Determinando o papel dos genes materno-expressos no desenvolvimento inicial com crispants maternos

O papel de muitos genes expressos maternalmente durante o desenvolvimento inicial é atualmente desconhecido. Esta técnica materna CRISPR permite a rápida identificação de genes de efeito materno e seu papel no desenvolvimento. A multiplexação guia os RNAs para um único gene, permite que os pesquisadores identifiquem novos fenótipos de efeito materno em uma única geração.

Esta pesquisa é benéfica para entender a função dos transcritos de mRNA nos gametas, que são necessários para a embriogênese precoce. A chave para esta técnica é micro injetar os embriões no início do estágio de uma célula, e verificar se a maioria dos RNAs guia pode fazer mutações somáticas nos embriões injetados. Para criar um modelo de RNA guia para cada oligonucleotídeo específico do gene, analite o oligonucleotídeo constante e preencha as saliências com DNA polimerase T4.

Depois que os quatro modelos de RNA guia forem montados, purifice-os e concentre-os juntos usando um kit de limpeza e concentrador de DNA. Sintetize a mistura de sgRNA a partir do modelo de RNA pooled, usando um kit de transcrição T7 in vitro, e realize a transcrição in vitro conforme descrito no manuscrito. Para verificar a integridade do sgRNA, lançar um 1%agarose 0,5 microgramas por mililitro, brometo de etídio Tris-Borato-EDTA gel.

Coloque o gel solidificado no tampão de corrida Tris-Borato-EDTA. Misture uma mistura de sgRNA de microlitros e um tampão de carregamento de gel de RNA de microlitro. Carregue esta amostra no gel e passe o gel a 100 volts por cinco minutos.

Visualize as bandas usando luz ultravioleta. Configure cruzes de tipo selvagem e caixas de acasalamento de peixe-zebra. Mantenha os peixes machos e fêmeas no mesmo tanque, mas separe-os usando um divisor de caixa de acasalamento, ou como mostrado aqui, colocando a fêmea dentro de uma inserção de postura de ovos.

Depois que o coquetel de injeção for montado, permita que o macho e a fêmea acasalem removendo o divisor da caixa de acasalamento ou, como mostrado aqui, colocando o macho na mesma inserção de postura de ovos que a fêmea. Para sincronizar os embriões, colete-os após 10 minutos usando um filtro de plástico e enxágue-os em uma placa de Petri usando meios 1XE3. Remova 10 a 15 embriões e coloque-os em uma placa de Petri separada para serem mantidos como controles não injetados.

Transfira os embriões restantes para os poços da placa de injeção. Injete uma solução de sgRNA de proteína de nanolitro no disco de blasto em desenvolvimento de um embrião de uma célula. Use fórceps para quebrar a ponta da agulha entupida e recalibrar a agulha para ejetar um bolo de um nanolitro.

No dia seguinte após a injeção, colete seis embriões saudáveis injetados e dois embriões de controle da placa não injetada. Coloque cada embrião individualmente em um único poço de um tubo de tira de PCR e rotule a parte superior dos tubos. Projete iniciadores de triagem exclusivos para cada local de guia para amplificar um fragmento de DNA emparelhado de 100 a 110 bases que inclui o local alvo CRISPR-Cas9.

Se possível, coloque o local de destino no meio do fragmento amplificado, permitindo a identificação de exclusões maiores. Para cada um dos quatro locais-alvo de guia, configurar oito reações de PCR de 25 microlitros usando cinco microlitros do DNA embrigenomico único preparado e 20 microlitros da mistura de PCR, e orientar a mistura específica de primers de triagem, para identificar mutações somáticas no local alvo. Lançar um 2,5%agarose, 0,5 microgramas por mililitro de brometo de etídio Tris-Borato-EDTA gel usando pentes que criam poços de aproximadamente 0,625 centímetro de largura.

Em seguida, coloque o gel solidificado na câmara de eletroforese contendo o tampão de corrida Tris-Borato-EDTA. Adicione cinco microlitros de corante de carga 6X ao produto de PCR. Carregue 25 microlitros desta mistura no gel, garantindo que as amostras injetadas e de controle estejam funcionando na mesma linha de gel.

Depois que todas as amostras forem carregadas, adicione cinco microlitros de brometo de etídio por um litro de tampão de corrida Tris-Borato-EDTA à extremidade positiva da caixa de gel. Execute o gel a 120 volts até que as proibições de DNA se resolvam ou o DNA se aproxime do final da pista. Para identificar os fenótipos de efeito materno e os embriões maternos de CRISPR, configurar as fêmeas injetadas F0 contra machos do tipo selvagem e controlar cruzamentos do tipo selvagem em caixas de acasalamento de peixes-zebra padrão durante a tarde anterior ao experimento.

Coloque os peixes machos e fêmeas no mesmo tanque, mas separe-os com um divisor de caixa de acasalamento, ou coloque a fêmea dentro de uma inserção de postura de ovos. Na manhã do experimento, permita que o macho e a fêmea comecem a acasalar removendo o divisor da caixa de acasalamento ou colocando o macho na mesma inserção de postura de ovos que a fêmea. Colete os embriões a cada 10 minutos, movendo a inserção de postura de ovos em um novo fundo de tanque de acasalamento que contenha água fresca do sistema e rotule o tanque com uma etiqueta identificando a fêmea F0 individual.

Pegue o velho tanque de acasalamento e despeje a água através de um coador T para coletar os embriões de uma embreagem individual de 10 minutos. Sob um microscópio de dissecação com uma fonte de luz transcendente, observe os embriões em desenvolvimento a cada hora, durante as primeiras seis a oito horas e diariamente pelos próximos cinco dias. Mover os potenciais embriões CRISPR maternos para uma placa de Petri que contenha 1XE3 e ensaio para fenótipo morfológico em 24 horas após a fertilização e viabilidade, em cinco dias após a fertilização.

Na tarde anterior ao experimento, configure pares de fêmeas F0 de acasalamento, mantendo os machos do tipo selvagem fisicamente separados das fêmeas, usando um divisor de caixa de acasalamento ou colocando a fêmea na inserção de postura de ovos. Na manhã do experimento, remova a partição física para iniciar o acasalamento. Ao primeiro sinal de postura de ovos, interrompa a reprodução separando as fêmeas macho e F0 e mantenha cada fêmea F0 separada em caixas de acasalamento individuais.

Após a fertilização in vitro, permita que os embriões haploides se desenvolvam até que o fenótipo CRISPR materno seja observado e coloque esses embriões em uma placa de Petri diferente. Uma vez que os embriões haploides CRISPR maternos tenham sido identificados, permita que eles se desenvolvam por pelo menos seis horas após a fertilização. Para extrair o DNA genômico de pelo menos 10 embriões haploides CRISPR maternos, coloque um único embrião haploide em um poço individual de um tubo de tira de PCR, remova o excesso de meios E3 do poço e adicione 50 microlitros de hidróxido de sódio milimolar.

Incube os embriões por 20 minutos a 95 graus Celsius e resfrie-os a quatro graus Celsius. Em seguida, adicione cinco microlitros de um molar de ácido tris-clorídrico com pH 7,5 e vórtice por cinco a 10 segundos. Para identificar quais locais de guia contêm indels, projete iniciadores de sequenciamento para amplificar um fragmento de DNA, incluindo todos os quatro locais-alvo CRISPR/Cas9.

Configure dois 25 microlitros de reações de PCR por embrião, usando cinco microlitros do DNA genômico preparado e os primers de sequenciamento. Após o término da PCR, purifice e concentre as duas amostras usando um kit de limpeza e concentrador de DNA e submeta o fragmento de DNA ao sequenciamento de Sanger, usando os primers de sequenciamento para frente e para trás. Os RNAs guia devem ser todos agrupados com regiões de sobreposição mínima ou nenhuma entre os RNAs guia durante a geração materna de CRISPR.

Se os indels foram criados, um esfregaço deve ser observado nas amostras injetadas em um gel de agarose, mas não no controle não injetado. O método CRISPR materno pode ser usado para fenocopiar mutações de efeito materno conhecidas, como heterogêneas, tmi e aura. Para identificar as lesões genéticas que contribuem para o fenótipo CRISPR materno, espermatozoides tratados com UV e fertilização in vitro são combinados para criar haploides CRISPR maternos.

A criação de um haploide permite o sequenciamento de Sanger do alelo materno e a identificação de indels CRISPR maternos. Ao identificar um fenótipo de efeito não materno, é essencial que você seja capaz de observá-lo em várias fêmeas F0, porque aumenta as chances de que o fenótipo seja causado por perda de função, não fora do alvo ou efeitos não específicos. Depois que um fenótipo de efeito materno foi identificado, os embriões CRISPR maternos podem ser usados para examinar os efeitos em vários aspectos da embriogênese precoce, como o esqueleto sinusal ou a segregação do DNA.

Isso permite que os pesquisadores entendam a causa molecular do fenótipo. Este método testa diretamente a função de genes desconhecidos expressos maternalmente em uma única geração, agilizando nossa compreensão dos processos, atuando durante a embriogênese precoce.