses passos pode fazer com que a parede do olho mude em relação à lente ocular, potencialmente danificando as fibraszonulares. Este ensaio de pull-up ajuda a identificar proteínas que contribuem para a resistência à tração dos microfibrils.

Usaremos essas informações para construir modelos mais realistas do interior das fibras zonulares.