Name: Investigando o Metabolismo Cardíaco no Coração de Rato Perfundido Isolado com Piruvato Hiperpolarizado 1-13C Piruvato e Espectroscopia de RMN 13C/31P (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Aprenda a avaliar o metabolismo cardíaco em tempo real usando corações de rato perfundidos isolados com piruvato hiperpolarizado [1-13C] e espectroscopia de RMN 13C/31P. Este protocolo permite quantificar a atividade da LDH e PDH.

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Este projeto recebeu financiamento da Israel Science Foundation sob o contrato de subvenção nº 1379/18; a Bolsa Jabotinsky do Ministério da Ciência e Tecnologia de Israel para Ciências Aplicadas e de Engenharia para Estudantes de Doutorado Direto No. 3-15892 para D.S.; e o programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo da convenção de subvenção n.º 858149 (AlternativesToGd).

O comitê conjunto de ética (IACUC) da Universidade Hebraica e do Hadassah Medical Center aprovou o protocolo de estudo para o bem-estar animal (MD-19-15827-1).
1. Preparação do tampão de Krebs-Henseleit
<ol><li>Um dia antes do experimento, prepare uma versão modificada do buffer de Krebs-Henseleit (KHB)26. Inicialmente, dissolver 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,5 mM piruvato, 1,2 mM MgSO 4, 25 mM NaHCO3 e 1,2 mM KH 2 PO4 em H2O de destilação dupla.</li>
	<li>Borbulhe esta mistura com 95%/5% O 2/CO 2 por 20 min e, em seguida, adicione 1,2 mM CaCl2.</li>
	<li>Ajuste o pH do tampão para 7,4 com HCl ou NaOH.</li>
	<li>No dia do experimento, adicionar 10 mM de glicose e 72 U/L de insulina ao KHB preparado na etapa 1.2. NOTA: A insulina é adicionada ao tampão de perfusão conforme descrito no trabalho de Kolwicz et al.26 e em concordância com estudos anteriores relatando que a insulina aumenta a função contrátil27 e a intensidade do sinal de bicarbonato hiperpolarizado [13C]28.</li>
</ol>2. Preparação do sistema de perfusão
<ol><li>Manter um reservatório de 200 mL de KHB em banho-maria a 40 °C e borbulhar com 95%/5% O 2/CO2 a uma taxa de fluxo de 4 L/min por 1 h antes da perfusão cardíaca. Mantenha o tampão continuamente borbulhando com esta mistura de gases durante todo o experimento.<ol><li>Primeiro, ajuste o banho-maria para 40 °C. Insira o reservatório KHB. Use uma bomba peristáltica (ver Tabela de Materiais) e tubos de extensão de grau médico para recircular o KHB entre o reservatório tampão e o tubo de RMN de 10 mm a uma taxa de fluxo constante de 7,5 mL/min.</li>
		<li>Conecte três tubos de silicone curados com platina (3 mm i.d.) à bomba (um tubo de entrada e dois tubos de saída para o buffer KH). Insira as linhas de saída e de entrada no buffer KH aquecido. Em seguida, insira a linha de oxigênio no tampão KH aquecido.</li>
		<li>Use linhas finas de éter de poliéter cetona (PEEK, consulte Tabela de Materiais) para que o buffer e o agente hiperpolarizado fluam de e para o tubo de RMN dentro do furo do espectrômetro.</li>
	</ol></li>
	<li>Certifique-se de que a temperatura é mantida em 37-37,5 °C. Siga os passos abaixo.</li>
	<li>Envolva a linha de entrada (do reservatório tampão para o tubo de RMN) com uma fita de aquecimento ajustada para 42 °C.</li>
	<li>Aqueça o tubo de RMN dentro do espectrômetro com um fluxo de ar quente que é regulado pelo espectrômetro.</li>
	<li>Use um sensor de temperatura compatível com RMN (consulte Tabela de Materiais) para medir a temperatura dentro do tubo de RMN. A temperatura é ajustada para 37-37,5 °C.</li>
</ol>3. Calibração e preparação do espectrômetro de RMN para aquisição
<ol><li>No dia do experimento, insira uma amostra padrão de 13 C que contenha 1,4-dioxano (Tabela de Materiais) no espectrômetro e ajuste e combine a sonda de RMN para 13C. Em seguida, obtenha um espectro mostrando o sinal de equilíbrio térmico de 1,4-dioxano com um ângulo de nutação de 90°.</li>
	<li>Agora troque a amostra padrão de 13C por uma amostra padrão de 31 P (Tabela de Materiais), que contém 105 mM de ATP em D2O. Tune e corresponda à sonda NMR para 31P. NOTA: Um espectro que mostra os sinais de fosfato de equilíbrio térmico é obtido com um ângulo de nutação de 50°.</li>
	<li>Insira a linha de entrada, a linha de saída e a sonda de temperatura em um tubo de RMN de 10 mm e, em seguida, insira o tubo no furo magnético. Ajustar a fita de aquecimento a 42 °C.</li>
	<li>Adquira um espectro de RMN de 31 P do tampão KH circulante a ser usado nesse experimento por 30min, com um ângulo de nutação de 50° e um TR de 1,1 s (1.640 aquisições).</li>
</ol>4. Preparação animal, procedimento cirúrgico e perfusão do coração no tubo de RMN
<ol><li>Anestesiar um camundongo macho HSD:ICR (CD-1) com isoflurano a 3,3% em ar ambiente (Tabela de Materiais) a 340 mL/min por 5 min utilizando um sistema de anestesia gasosa (Tabela de Materiais) em câmara de indução.</li>
	<li>Utilizar anestesia nasal para a manutenção da anestesia geral com isoflurano a 2,9%. NOTA: Cuidados são tomados para minimizar a dor e o desconforto para o animal.</li>
	<li>Prenda os membros do animal com fita adesiva, assegure um reflexo negativo de dor no pedal e, em seguida, injete 300 UI de heparina sódica por via intraperitoneal.</li>
	<li>Molhe a parede torácica e o abdômen do rato completamente com álcool a 70% para garantir a limpeza e evitar a contaminação ou obstrução do cabelo durante o procedimento cirúrgico.</li>
	<li>Em 1 min após a injeção de heparina, corte a pele e o músculo da cavidade abdominal com uma pequena tesoura.</li>
	<li>Coloque o pequeno grampo de mosquito com bloqueio de hemostático de mandíbula curva entre o processo xifoide e a pele do peito para levantar o peito e expor o diafragma. Punção e corte o lobo direito do diafragma.</li>
	<li>Corte o peito através da linha média, retraia para os lados e, em seguida, remova.</li>
	<li>Injete o ventrículo esquerdo do coração com 200 UI de heparina sódica para evitar a coagulação do sangue. Em seguida, injete 0,1 mL de KCl gelado a 0,5 mol/L para atingir a parada cardíaca, conforme descrito anteriormente25. A parada cardíaca é essencial para poder canular o coração.</li>
	<li>Identifique o timo e remova-o usando uma tesoura para expor a aorta. Remova o tecido residual da caixa torácica.</li>
	<li>Identifique o arco aórtico e use pinças curvas para colocar um nó solto com uma sutura de seda 3-0 (Tabela de Materiais) ao redor da aorta ascendente. Injete 3 mL de KHB no ventrículo esquerdo para remover coágulos sanguíneos da aorta.</li>
	<li>Use pinça curva para retrair o coração inferiormente para melhor visualização da aorta ascendente.</li>
	<li>Realizar a canulação in situ com cateter intravenoso 22 G (Tabela de Materiais). Aplique adesivo de cianoacrilato na região canulada e, em seguida, realize a amarração de sutura dupla. Injete tampão KH adicional no coração e verifique se ele flui através do tubo de canulação.</li>
	<li>Remova a pinça curva. Desconecte o coração das vísceras circundantes e perfunda-o retrógradamente com KHB gelado (4 °C) através do cateter intravenoso.</li>
	<li>Conecte o coração à linha de entrada do sistema de perfusão através do cateter intravenoso. Após o início da perfusão com tampão quente (37-37,5 °C) a 7,5 mL/min, o coração começa a bater espontaneamente.</li>
	<li>Fixe o tubo de RMN com o coração batendo, as linhas de saída e a sonda de temperatura e insira no furo do espectrômetro, certificando-se de que o coração esteja no centro da sonda de RMN.</li>
</ol>5. Aquisição de dados para energia cardíaca e pH
<ol><li>Adquira espectros de 31P por cerca de 1 h com um ângulo de inversão de 50 ° e um TR de 1,1 s.</li>
</ol>6. Polarização e dissolução do spin DNP
<ol><li>Prepare uma formulação de 28,5 mg de [1-13C]piruvato. Esta formulação consiste em 11,1 mM a 14,0 mM OX063 radical no ácido puro.</li>
	<li>Preparar 4 ml de meio de dissolução. O meio de dissolução consiste em tampão TRIS-fosfato, que contém 11,2 mM NaH 2 PO 4, 38,8 mM Na 2 HPO4, 33 mM TRIS e2mM HCl. Esta composição do meio é ajustada de tal forma que, após a adição de 28,5 mg de formulação de ácido [1-13C]pirúvico a 4 mL deste tampão (na fase de dissolução), o pH da solução resultante será de 7,4.</li>
	<li>Execute a polarização por rotação e a dissolução rápida em um dispositivo de polarização por rotação DNP (dDNP) de acordo com as instruções do fabricante (Tabela de Materiais). Aplicar irradiação de micro-ondas a uma frequência de 94,110 GHz para a polarização da formulação de ácido [1-13C]pirúvico a 1,45 K a 1,55 K por cerca de 1,5 h.</li>
	<li>Misture rapidamente os 4 mL de meio hiperpolarizado do dispositivo dDNP com uma solução bem oxigenada que complemente o meio de dissolução hiperpolarizado para obter uma composição próxima ao meio de perfusão. NOTA: O volume final do meio que perfunde o coração durante as injeções hiperpolarizadas com 14 mM hiperpolarizados [1-13C]piruvato é de 26 mL. A composição final do meio injetado (após mistura) contém 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 70 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 1,2 mM KH 2 PO4, 10 mM de glicose, 1,2 mM CaCl2e 72 U/L de insulina.</li>
	<li>Administrar o meio hiperpolarizado contendo [1-13C]piruvato ao coração isolado usando uma configuração de fluxo contínuo29. NOTA: Isso é feito para garantir que a perfusão cardíaca não seja perturbada em nenhum momento durante o experimento e que o meio hiperpolarizado seja administrado a uma taxa conhecida e por uma duração conhecida.</li>
</ol>7. Espectroscopia hiperpolarizada de 13C
<ol><li>Adquirir dados hiperpolarizados de 13 C usando pulsos de saturação-excitação seletivos do produto 15 aplicando pulsos de seno cardinal (Sinc) de 2,5 ms, conforme descrito anteriormente15,16. Excitar seletivamente [1-13 C]lactato e [13C]bicarbonato consecutivamente em intervalos de 6 s para obter um intervalo de 12s para cada metabólito.</li>
	<li>Para a detecção de [1-13 C]lactato, centralize o pulso seletivo de Sinc na frequência de hidrato de [1-13 C]piruvato (179,4 ppm), o que resulta em razão de intensidade de sinal (lac) de 0,113 para os sinais C 1 de [1-13 C]piruvato para [1-13C]lactato.</li>
	<li>Para a detecção de [13 C]bicarbonato, centralize o pulso seletivo de Sinc em 157,7 ppm, que é 214 Hz de campo descendente do sinal de [13C]bicarbonato (161,1 ppm); isso resulta em uma razão de intensidade de sinal (bic) de 0,139 para o sinal C 1 de [1-13C]piruvato para [13C]bicarbonato.</li>
</ol>8. Determinação do peso e volume húmidos do tecido
<ol><li>No final do experimento, desprenda o coração do sistema de perfusão e seque-o suavemente com papel de seda. Posteriormente, pese o coração para obter o peso úmido do tecido.</li>
	<li>Determinar o volume do coração usando um fator de densidade de 1,05 g/cm3, conforme determinado anteriormente para o coração do rato30.</li>
</ol>9. Quantificação do teor de ATP
<ol><li>Integrar o sinal γ-ATP de uma única aquisição da amostra padrão ATP e uma aquisição de 30 min (TR de 1,1 s e 1.640 aquisições) do coração isolado.</li>
	<li>Quantifique o conteúdo de ATP do coração comparando a integral do sinal γ-ATP do coração com o do padrão (Tabela de Materiais), onde este último tem uma concentração conhecida (105 mM), e corrigir o número de aquisições e efeitos de relaxamento.</li>
</ol>10. Resolvendo o sinal Pi do coração
NOTA: Para avaliar o pH tecidual, primeiro é necessário dissociar o sinal Pi do coração do sinal Pi total (Pit). Isso é feito omitindo o sinal do KHB Pi (PiKH) do sinal do Pit.
<ol><li>Em um espectro de 31P de KHB que mostra um único sinal Pi (Pi KH, Figura 1A), ajuste o sinal PiKH a uma função lorentziana usando o Excel (Tabela de Materiais).</li>
	<li>O volume visível para a sonda de RMN (Vp, 1,375 mL), contém mais KHB quando o tubo de amostra não contém o coração. Para corrigir esse efeito de enchimento, calcule o sinal de buffer atenuado (Pib) usando a Eq. 1A. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq01.jpg" style="margin: auto;">Equina 1A onde Vh é o volume do coração, conforme determinado na etapa 8.</li>
	<li>Subtraia este sinal do Pit de acordo com a Eq. 1B para obter o sinal Pi proveniente exclusivamente do coração perfundido (Pih, Figura 1B). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq02.jpg" style="margin: auto;">Eq. 1B</li>
</ol>11. Análise multiparamétrica do pH
<ol><li>Realizar a conversão da distribuição do deslocamento químico do sinal de Pih para o pH com referência ao deslocamento químico do PCr usando a Eq. 231. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq03.jpg" style="margin: auto;">Equina 2 onde Δδ é a diferença de deslocamento químico, pKa é 6,72, δ base livre é 5,69 e δ ácido livre é 3,27, conforme descrito anteriormente31.</li>
	<li>Corrigir a curva de distribuição de pH resultante para a não linearidade entre a escala de deslocamento químico de Pih e a escala de pH de acordo com Lutz et al.32. Uma distribuição típica do pH resultante desse cálculo é apresentada na Figura 1C.</li>
	<li>Analisar a distribuição do pH tecidual com uma abordagem multiparamétrica utilizando sete parâmetros estatísticos seguindo o trabalho de Lutz et al. 32. Quatro desses parâmetros são apresentados aqui, pois parecem ser os mais descritivos do pH tecidual: 1) pH máximo global; 2) pH médio ponderado; 3) pH mediano ponderado; e 4) distorção do gráfico de pH (Figura 1C).</li>
</ol>12. Cálculo das atividades LDH e PDH
NOTA: As taxas de produção dos metabólitos hiperpolarizados [1-13 C]lactato e [13C]bicarbonato são utilizadas para calcular as actividades LDH e PDH, respectivamente. Na abordagem de saturação-excitação seletiva do produto15, apenas metabólitos hiperpolarizados recém-sintetizados são detectados por cada excitação seletiva.
<ol><li>Use o sinal hiperpolarizado [1-13C]piruvato como referência para determinar o nível de produção de metabólitos correspondente.<ol><li>Durante a perfusão com o meio hiperpolarizado, a concentração de [1-13C]piruvato no tubo de RMN aumenta (wash-in), depois se estabiliza (a uma concentração máxima de 14 mM) e depois diminui (wash-out).</li>
		<li>Para identificar os pontos de tempo em que a concentração de piruvato atingiu um nível constante (platô), corrija o sinal de [1-13C]piruvato para o decaimento do sinal resultante do relaxamento de T1 e da pulsação de RF usando a constante de relaxamento efetiva, Teff.</li>
		<li>Para cada injeção, defina o Teff com base em sua capacidade de corrigir a curva de decaimento do [1-13C]piruvato para mostrar essa dinâmica de fluxo (Eq.3). <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq04.jpg" style="margin: auto;">Equina 3 onde <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq05.jpg" style="margin: auto;"> é o sinal de [1-13 C]piruvato que foi adquirido durante a aquisição de [13C]bicarbonato. A média de Teff nos experimentos aqui descritos foi de 35,8 s ± 2,3 s (n = 5 corações).</li>
		<li>Selecione os pontos de dados em que a concentração está dentro de 10% do sinal máximo corrigido [1-13C]piruvato para análise posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizar os dados correspondentes de produção de [1-13 C]lactato e [13C]bicarbonato para os pontos de tempo selecionados no passo 12.1 para o cálculo das taxas de produção de metabolitos utilizando a Eq. 4A e a Eq. 4B, desde que o SNR do sinal do metabolito seja superior a 2 (limiar para análise). Um exemplo típico de tal seleção de pontos de tempo é mostrado na Figura 2B (janela temporal realçada).</li>
	<li>Calcule as taxas de produção de cada um dos pontos de dados selecionados usando a Eq. 4A e a Eq. 4B: <img alt="Equation 17" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq17.jpg" style="margin: auto;">Equina 4A <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq06.jpg" style="margin: auto;">Equina 4B onde <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq07.jpg" style="margin: auto;"> e são as taxas de produção de [1-13 C]lactato ou [13 C]bicarbonato em cada ponto de tempo, respectivamente. e são fatores que representam a excitação relativa de [1-13 C]piruvato e <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq08.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq10.jpg" style="margin: auto;"> os produtos [1-13 C]lactato ou [13C]bicarbonato, respectivamente.<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq09.jpg" style="margin: auto;"> Esses fatores foram determinados previamente como sendo 0,113 e 0,139, respectivamente29. Vp é o volume que é detectado pela sonda de RMN (1,375 mL), TR denota o intervalo de tempo entre duas excitações seletivas consecutivas de saturação do produto (12 s para cada produto), <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq11.jpg" style="margin: auto;"> e são os sinais de [1-13 C]lactato e [13 C]bicarbonato, respectivamente, e <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq14.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq13.jpg" style="margin: auto;"> são os sinais de [1-13 C]piruvato que foram adquiridos durante o [1-13 C]lactato e <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq12.jpg" style="margin: auto;"> [13 Excitações de C]bicarbonato, respectivamente. [Pyr] é a concentração de [1-13C]piruvato, que foi de 14 mM durante a fase de platô.<ol><li>Determine a taxa para cada ponto e, em seguida, a média por injeção hiperpolarizada.</li>
	</ol></li>
</ol>

Não há divulgações.

Demonstramos uma configuração experimental projetada para investigar o metabolismo hiperpolarizado do [1-13C]piruvato, a energia tecidual e o pH em um modelo isolado de coração de camundongo.
As etapas críticas dentro do protocolo são as seguintes: 1) garantir que o pH do tampão seja de 7,4; 2) assegurar que todos os componentes da reserva sejam incluídos; 3) evitar a coagulação do sangue nos vasos cardíacos por injeções de heparina; 4) evitar danos isquêmicos ao coração, reduzindo ...

Alterações no metabolismo cardíaco estão associadas a uma variedade de cardiomiopatias e muitas vezes formam a base dos mecanismos fisiopatológicos subjacentes1. No entanto, existem inúmeros obstáculos para estudar o metabolismo em tecidos vivos, já que a maioria dos ensaios bioquímicos requer a homogeneização do tecido e lise celular e / ou rastreamento radioativo. Portanto, há uma necessidade premente de novas ferramentas para investigar o metabolismo miocárdico em tecidos vivos. A ressonância magnética (RM) de substratos hiperpolarizados marcados com 13C permite medições em tempo real do metabolismo em tecidos vivos2, sem o uso de radiação ionizante, aumentando a relação sinal-ruído (SNR) por RM do(s) sítio(s) marcado(s) em várias ordens de magnitude3. Aqui, descrevemos uma configuração experimental, uma abordagem de aquisição e uma abordagem analítica para estudar o metabolismo rápido no coração isolado de camundongos e, em paralelo, apresentar indicadores de energia e acidez tecidual geral. O pH cardíaco é um indicador valioso, pois o equilíbrio ácido-base é interrompido nos estágios iniciais de doenças cardíacas e condições como isquemia miocárdica, hipertrofia desadaptativa e insuficiência cardíaca6.
A produção de [1-13 C]lactato e [13 C]bicarbonato hiperpolarizados a partir do [1-13C]piruvato hiperpolarizado ajuda a determinar as taxas de produção de lactato desidrogenase (LDH) e piruvato desidrogenase (PDH). A maioria dos estudos prévios realizados utilizando substratos hiperpolarizados no coração de roedores isolados utilizou modelos cinéticos complexos para derivar a atividade enzimática da LDH e PDH, ou relatou as razões de intensidade de sinal do produto hiperpolarizado para um substrato sem calcular as taxas reais de atividade enzimática 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Aqui, utilizou-se a abordagem de saturação-excitação seletiva do produto 15, que permite o monitoramento da atividade enzimática de forma livre de modelos15,16. Desta forma, as taxas enzimáticas absolutas (ou seja, o número de moles de produto produzido por unidade de tempo) foram determinadas. 31 anos A espectroscopia P foi utilizada para observar os sinais de fosfato inorgânico (Pi), fosfocreatina (PCr) e trifosfato de adenosina (ATP). Uma análise multiparamétrica foi utilizada para caracterizar a distribuição do pH do coração, como demonstrado pelo deslocamento químico heterogêneo no sinal Pi do tecido.
O coração de rato retrógrado perfundido (coração de Langendorff)17,18,19 é um modelo ex vivo para o coração que bate intacto. Nesse modelo, a viabilidade cardíaca e o pH são preservados por pelo menos 80 min20, e tem demonstrado potencial de recuperação após lesão isquêmica prolongada21,22. No entanto, a variabilidade inadvertida durante a microcirurgia pode levar à variabilidade na viabilidade tecidual entre os corações. Estudos anteriores relataram a deterioração desse coração ao longo do tempo19; por exemplo, observou-se uma redução na função contrátil de 5%-10% por hora18. O sinal do trifosfato de adenosina (ATP) já demonstrou relatar o estado energético miocárdico e a viabilidade23. Aqui, observamos que o coração perfundido pode, ocasionalmente, apresentar variabilidade não intencional nos níveis de viabilidade, como demonstrado pelo teor de ATP, apesar de termos tido uma perfusão ininterrupta e suprimento de oxigênio. Demonstramos aqui que normalizar as taxas de LDH e PDH para o conteúdo de ATP do coração reduz a variabilidade intercardíaca nessas taxas.
No protocolo a seguir, descrevemos o procedimento cirúrgico utilizado para canulação cardíaca, isolamento e consequente perfusão no espectrômetro de RMN. Vale ressaltar que outras abordagens cirúrgicas com o objetivo de isolar e perfundir o coração de camundongos foram descritas antesde 24,25.
As metodologias utilizadas para a aquisição de dados relacionados às taxas enzimáticas no coração batendo (usando espectroscopia de 13 C e [1-13C]piruvato hiperpolarizado) e a viabilidade e acidez do coração (usando espectroscopia de RMN de 31P) também são descritas. Finalmente, as metodologias analíticas para determinar as atividades enzimáticas metabólicas e a viabilidade e acidez tecidual são explicadas.

<table><tbody><tr><td><forte>Equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polarizador DNP HyperSense</td><td>Oxford Instruments</td><td>52-ZNP91000</td><td>HyperSense, 3.35 T, dissolução pré-clínica-DNP hiperpolarizador</td></tr><tr><td>espectrômetro de RMN&nbsp;</td><td>Cubo de RMN RS2D</td><td></td><td>, 5,8 T, equipado com uma sonda de banda larga de 10 mm</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica&nbsp;</td><td>Sonda de temperatura Cole-Parmer</td><td>07554-95</td><td></td></tr><tr><td>Sonda</td> <td>de temperatura compatível</td><td>Osensa</td><td>FTX-100-LUX+</td>NMR</tr><tr><td>Sistema de anestesia de baixo fluxo Somnosuite Kent</td><td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lines, tubulações, sutura</td>Tubos de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>silicone curados com platina</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-96119-16</td><td>L/S 16 I.D. 3.1 mm& nbsp;</td></tr><tr><td>Linhas finas de poliéter éter cetona (PEEK)</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>id. 0.040 "</td></tr><tr><td>Cateter intravenoso&nbsp;</td><td>BD Medical</td><td>381323</td><td>22 G</td></tr><tr><td>Sutura de seda</td><td>Ethicon</td><td>W577H</td><td>Diâmetro do fio de 3-0</td></tr><tr><td>Chemicals and pharmaceuticals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[1-13C]pyruvic acid</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-8077-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21074</td><td>CAS: 10043-52-4</td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>CAS: 50-99-77</td></tr><tr><td>Heparina sódica</td><td>Rotexmedica</td><td>HEP5A0130C0160</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>CAS: 7647-01-0</td></tr><tr><td>Insulina aspártico (NovoLog)</td><td>Novo Nordisk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Terrel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato</td> <td>de MagnésioSigma-Aldrich</td><td>793612</td><td>CAS: 7487-88-9</td></tr><tr><td>Cloreto</td><td>de potássio Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td>CAS: 7447-40-7</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>CAS: 7778-77-0</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Gadot Group</td><td></td><td>CAS: 144-55-8</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>CAS: 7647-14-5</td></tr><tr><td>Sódio hidróxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>655104</td><td>CAS: 1310-73-2</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>CAS: 7558-79-4</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico di-hidratado</td><td>Merck</td><td>6345</td><td>CAS: 13472-35-0</td></tr><tr><td>TRIS (grau de biotecnologia)</td> <td>Amresco</td><td>0826</td><td>CAS: 77-86-1</td></tr><tr><td>Radical tritil OX063</td><td>GE Healthcare AS</td><td>NC100136</td><td>OX063</td></tr><tr><td><padrões > NMR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13C amostra padrão</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-72A</td><td>40% de p-dioxano em benzeno-D6</td></tr><tr><td>31P amostra padrão</td><td>Fabricado internamente</td><td></td><td>105 mM ATP e 120 mM de ácido fenilfosfônico em D2</td></tr><tr><td>OSoftware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel 2016</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MNova</td><td>Mestrelab Pesquisa</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

investigando o metabolismo cardíaco no coração de rato perfundido isolado com piruvato hiperpolarizado [1-13c]piruvato e espectroscopia de rmn 13c/31p

Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy

O metabolismo é a base de processos importantes na vida celular. Caracterizar como as redes metabólicas funcionam nos tecidos vivos fornece informações cruciais para a compreensão do mecanismo das doenças e a concepção de tratamentos. Neste trabalho, descrevemos procedimentos e metodologias para estudar a atividade metabólica intracelular em um coração de camundongo retrógrado perfundido em tempo real. O coração foi isolado in situ, em conjunto com parada cardíaca para minimizar a isquemia miocárdica e foi perfundido dentro de um espectrômetro de ressonância magnética nuclear (RMN). Enquanto no espectrômetro e sob perfusão contínua, o [1-13 C]piruvato hiperpolarizado foi administrado ao coração, e as subsequentes taxas de produção de [1-13 C]lactato e [13C]bicarbonato hiperpolarizadas serviram para determinar, em tempo real, as taxas de produção de lactato desidrogenase e piruvato desidrogenase. Esta atividade metabólica do [1-13C]piruvato hiperpolarizado foi quantificada com espectroscopia de RMN de forma livre usando a abordagem de aquisição de saturação seletiva de excitações do produto. 31 anos A espectroscopia de P foi aplicada entre as aquisições hiperpolarizadas para monitorar a energia cardíaca e o pH. Este sistema é excepcionalmente útil para estudar a atividade metabólica no coração de rato saudável e doente.

Os espectros de 31P registrados a partir de um coração de rato perfundido com KHB e do tampão isolado são mostrados na Figura 1A. Os sinais de α, β e γ-ATP, PCr e Pi foram observados no coração. O sinal Pi foi composto por dois componentes principais: no campo superior (lado esquerdo do sinal), o sinal Pi foi principalmente devido ao KHB a um pH de 7,4; no campo inferior (lado direito do sinal), o sinal Pi foi mais amplo e menos homogêneo devido ao ambiente mais ácido. Este último...

Descrevemos uma configuração experimental para administrar metabólitos hiperpolarizados marcados com 13C no modo de perfusão contínua a um coração de rato perfundido isolado. Uma abordagem dedicada à aquisição de 13C-NMR permitiu a quantificação da atividade enzimática metabólica em tempo real, e uma análise multiparamétrica de 31P-NMR permitiu a determinação do conteúdo de ATP tecidual e do pH.

Investigando o Metabolismo Cardíaco no Coração de Rato Perfundido Isolado com Piruvato Hiperpolarizado [1-13C]Piruvato e Espectroscopia de RMN 13C/31P

Metabolism is the basis of important processes in cellular life. Characterizing how metabolic networks function in living tissues provides crucial ...

Hi.In este vídeo, você aprenderá a realizar estudos de RM hiperpolarizados do coração de rato perfundido. David Shaul, um estudante de MD / PhD no laboratório, irá guiá-lo através das várias técnicas e procedimentos. Hoje aprendemos um protocolo para estudar o metabolismo hiperpolarizado do piruvato de carbono-13, combinado com espectroscopia de RMN 31P.O metabolismo do piruvato está na encruzilhada do metabolismo aeróbico e anaeróbico. E, como tal, é de grande valor para estudar várias condições do coração. Então, vamos começar.O coração do rato é isolado e perfundido com tampão de Krebs-Hensleit, dentro de um tubo de RMN de 10 milímetros. O coração é então inserido no espectrômetro de RMN. Lá, um espectro 31P é registrado para observar a energia cardíaca e o pH, observando as ressonâncias de trifosfato de adenosina, fosfocreatina e fosfato inorgânico.Enquanto isso, uma amostra de piruvato que é marcada com carbono-13 na primeira posição é hiperpolarizada. E após a dissolução ocorre, é injetado no coração para permitir a medição de lactato, inorgânicos e piruvato as atividades organizadas em tempo real. Um dia antes do experimento, prepare 400 mililitros de tampão Krebs-Henseleit

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Langendorff modo de perfusão do coração isolado, em conjunto...

Avaliação da função cardíaca e Energetics em Corações Isolados rato Usando 31 P NMR Spectroscopy

Um simulador dinâmico multicompartimental é usado para simular alguma biologia de interesse para estudos metabólicos usando agentes de ressonância magnética hiperpolarizada.

O uso de um compartimento Multi-dinâmica única enzima Fantasma de Estudos de hyperpolarized agentes Ressonância Magnética

O protocolo a seguir descreve a preparação e utilização de tampões para a medição quantitativa das taxas de oxidação de glicose e ácidos graxos no coração isolado de rato em funcionamento. Os métodos utilizados para análise da amostra e interpretação dos dados também são discutidos.

Os métodos para a determinação das taxas de glicose e ácido gordo oxidação no coração isolado de rato de Trabalho

A polarização nuclear dinâmica com subsequente dissolução da amostra permitiu estudos em tempo real do metabolismo em sistemas biológicos. O piruvato de [1-13C]hiperpolarizado foi usado para estudar a atividade da lactato desidrogenase em uma linhagem celular de carcinoma de próstata in vitro.

hiperpolarizado 13 C Metabolic Espectroscopia de Ressonância Magnética e imagem

Aqui nós introduzimos um método para usar um cateter ótico do intra-ventrículo em corações perfundidos para executar a espectroscopia da absorvência através da parede do coração. Os dados obtidos fornecem informações robustas sobre a tensão do oxigênio tecidual, bem como a utilização do substrato e o potencial de membrana simultaneamente com medidas de desempenho cardíaco nesta preparação onipresente.

Cateter de luz de queima lateral intra-cardíaco para monitoramento do metabolismo celular usando espectroscopia de absorvência transmural de corações de mamíferos perfused

Nós apresentamos um protocolo para medir a dependência do campo magnético do tempo do abrandamento da girar-estrutura de 13C-compostos enriquecidos, hyperpolarizado por meio da polarização nuclear dinâmica, usando o relaxometry Field-Cycled rápido. Especificamente, temos demonstrado isso com [1-13C] piruvato, mas o protocolo pode ser estendido para outros substratos hiperpolarizados.

Medindo a dependência do campo magnético do abrandamento da girar-estrutura de Hyperpolarizado [1-13C] piruvato

Este protocolo integra um sistema de biorreator personalizado com espectroscopia de RMN ¹³C hiperpolarizada para medir o metabolismo do piruvato em tempo real em células vivas, melhorando a reprodutibilidade e a precisão cinética para estudos metabólicos e aplicações de triagem de medicamentos.

Detecção metabólica em tempo real em células vivas usando RMN hiperpolarizada de 13C

Este artigo descreve uma técnica de alta resolução temporal e espacial, visualmente, movimento de ação potencial imagem sobre a superfície de corações de ratos perfundidos Langendorff-utilizando um corante potenciométrica (di-8-ANEPPS).

Mapeamento óptica de corações perfundidos Langendorff-Rat

O protocolo a seguir descreve o processo de isolamento, ventilação e instrumentação pulmões do rato para medir estável ou pulsátil vascular pulmonar pressão de fluxo de relações, a fim de quantificar os efeitos do fluxo sanguíneo, o fluxo de ar, alterações das vias aéreas e alterações vasculares no pós-carga do ventrículo direito.

Caracterização do isolado, ventilado, Lung Mouse e Instrumentados perfundidos com fluxo pulsátil

Electron paramagnético espectroscopia de ressonância (EPR) foi utilizado para detectar o óxido nítrico a partir de células endoteliais de aorta bovina e anião radical superóxido por neutrófilos humanos, utilizando ferro (II)-N-metil-D-glucamina ditiocarbamato, Fe...

Detecção de Óxido Nítrico e ânion radical superóxido por espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica a partir de células usando armadilhas para spins

Aprenda a avaliar o metabolismo cardíaco em tempo real usando corações de rato perfundidos isolados com piruvato hiperpolarizado [1-13C] e espectroscopia de RMN 13C/31P. Este protocolo permite quantificar a atividade da LDH e PDH.

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Investigando o Metabolismo Cardíaco no Coração de Rato Perfundido Isolado com Piruvato Hiperpolarizado [^1-13C]Piruvato e Espectroscopia de RMN ¹³C/³¹P

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