Name: Produção Eficiente e Escalável de Variantes de Huntingtina Humana de Comprimento Completo em Células de Mamíferos utilizando um Sistema de Expressão Transitória (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Aprenda a produzir variantes de huntingtina humana de comprimento completo em células HEK293 com alta pureza. Este protocolo utiliza transfecção com polietilenimina e cromatografia de afinidade anti-FLAG para pesquisa da doença de Huntington.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos ao Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Nova York em Buffalo, por realizar a análise de EM de HTT. Este trabalho foi um esforço colaborativo com a Fundação CHDI. Agradecemos especificamente a Elizabeth M. Doherty; Ignacio Munoz-Sanjuan; Douglas Macdonald, Fundação CHDI; e Rory Curtis, Curia, por sua inestimável contribuição durante a preparação deste manuscrito. Também somos gratos a Michele Luche, Mithra Mahmoudi e Stephanie Fox por seu apoio a este esforço de pesquisa.

<ol><li>Walker, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease.</a> Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).</li>
<li>McColgan, P., Tabrizi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+a+clinical+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: a clinical review.</a> European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).</li>
<li>Duyao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trinucleotide+repeat+length+instability+and+age+of+onset+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Trinucleotide repeat length instability and age of onset in Huntington's disease.</a> Nature Genetics. 4 (4), 387-392 (1993).</li>
<li>MacDonald, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Nasir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+Huntington%27s+disease+gene+results+in+embryonic+lethality+and+behavioral+and+morphological+changes+in+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the Huntington's disease gene results in embryonic lethality and behavioral and morphological changes in heterozygotes.</a> Cell. 81 (5), 811-823 (1995).</li>
<li>Dragatsis, I., Levine, M. S., Zeitlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Hdh+in+the+brain+and+testis+results+in+progressive+neurodegeneration+and+sterility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Hdh in the brain and testis results in progressive neurodegeneration and sterility in mice.</a> Nature Genetics. 26 (3), 300-306 (2000).</li>
<li>Anne, S. L., Saudou, F., Humbert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+huntingtin+by+cyclin-dependent+kinase+5+is+induced+by+DNA+damage+and+regulates+wild-type+and+mutant+huntingtin+toxicity+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of huntingtin by cyclin-dependent kinase 5 is induced by DNA damage and regulates wild-type and mutant huntingtin toxicity in neurons.</a> Journal of Neuroscience. 27 (27), 7318-7328 (2007).</li>
<li>Dietrich, P., Johnson, I. M., Alli, S., Dragatsis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+huntingtin+in+the+adult+mouse+leads+to+progressive+behavioral+deficits%2C+bilateral+thalamic+calcification%2C+and+altered+brain+iron+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Elimination of huntingtin in the adult mouse leads to progressive behavioral deficits, bilateral thalamic calcification, and altered brain iron homeostasis.</a> PLoS Genetics. 13 (7), 1006846(2017).</li>
<li>Dragatsis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+early+embryonic+deletion+of+huntingtin+from+pyramidal+neurons+on+the+development+and+long-term+survival+of+neurons+in+cerebral+cortex+and+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Effect of early embryonic deletion of huntingtin from pyramidal neurons on the development and long-term survival of neurons in cerebral cortex and striatum.</a> Neurobiology of Disease. 111, 102-117 (2018).</li>
<li>Benn, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+modulates+transcription%2C+occupies+gene+promoters+in+vivo%2C+and+binds+directly+to+DNA+in+a+polyglutamine-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Huntingtin modulates transcription, occupies gene promoters in vivo, and binds directly to DNA in a polyglutamine-dependent manner.</a> Journal of Neuroscience. 28 (42), 10720-10733 (2008).</li>
<li>Saudou, F., Humbert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The biology of huntingtin.</a> Neuron. 89 (5), 910-926 (2016).</li>
<li>Davies, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+neuronal+intranuclear+inclusions+underlies+the+neurological+dysfunction+in+mice+transgenic+for+the+HD+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of neuronal intranuclear inclusions underlies the neurological dysfunction in mice transgenic for the HD mutation.</a> Cell. 90 (3), 537-548 (1997).</li>
<li>DiFiglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+huntingtin+in+neuronal+intranuclear+inclusions+and+dystrophic+neurites+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain.</a> Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).</li>
<li>Gutekunst, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+neuropil+aggregates+in+Huntington%27s+disease%3A+Relationship+to+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nuclear and neuropil aggregates in Huntington's disease: Relationship to neuropathology.</a> Journal of Neuroscience. 19 (7), 2522-2534 (1999).</li>
<li>Hodgson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+YAC+mouse+model+for+Huntington%27s+disease+with+full-length+mutant+huntingtin%2C+cytoplasmic+toxicity%2C+and+selective+striatal+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A YAC mouse model for Huntington's disease with full-length mutant huntingtin, cytoplasmic toxicity, and selective striatal neurodegeneration.</a> Neuron. 23 (1), 181-192 (1999).</li>
<li>Hoffner, G., Djian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+aggregation+in+Huntington+disease%3A+does+structure+determine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine aggregation in Huntington disease: does structure determine toxicity.</a> Molecular Neurobiology. 52 (3), 1297-1314 (2015).</li>
<li>Waldvogel, H. J., Kim, E. H., Tippett, L. J., Vonsattel, J. P. G., Faull, R. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropathology+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Behavioral+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The neuropathology of Huntington's disease.</a> Current Topics in Behavioral Neurosciences. 22, 33-80 (2014).</li>
<li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+conformation+of+polyglutamine+track+revealed+by+a+crystal+structure+of+huntingtin+N-terminal+region+with+insertion+of+three+histidine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Beta conformation of polyglutamine track revealed by a crystal structure of huntingtin N-terminal region with insertion of three histidine residues.</a> Prion. 7 (3), 221-228 (2013).</li>
<li>Hoop, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+exon+1+fibrils+feature+an+interdigitated+%CE%B2-hairpin-based+polyglutamine+core%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Huntingtin exon 1 fibrils feature an interdigitated β-hairpin-based polyglutamine core.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1546-1551 (2016).</li>
<li>Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intein-based+strategy+for+the+production+of+tag-free+huntingtin+exon+1+proteins+enables+new+insights+into+the+polyglutamine+dependence+of+Httex1+aggregation+and+fibril+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An intein-based strategy for the production of tag-free huntingtin exon 1 proteins enables new insights into the polyglutamine dependence of Httex1 aggregation and fibril formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).</li>
<li>Seong, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+facilitates+polycomb+repressive+complex+2%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin facilitates polycomb repressive complex 2.</a> Human Molecular Genetics. 19 (4), 573-583 (2009).</li>
<li>Li, W., Serpell, L. C., Carter, W. J., Rubinsztein, D. C., Huntington, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+full-length+human+huntingtin%2C+an+elongated+HEAT+repeat+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of full-length human huntingtin, an elongated HEAT repeat protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15916-15922 (2006).</li>
<li>Vijayvargia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin%27s+spherical+solenoid+structure+enables+polyglutamine+tract-dependent+modulation+of+its+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Huntingtin's spherical solenoid structure enables polyglutamine tract-dependent modulation of its structure and function.</a> eLife. 5, 11184(2016).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+production+in+human+cells+and+biochemical+characterization+of+full-length+normal+and+mutant+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Scalable production in human cells and biochemical characterization of full-length normal and mutant huntingtin.</a> PLoS ONE. 10 (3), 0121055(2015).</li>
<li>Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cryo-electron+microscopy+structure+of+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The cryo-electron microscopy structure of huntingtin.</a> Nature. 555 (7694), 117-120 (2018).</li>
<li>Harding, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+characterization+of+mutant+and+wildtype+huntingtin+proteins+produced+from+a+toolkit+of+scalable+eukaryotic+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Design and characterization of mutant and wildtype huntingtin proteins produced from a toolkit of scalable eukaryotic expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (17), 6986-7001 (2019).</li>
<li>Harding, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAP40+orchestrates+huntingtin+structure+for+1+differential+interaction+with+polyglutamine+2+expanded+exon+1%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">HAP40 orchestrates huntingtin structure for 1 differential interaction with polyglutamine 2 expanded exon 1.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+polyQ+expansion+does+not+alter+the+conformation+of+the+Huntingtin-HAP40+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Pathological polyQ expansion does not alter the conformation of the Huntingtin-HAP40 complex.</a> Structure. 29 (8), 804-809 (2021).</li>
<li>Colin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+phosphorylation+acts+as+a+molecular+switch+for+anterograde%2Fretrograde+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Huntingtin phosphorylation acts as a molecular switch for anterograde/retrograde transport in neurons.</a> EMBO Journal. 27 (15), 2124-2134 (2008).</li>
<li>Thompson, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK+phosphorylates+Huntingtin+and+targets+it+for+degradation+by+the+proteasome+and+lysosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IKK phosphorylates Huntingtin and targets it for degradation by the proteasome and lysosome.</a> Journal of Cell Biology. 187 (7), 1083-1099 (2009).</li>
<li>Ratovitski, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+%28PTMs%29%2C+identified+on+endogenous+Huntingtin%2C+cluster+within+proteolytic+domains+between+HEAT+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications (PTMs), identified on endogenous Huntingtin, cluster within proteolytic domains between HEAT repeats.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2692-2708 (2017).</li>
<li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+western+blot+data%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A defined methodology for reliable quantification of western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li>
<li>Tarazona, M. P., Saiz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+SEC%2FMALS+experimental+procedures+and+theoretical+analysis+for+studying+the+solution+properties+of+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Combination of SEC/MALS experimental procedures and theoretical analysis for studying the solution properties of macromolecules.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 56 (1-3), 95-116 (2003).</li>
<li>Folta-Stogniew, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomeric+states+of+proteins+determined+by+size-exclusion+chromatography+coupled+with+light+scattering%2C+absorbance%2C+and+refractive+index+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors.</a> Methods in Molecular Biology. 328, Clifton, N.J. 97-112 (2006).</li>
<li>McMeekin, T. L., Wilensky, M., Groves, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractive+indices+of+proteins+in+relation+to+amino+acid+composition+and+specific+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Refractive indices of proteins in relation to amino acid composition and specific volume.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7 (2), 151-156 (1962).</li>
<li>Atwal, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+has+a+membrane+association+signal+that+can+modulate+huntingtin+aggregation%2C+nuclear+entry+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity.</a> Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).</li>
<li>Kegel-Gleason, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+interactions+with+membrane+phospholipids%3A+Strategic+targets+for+therapeutic+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Huntington%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Huntingtin interactions with membrane phospholipids: Strategic targets for therapeutic intervention.</a> Journal of Huntington's Disease. 2 (3), 239-250 (2013).</li>
<li>Michalek, M., Salnikov, E. S., Werten, S., Bechinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+interactions+of+the+amphipathic+amino+terminus+of+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane interactions of the amphipathic amino terminus of huntingtin.</a> Biochemistry. 52 (5), 847-858 (2013).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Nissley, D. A., O'Brien, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+co-translational+processing+plays+a+role+in+huntington%27s+pathogenesis-A+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered co-translational processing plays a role in huntington's pathogenesis-A hypothesis.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 54(2016).</li>
<li>Kumar, N., Gammell, P., Clynes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+control+strategies+to+improve+productivity+and+survival+during+CHO+based+production+culture%3A+A+summary+of+recent+methods+employed+and+the+effects+of+proliferation+control+in+product+secreting+CHO+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Proliferation control strategies to improve productivity and survival during CHO based production culture: A summary of recent methods employed and the effects of proliferation control in product secreting CHO cell lines.</a> Cytotechnology. 53 (1-3), 33-46 (2007).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse com o conteúdo deste artigo.

Descrevemos aqui um método transitório de transfecção, expressão e purificação para gerar múltiplos construtos de proteína FL HTT com pureza e homogeneidade adequadas para uso como padrões para imunoensaio e desenvolvimento de ensaios de EM, controles para análise de western blot e para estudos de estrutura-função. Esse método de expressão transitória é escalável e versátil e permite que o usuário gere quantidades baixas de miligramas de variantes FL HTT de forma mais eficiente do que usando linhagens celulares estáveis ou métodos baseados em vírus descritos anteriormente21,22,23,24. Rotineiramente, 2-5 mg de FL HTT altamente purificado podem ser gerados a partir de uma produção de proteína em escala de 2 L em menos de uma semana usando o método de expressão transitória, uma vez que o plasmídeo é construído, com um rendimento típico de 1-2,5 mg de FL HTT por litro de cultura celular.
O método de expressão transitória descrito aqui supera muitos obstáculos na expressão de linhagens celulares estáveis, como o longo tempo necessário para estabelecer linhagens celulares e dificuldades no armazenamento e manutenção de linhagens celulares estáveis. O PEI também é relativamente barato em comparação com outros reagentes de transfecção no mercado, tornando a transfecção em larga escala economicamente viável. Há também limitações no protocolo: a eficiência da transfecção depende em grande parte da qualidade dos plasmídeos, do crescimento celular ideal e de quão bem o PEI é armazenado e preparado. Os operadores precisam tomar cuidado especial e realizar controles de qualidade nessas etapas críticas para evitar uma queda drástica nos rendimentos de proteínas. A resina anti-FLAG usada no protocolo também é relativamente cara e mostra redução da captura de FL HTT após várias purificações e regenerações. Alguns pesquisadores podem achar mais prático mudar para uma tag diferente para permitir uma regeneração mais robusta da resina de afinidade.
Várias linhagens celulares e condições de expressão foram testadas para otimizar os níveis de expressão de FL HTT. As células HEK293 foram escolhidas para a expressão de FL HTT devido à alta expressão de proteínas e à facilidade de manuseio em formato de cultura de suspensão, tornando o método adequado para expressão em larga escala em agitadores ou biorreatores. Um nível mais alto de expressão da proteína FL HTT pode ser alcançado em temperaturas de cultivo mais baixas, como 32 °C, em vez de usar a temperatura habitual de 37 °C. É possível que a temperatura mais baixa possa retardar a síntese de proteínas e promover o dobramento correto do FL HTT40. No entanto, esse fenômeno não é específico do FL HTT ou das linhagens celulares testadas. A temperatura pós-transfecção reduzida tem sido amplamente utilizada na expressão de proteínas farmacêuticas em células CHO. Embora o mecanismo não seja totalmente compreendido, acredita-se que as baixas temperaturas interrompam o ciclo celular na fase G1 e desviem a energia celular para a produção de proteínas41.
O HTT de comprimento total purificado a partir de células de mamíferos co-elui com a chaperona Hsp7024, e as etapas de lavagem de Mg-ATP podem remover a proteína Hsp70. Curiosamente, a Hsp70 co-eluída não é observada em FL HTT purificada a partir de um sistema de expressão de células de insetos21,22,23. Isso pode refletir uma diferença nos PTMs de FL HTT ou respostas de proteína de choque térmico à superexpressão de FL HTT em células de mamíferos e insetos. Uma vez que a proteína recombinante tenha sido despojada de Hsp70, detergentes não iônicos, como CHAPS ou DDM, são necessários para estabilizar a forma monomérica de FL HTT.
Os estados de oligomerização das variantes FL HTT foram analisados utilizando Blue Native PAGE e SEC-MALS. Uma pequena fração de HTT oligomérico dimérico e de ordem superior estava presente quando analisada pelo Blue Native PAGE ou SEC-MALS. É importante notar que os oligômeros de ordem superior formados por FL HTT não parecem se correlacionar com o comprimento do poliQ, e até mesmo o mutante de deleção Exon1 exibe uma relação oligômero-dímero-monômero semelhante. As variações reais no teor de oligômeros entre esses construtos são provavelmente devidas a pequenas diferenças na produção e manuseio de cada lote. Em contraste com agregados e fibrilas formados por HTT Exon140,41, os oligômeros de maior ordem de FL HTT permaneceram solúveis e puderam ser analisados por SEC e Native PAGE.
FL HTT monomérico purificado é apenas relativamente estável. O armazenamento prolongado a 4 °C, incubações curtas à temperatura ambiente ou concentrações > 1 mg/mL converterão o HTT FL monomérico em formas oligoméricas diméricas e de ordem superior, embora não haja precipitação visível observada nessas condições. O HTT FL monomérico purificado mantido a ≤1 mg/mL permaneceu relativamente estável a -80 °C em tampão de armazenamento (50 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 5% v/v glicerol, 0,5% p/v CHAPS e 5 mM TDT), conforme descrito anteriormente24. Até 6 ciclos de congelamento-descongelamento de FL HTT preparados e armazenados dessa maneira não causaram precipitação visível da proteína, embora um ligeiro deslocamento para um estado oligomérico mais alto tenha sido observado pelo SEC-MALS (Figura Suplementar S2). As amostras também foram analisadas pelo SDS PAGE após repetidos ciclos de congelamento-descongelamento. Não foram observados precipitados visíveis; não foram observados agregados ou produtos de degradação adicionais pelo SDS-PAGE (Figura Suplementar S3). A estabilidade a longo prazo do FL HTT purificado ainda está sob investigação. Na ausência de dados conclusivos a longo prazo, recomendamos o armazenamento de FL HTT purificado a -80 °C por não mais de 6 meses.
As variantes da proteína FL HTT recombinante e de alta qualidade e os métodos para as produzir são altamente procurados pela comunidade de investigação da DH. Essas proteínas estão em uso como imunoensaio e padrões analíticos de EM, em estudos estruturais e para o desenvolvimento de novos ensaios específicos de FL HTT. Os métodos de expressão transitória em larga escala aqui descritos produziram consistentemente quantidades de miligramas de variantes FL HTT com >95% de pureza, fornecendo ferramentas essenciais para estudos de HTT. A produção de dezenas de miligramas de variantes poliQ FL HTT altamente purificadas e outros mutantes em apoio à investigação da DH tornou-se rotina.

A doença de Huntington (HD) é uma doença neurodegenerativa rara, caracterizada principalmente por movimentos motores instáveis e involuntários, bem como alterações cognitivas e psiquiátricas, como alterações de personalidade e apatia 1,2. A DH está associada a uma expansão do trato de repetição CAG localizado no éxon 1 do gene huntingtina (HTT) para mais de 35 repetições, com um maior número de repetições CAG correlacionando-se com um início mais precoce da doença 3,4. O produto translacional da HTT, a proteína huntingtina (HTT), está implicado na viabilidade neuronal e no desenvolvimento cerebral 5,6,7,8,9.
A HTT é uma proteína scaffolding relatada como participante de uma ampla gama de processos celulares, transporte de vesículas, divisão celular, ciliogênese e autofagia10,11. No entanto, a patogénese molecular da DH não é totalmente clara, e falta a identificação dos principais interatores proteicos que mediam o impacto patológico da mHTT poliQ-expandida. Algumas pesquisas sugerem um ganho de função tóxica da mHTT impulsionado pela propensão à oligomerização da proteína HTT expandida, uma vez que agregados de HTT têm sido identificados em neurônios e glia em pacientes em HD e modelos animais da doença 12,13,14,15,16,17 . Para alimentar a investigação da função e estrutura das variantes FL HTT e mHTT e fornecer aos pesquisadores padrões de proteína de alta qualidade para o desenvolvimento de ensaios, é necessário um suprimento robusto e escalável de proteína recombinante homogênea.
Devido ao seu tamanho (aa 1-3.144, numeração baseada no comprimento Q23 do poliQ), instabilidade proteolítica e propensão a agregar, o FL HTT tem se mostrado difícil de expressar e isolar como uma proteína solúvel. Anteriormente, a região do éxon 1 (aa 2-90) da HTT foi expressa e purificada em larga escala utilizando várias etiquetas que podem aumentar a solubilidade da proteína em Escherichia coli18,19,20. FL HTT foi primeiramente expresso e purificado em um sistema de expressão de células de insetos usando baculovírus 21,22, e estruturas de microscopia eletrônica (EM) de baixa resolução de 30 Å de FL Q23-HTT e Q78-HTT quimicamente reticuladas foram relatadas23. A investigação da estrutura da HTT avançou ainda mais quando a produção de FL Q17, Q46 e Q128-HTT com modificações pós-traducionais nativas (PTMs) foi alcançada em células humanas utilizando linhagens celulares estáveis ou sistemas de expressão de adenovírus24. Esses estudos sugerem que, embora a HTT purificada exista principalmente no estado monomérico, ela também tende a formar oligômeros e agregados de alta ordem.
A ultracentrifugação analítica de FL Q128-HTT, com uma região poliQ altamente expandida, proporcionou mais frações oligoméricas e agregadas do que a proteína com a região poliQ não expandida24. Usando uma linhagem celular estável, uma estratégia foi adaptada com sucesso para estabilizar FL HTT por co-expressão com o parceiro de interação HAP40. Uma estrutura crio-EM do complexo FL HTT e HAP40 foi resolvida a uma resolução média de 4 Å usando o complexo proteico purificado (PDB:6EZ8)25. Essa estratégia de coexpressão foi adaptada com sucesso a um sistema de baculovírus, e uma série de variantes HTT de alta qualidade com diferentes comprimentos de poliQ foram expressas e purificadas a partir de células de insetos26. Desde então, mais estruturas crio-EM do complexo de HTT com comprimentos variáveis de poliQ e HAP40 e estruturas de maior resolução foram resolvidas e depositadas na Base de Dados de Proteínas27,28 (PDB: 7DXK, 7DXH, 6X9O).
Otimizamos um método de transfecção e expressão em células HEK293, utilizando polietilenimina (PEI), para rápida expressão transitória de FL HTT. Como prova de princípio, variantes FL HTT contendo 23 glutaminas (FL Q23-HTT) foram primeiramente purificadas e caracterizadas usando uma modificação de um método de purificação descrito anteriormente24. Este método de transfecção transitória é conveniente, altamente eficiente e escalável; pode produzir HTT purificado com rendimentos de 1-2 mg/L, comparáveis ao método de linhagem celular estável relatado24. Como a proteína é produzida em uma linhagem celular humana, a HTT produzida tem maior probabilidade de ter PTMs humanos nativos quando submetida à análise proteômica por espectrometria de massa 11,29,30,31. Quantidades miligramaticais das variantes FL Q48-HTT, FL Q73-HTT e exon1-deleted (ΔExon1-HTT) de FL HTT foram produzidas, demonstrando que o método de expressão transitória é especialmente útil na produção rápida de variantes alternativas de HTT sem depender do esforço demorado necessário para estabelecer linhagens celulares estáveis para produção.
O protocolo a seguir exemplifica o método padrão utilizado no laboratório desses autores para cultura celular, transfecção, purificação de proteínas e caracterização de proteínas pós-purificação para produzir FL Q23-HTT a partir de uma cultura de células de 2 L. O protocolo pode ser ampliado para culturas maiores ou adaptado para purificar outras variantes de HTT. Até 10 L de culturas de células de FL HTT e várias mutações de local ou truncamento de homólogos de HTT e HTT foram realizadas com sucesso no laboratório usando o mesmo protocolo. FL HTT purificado contém uma alta porcentagem de monômeros, juntamente com dímeros e oligômeros de ordem superior. O mesmo perfil agregado é observado entre as variantes produzidas (Q23, Q48, Q73 e Exon1 excluído). Como a agregação pode ocorrer quando os devidos cuidados não são tomados, um estudo de formulação e estabilidade congelamento-descongelamento foi realizado para identificar as melhores condições para o manuseio de proteínas. Métodos, como Blue Native PAGE e SEC/MALS-RI, também são descritos para analisar o conteúdo do oligômero HTT como parte do processo de controle de qualidade. Para beneficiar a comunidade de investigação da DH, os plasmídeos e as proteínas HTT descritos neste estudo são também depositados no Repositório da Comunidade HD do Coriell Institute (www.coriell.org/1/CHDI).

<table><tbody><tr><td>Concentrador de 100 kDa-Amicon</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td> Número <td>da Seção do Protocolo-6.2.4</td></tr><tr><td>20x buffer de execução de PÁGINA nativa azul</td> Número <td>da Seção do Protocolo</td><td>Invitrogen</td><td>BN2001-8.1</td></tr><tr><td>20x TBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI28358</td><td>Número da Seção do Protocolo-5.1</td></tr><tr><td>4x buffer de amostra de PÁGINA nativa azul</td> Número <td>da Seção do Protocolo</td> <td>Invitrogen</td><td>BN2003-8.3</td></tr><tr><td>4x buffer de carregamento LDS</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td> Número <td>da seção do protocolo-5.3</td></tr><tr><td>Balões Erlenmeyer de 5 L</td> Número da <td>seção do protocolo Corning 431685-4.2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de gel de agarose</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Número da seção do protocolo-2.2</td></tr><tr><td>Agente antiaglomerante</td><td>Thermo Fisher</td><td>0010057AE</td><td>Número da seção do protocolo-4.8</td></tr><tr><td>afinidade anti-FLAG M2 gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td> Número <td>da Seção do Protocolo-6.1.1</td></tr><tr><td>anti-FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>F3165</td> Número <td>da Seção do Protocolo-5.7</td></tr><tr><td>Anti-espuma-Excell anti-espuma</td><td>Sigma</td><td>59920C-1B</td><td>Número da Seção do Protocolo-4.8</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A6419</td><td>Número da Seção do Protocolo-6.1.4.4</td></tr><tr><td>BEH 450 SEC</td><td>Waters</td><td>186006851</td><td>2,5 &micro; m x 4,6 mm x 150 mm Número da Seção do Protocolo-7.3</td></tr><tr><td>azul nativo PÁGINA 5% G-250 aditivo de amostra</td><td>Invitrogen</td><td>BN2004</td><td>Número da Seção do Protocolo-8.3</td></tr><tr><td>carbenicilina</td><td>Thermo Fisher</td><td>10177012</td><td>Número da Seção do Protocolo-2.5</td></tr><tr><td>centrífuga - Sorvall Lynx 6000</td><td>Thermo Fisher</td><td>75006590</td><td>Número da Seção do Protocolo-6.1.3</td></tr><tr><td>Contador de Células - ViCELL</td><td>BECKMAN COULTER</td><td></td><td>Número da Seção do Protocolo-4.3</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Anatrace</td><td>C316S</td><td>Número da Seção do Protocolo-6.1.4.6</td></tr><tr><td>Células competentes de E. coli-TOP10</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td>Número da Seção do Protocolo-2.4</td></tr><tr><td>digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td> Número da <td>Seção do Protocolo-5.1</td></tr><tr><td>detector de índice de refração diferencial</td> Número da Seção do Protocolo <td>Wyatt-7.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptídeo DYKDDDDK</td><td>Genscript</td><td></td><td>Serviço de síntese de peptídeos Número da seção do protocolo-6.1.4.6</td></tr><tr>Número da seção do protocolo<td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS-5.1</td><td></td></tr><tr><td>Kit Giga de plasmídeo EndoFree</td><td>Qiagen</td><td>12391</td><td>Número da seção do protocolo-3.3</td></tr><tr><td>Água livre de endotoxinas</td><td>Cytiva</td><td>SH30529.03</td><td>Número da seção do protocolo-4.1</td></tr><tr><td>kit de quantificação de endotoxinas-CRL Sistema de detecção Endosafe Nexgen-PTS</td><td>Charles River</td><td>PTS150K</td><td>Número da seção do protocolo-3.4</td></tr><tr><td>rotor de ângulo fixo rotor A23-6x100</td><td>Thermo Fisher</td><td>75003006</td><td>Número da seção do protocolo-6.1.3</td></tr><tr><td>Software FPLC- Unicórnio 6.2</td><td>Cytiva</td><td></td><td>Número da seção do protocolo-6.1.4</td></tr><tr><td>Genscript</td><td></td><td></td> <td>de síntese gênicaServiço de síntese de genes Número da seção do protocolo-1.2</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific Glycerol (Certified ACS)</td><td>G33-4</td><td>Número da seção do protocolo-5.6</td></tr><tr><td>Meio de crescimento Meio de expressão Expi293 Thermo</td><td>Fisher</td><td>A1435102</td><td>Número da seção do protocolo-4.2</td></tr><tr><td>Células HEK293</td><td>Thermo Fisher</td><td>R79007</td><td>Seção do protocolo Número-4</td></tr><tr><td>alto cisalhamento homogeneizador-Microfluidizer</td><td>MicroFluidics</td><td>LM10</td><td>Número da seção do protocolo-6.1.3</td></tr><tr><td>HPLC - 1260 infinity II Bio-Insert HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td>Número da seção do protocolo-7.1</td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LiCor</td><td></td><td>Software de análise de imagem Número da seção do protocolo-5.1</td></tr><tr><td>MAB2166</td><td>Sigma</td><td>MAB2166</td><td>Número da seção do protocolo-5.7</td></tr><tr><td>MAB2168</td><td>Número</td><td>da seção do protocolo EMD MAB2168</td><td>- 5.7</td></tr><tr><td>MAB3E10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47757</td><td>Número da seção do protocolo - 5.7</td></tr><tr><td>MAB4E10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-7757</td><td>Número da seção do protocolo - 5.7</td></tr><tr><td>MAB5490</td><td>Sigma</td><td>MAB5490</td><td>Número da seção do protocolo - 5.7</td></tr><tr><td>MAB5492</td><td>Sigma</td><td>MAB5492</td><td>Número da seção do protocolo - 5.7</td></tr><tr><td>MAB8A4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47759 Número da</td><td>Seção do Protocolo-5.7</td></tr><tr><td>detector de dispersão de luz multi-ângulo</td><td>Wyatt</td><td></td> Número <td>da Seção do Protocolo-7.1</td></tr><tr><td>Padrão de Proteína Não Corada NativeMark</td><td>Invitrogen</td><td>LC0725</td><td>Número da Seção do Protocolo-8.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>Número da Seção do Protocolo-5.6</td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolab</td><td>R0131S</td><td>Versão Hi-Fi disponível Número da Seção do Protocolo-2.2</td></tr><tr><td>NuPAGE 3&ndash; 8% de géis de acetato de tris</td><td>Invitrogen</td><td>EA0375PK2</td><td>Número da seção do protocolo-5.4</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-acetato SDS Buffer de execução</td><td>Invitrogen</td><td>LA0041</td><td>Número da seção do protocolo-5.4</td></tr><tr><td>PEI 25K</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td>Número da seção do protocolo-4.1</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher</td><td>15070063</td><td>Número da seção do protocolo-4.2</td></tr><tr><td>Fosfato Solução salina tamponada (PBS)</td> <td>Cytiva</td><td>SH30256.02</td> Número <td>da seção do protocolo-4.5</td></tr><tr><td>kit miniprep de plasmídeo</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Número da seção do protocolo-2.6</td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England Biolab</td><td>R0560S</td><td>Número da seção do protocolo-2.2</td></tr><tr><td>gel pré-moldado de Bis-tris- 3-12% NativePAGE Novex Bis-Tris Gel</td><td>Invitrogen</td><td>BN1003BOX</td><td>Protocolo Número da seção-8.4</td></tr><tr><td>protease coquetel inibidor</td><td>GoldBio</td><td>GB-331-1</td><td>Número da seção do protocolo-5.1</td></tr><tr><td>Software de análise SEC-MALS - Astra 7</td><td>Tecnologia</td><td></td> Wyatt Número <td>da seção do protocolo-7.6</td></tr><tr><td>anticorpo secundário -IRdye 800 CW cabra anti-rato IgG</td><td>LiCor</td><td>926-32210</td><td>Número da seção do protocolo-5.9</td></tr><tr><td>Superose 6 pg XK 16/70</td><td>Cytiva</td><td>90100042</td><td>Número da seção do protocolo-6.2</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152</td> Número <td>da Seção do Protocolo-5.6</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher</td><td>AAJ20605AP</td><td>Número da Seção do Protocolo-6.1.1</td></tr><tr><td>Espectrômetro UV - Nanodrop 8000</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-8000-GL</td><td>Número da Seção do Protocolo-2.2</td></tr><tr><td>XK26/100</td><td>Cytiva</td><td>28988951</td><td>Número da Seção do Protocolo-6.1.1</td></tr></tbody></table>

produção eficiente e escalável de variantes de huntingtina humana de comprimento completo em células de mamíferos utilizando um sistema de expressão transitória

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

A huntingtina de comprimento total (FL HTT) é uma proteína grande (aa 1-3.144), onipresente e contendo poliglutamina (polyQ), com uma massa de aproximadamente 350 kDa. Embora a função celular da FL HTT não seja totalmente compreendida, uma expansão mutante do trato poliQ acima de ~36 repetições está associada à doença de Huntington (DH), com o comprimento do poliQ a correlacionar-se aproximadamente com a idade de início. Para entender melhor o efeito da estrutura na função do HTT mutante (mHTT), são necessárias grandes quantidades da proteína. A produção de submiligramas de FL HTT em células de mamíferos foi obtida usando a expressão estável da linhagem celular induzível por doxiciclina. No entanto, a produção de proteínas a partir de linhagens celulares estáveis tem limitações que podem ser superadas com métodos de transfecção transitória. 
Este trabalho apresenta um método robusto para a produção de baixa quantidade de miligramas de FL HTT e suas variantes a partir de plasmídeos otimizados para códons por transfecção transitória utilizando polietilenimina (PEI). O método é escalável (>10 mg) e produz consistentemente 1-2 mg/L de cultura celular de FL HTT altamente purificado. Consistente com relatórios anteriores, o estado da solução purificada de FL HTT foi considerado altamente dinâmico; a proteína tem uma propensão a formar dímeros e oligômeros de alta ordem. Uma chave para retardar a formação de oligômeros é trabalhar rapidamente para isolar as frações monoméricas das frações oligoméricas diméricas e de alta ordem durante a cromatografia de exclusão de tamanho. 
Cromatografia de exclusão de tamanho com espalhamento de luz multiângulo (SEC-MALS) foi utilizada para analisar o dímero e o teor oligomérico de ordem superior do HTT purificado. Não foi observada correlação entre o comprimento do poliQ do HTT FL (Q23, Q48 e Q73) e o teor de oligômeros. O construto exon1-deletado (aa 91-3.144) mostrou propensão à oligomerização comparável à FL HTT (aa 1-3.144). Os métodos de produção, purificação e caracterização por índice de refração (IR) SEC/MALS, eletroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE), western blot, Native PAGE e Blue Native PAGE são aqui descritos.

Fornecemos protocolos escaláveis que abrangem a conceção de construções, transfecção transitória e expressão e purificação de variantes da proteína huntingtina humana de comprimento total em células HEK293.

Produção Eficiente e Escalável de Variantes de Huntingtina Humana de Comprimento Completo em Células de Mamíferos utilizando um Sistema de Expressão Transitória

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

O protocolo foi desenvolvido para a produção de variantes de huntingin de comprimento total a uma escala de miligramas baixa. Permite proteínas consistentes de alta qualidade, essenciais para os investigadores da DH. Demonstrando o procedimento estará Michael Harris, um cientista pesquisador do Laboratório Curia.Comece adicionando um grama de polietilenoimina 25 K a um litro de água livre de endotoxinas e mexa bem. Ajustar o pH a 2,0 utilizando ácido clorídrico 100 milimolares e mexer até que toda a polietilenoimina se dissolva. Em seguida, ajuste o pH para 7,0 usando solução de hidróxido de sódio 100 milimolares e passe a solução através de um filtro de 0,2 micrômetro.Faça alíquotas da solução filtrada e armazene-as a menos 20 graus Celsius. Propagar células HEK293 no meio de crescimento suplementado com estreptomicina de penicilina em uma incubadora agitadora umidificada a 37 graus Celsius, 90 RPM, 5% de dióxido de carbono por 18 a 24 horas. Um dia antes da transfecção, diluir as células a uma densidade de cerca de 1,2 x 10 até a sexta célula de potência por mililitro em dois litros de meio de crescimento em um frasco de Erlenmeyer de cinco litros e incubar por 18 a 24 horas.No final da incubação, meça a densidade e a viabilidade celular usando um contador de células automáticas seguindo as instruções do fabricante. Após o cálculo da quantidade de polietilenoimina e plasmídeo necessários para a transfecção, diluir a polietilenoimina e o plasmídeo individualmente em 100 mililitros de PBS e incubar à temperatura ambiente durante cinco minutos. Em seguida, misture o plasmídeo diluído e a polietilenoimina rodopiando suavemente e incube a mistura à temperatura ambiente durante 30 minutos.Adicione a mistura à cultura de células e misture rodopiando suavemente. Agora, permita que as células cresçam por 24 horas. No dia seguinte, adicionar solução de butirato de sódio a uma concentração final de agente antiaglomerante e antiespumante de dois milimolares na proporção de volume de 1:1.000 para a cultura e incubar as células na incubadora do agitador umidificado por 48 horas.Depois de medir a viabilidade e a densidade celular, colher as células por centrifugação a 2.000 G por 30 minutos e armazenar o pellet celular a menos 80 graus Celsius antes da purificação. Para a purificação anti-FLAG utilizando FPLC, embalar 12 a 25 mililitros de resina anti-FLAG numa coluna vazia a um caudal de quatro mililitros por minuto utilizando o tampão A e ajustar a altura do êmbolo para remover o espaço entre a extremidade do êmbolo e o leito de resina. Em seguida, suspenda o pellet de célula descongelada em tampão de lise frio e passe a suspensão celular uma vez através de um homogeneizador de alto cisalhamento a 1.000 libras por polegada quadrada de pressão.Usando uma centrífuga equipada com um rotor de ângulo fixo compatível, esclareça o lisado a 20.000 G por uma hora. Programe o FPLC na janela Método, carregue o lisado clarificado através da bomba de amostra e lave a coluna com os volumes de coluna desejados de buffer A, B, C, D e buffer de eluição conforme descrito no manuscrito do texto. Quando a execução estiver concluída, analise 10 microlitros das frações de pico usando SDS-PAGE.Combine as frações de pico com a pureza desejada e economize aproximadamente 50 microlitros dos eluídos combinados para uma análise adicional do SDS-PAGE. Comece a equilibrar a coluna SEC usando o FPLC e carregue o eluído anti-FLAG através de um superloop de 50 mililitros. Depois de executar o buffer da SEC, permita que a separação da SEC ocorra durante a noite a quatro graus Celsius.Compare o perfil de eluição com o perfil de eluição HTT padrão para distinguir os picos de monômero, dímero e oligomérico de ordem superior. Agrupe as frações monoméricas de HTT com base no perfil de eluição da coluna SEC e, se desejado, agrupe as frações HTT oligoméricas e diméricas de ordem superior separadamente. Concentre a proteína HTT agrupada usando um concentrador centrífugo de 100 quilodaltons a quatro graus Celsius.Após o cálculo da concentração de proteína, alíquota inferior a 100 microlitros da proteína HTT purificada em um tubo de microcentrífuga crio-seguro. Congele as alíquotas usando nitrogênio líquido e armazene-as a menos 80 graus Celsius. Execute todos os SEC-MALS analíticos a quatro graus Celsius no sistema de HPLC, juntamente com um detector UV, um detector de dispersão de luz multi-ângulo, um detector de índice de refração diferencial e use 0,185 como o incremento do índice de refração para HTT.Limpe a bomba e os detectores com água filtrada de grau HPLC e conecte a coluna UHPLC ao sistema. Equilibre a coluna com água filtrada e, em seguida, o buffer SEC-MALS até que todos os sinais do detector atinjam a linha de base. Injete dois microlitros de solução de BSA a uma taxa de fluxo de 0,3 mililitros por minuto durante 15 minutos por injeção.Inspecione a qualidade dos dados, execute a normalização, o alinhamento de pico e a correção de ampliação de banda com base no perfil BSA e crie um modelo para as seguintes execuções de amostra HTT. Descongele rapidamente um frasco para injetáveis da amostra FL Q23-HTT num banho de água à temperatura ambiente utilizando um flutuador. Filtre o HTT através de um filtro de rotação de 0,1 micrômetro.Injete de dois a quatro microlitros da amostra de HTT e corra por 15 minutos a quatro graus Celsius a uma taxa de fluxo de 0,3 mililitros por minuto. Analise os dados cromatográficos e de dispersão de luz usando o software de acompanhamento e gere um gráfico de Zimm para determinar a massa molecular média de peso para cada pico. No presente estudo, utilizando um processo de coluna de duas etapas, obteve-se maior que 95% de pureza para HTT e o principal contaminante foi a chaperona Hsp70, que foi eliminada por lavagem extensiva com cloreto de magnésio e ATP durante a etapa de purificação por afinidade anti-FLAG A superexpressão de FL HTT pode resultar em fragmentação da proteína, mas FL Q23-HTT produzida pelo método resolvida como uma única banda com o peso molecular correto de 350 quilodaltons indica que não há fragmentação.A análise de Western blot após a reação de anticorpos com FL Q23-HTT demonstrou que a proteína foi isolada sem truncamentos detectáveis significativos, uma vez que não foram observadas bandas adicionais relacionadas a fragmentos. FL HTT poli-Q comprimento variância, Q23, Q48 e Q73 reagiu como esperado em Western blot, mostrando um sinal progressivamente mais forte para o anticorpo monoclonal poli-Q dirigido MW1, correlacionando-se com o aumento do comprimento Q. Entre as colunas de HPLC testadas, a coluna SEC mostrou resolução suficiente entre o monômero HTT e o dímero, de modo que as massas molares puderam ser distinguidas.FL HTT purificado da SEC mostrou múltiplas bandas correspondentes aos estados de oligomerização, o que pode ser devido à presença de várias manchas hidrofóbicas que contribuem para a formação de oligômeros de ordem superior durante a migração dentro do gel. O HTT purificado mostrou três bandas principais em PAGE nativo azul com um peso molecular estimado de 643, 927 e 1.070 quilodaltons que provavelmente representam as espécies monomérica, dimérica e trimérica de HTT, respectivamente. O manuseamento adequado da huntingtina purificada é essencial para evitar a geração de oligômeros de alta ordem em agregados solúveis.É imperativo que o usuário final trabalhe rapidamente para distribuir a amostra em tubos pré-resfriados antes do congelamento instantâneo. Testes de estabilidade a longo prazo podem ser realizados em amostras armazenadas em períodos prolongados a menos 80 graus Celsius. A repetição das análises HPLC SEC-MALS confirmará se houve alguma alteração no conteúdo monomérico da amostra.

efficient-scalable-production-full-length-human-huntingtin-variants

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Na era pós-genômica humana, a disponibilidade de proteínas recombinantes em conformações nativas é crucial para a investigação estrutural, funcional e terapêutico e desenvolvimento. Aqui, nós descrevemos um-teste e em grande escala sistema de expressão de proteínas em células humanas embrionárias de rim 293T que podem ser utilizados para produzir uma variedade de proteínas recombinantes.

A Plataforma de expressão adequada e geral para a produção de proteínas secretadas a partir de células humanas

Uma maneira rápida e simples para gerar linhas de células humanas com sobre-expressão de cDNA induzido e reversível ou shRNA mediada knock-down do gene de interesse. Este método permite aos investigadores linhas celulares de modo fiável e altamente reprodutível manipular que são difíceis de alterar pelos métodos de transfecção transiente ou convencionais knockdown / knockout estratégias.

A geração de linhas de células humanas estáveis ​​com tetraciclina induzível (Tet-on) ou shRNA Expression cDNA

A expressão de proteínas recombinantes por sistemas de mamíferos está se tornando um método atraente para a produção de complexos proteicos para biologia estrutural. Aqui apresentamos um sistema de expressão simples, mas altamente eficiente, usando células de mamíferos cultivadas em suspensão para purificar complexos de proteínas para estudos estruturais.

Expressão de proteínas recombinantes de Biologia Estrutural em HEK 293F Suspensão Cells: Uma abordagem inovadora e acessível

Descrevemos aqui um sistema de expressão de granzima econômico usando células HEK293T que produz altos rendimentos de protease pura, totalmente glicosilada e enzimaticamente ativa.

A High Yield e custo-eficiente sistema de expressão de Granzimas Humanos em células de mamíferos

Este é um protocolo rápido e econômico para a produção de proteínas de mamíferos glicosiladas secretadas e subsequente purificação em uma única etapa com rendimentos suficientes de proteína homogênea para cristalografia de raios-X e outros estudos biofísicos.

Expressão Mammalian Cell eficiente e de uma etapa de purificação extracelular glicoproteínas para a cristalização

A produção em escala laboratorial de proteínas eucarióticas com modificação pós-traducional apropriada representa uma barreira significativa. Aqui está um protocolo robusto com rápido estabelecimento e retorno para expressão de proteínas usando um sistema de expressão de mamíferos. Este sistema suporta aminoácidos seletivos, marcação seletiva de proteínas e moduladores de moléculas pequenas da composição de glicanos.

High Yield Expressão de proteínas recombinantes humanas com o Transient transfecção de células HEK293 em suspensão

Estudar canais iônicos através de um sistema heterólogo expressar tornou-se uma técnica nuclear em pesquisa biomédica. Neste texto, apresentamos um método eficiente tempo para conseguir uma expressão de canal iónico com força controlada através da realização de transfecção transiente, sob o controlo de um promotor indutível.

Controlável Expressão Ion Canal através de transfecção transiente Induzível

Aqui, apresentamos um protocolo robusto e otimizado para a produção de quantidades de miligrama de monômeros nativos, livre de marca e fibrilas do exon1 da proteína huntingtina (Httex1) com base na fusão transitória do ubiquitin pequeno modificador relacionados (SUMO).

Geração de nativos, sem marcas de formatação da huntingtina Exon1 monômero e fibrilas usando uma estratégia de fusão de sumô

Alvo de DNA Epigenoma edição representa uma poderosa abordagem terapêutica. Este protocolo descreve a produção, purificação e concentração de vetores Lentivirus all-in-one, abrigando o transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicativos de edição de Epigenoma em células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSC)-derivado de neurônios.

Vetor de Lentivirus de plataforma para a entrega eficiente de ferramentas de edição de Epigenoma em humanos induzida por modelos de doenças derivadas de células-tronco pluripotentes

BDNF recombinante contendo uma sequência de Avi (BDNFAvi) é produzido em células HEK293 de forma econômica e é purificado por cromatografia de afinidade. BDNFavi é então diretamente mono-biotiningado com a enzima BirA em um tubo. BDNFavi e BDNFavi mono-biotiniladas mantêm sua atividade biológica quando comparadas com bdnf disponíveis comercialmente.

Um protocolo aprimorado para purificar e diretamente mono-biocombinado recombinante BDNF em um tubo para estudos de tráfico celular em neurônios

Aqui, um protocolo de produção de AAV baseado em células HEK293 de suspensão é apresentado, resultando em tempo e mão de obra reduzidos necessários para a produção de vetores usando componentes que estão disponíveis para fins de pesquisa de fornecedores comerciais.

Produção de lotes vetoriais associados a adeno de alto rendimento usando células de suspensão HEK293

Aprenda a produzir variantes de huntingtina humana de comprimento completo em células HEK293 com alta pureza. Este protocolo utiliza transfecção com polietilenimina e cromatografia de afinidade anti-FLAG para pesquisa da doença de Huntington.

Produção Eficiente e Escalável de Variantes de Huntingtina Humana de Comprimento Completo em Células de Mamíferos utilizando um Sistema de Expressão Transitória (Vídeo) | JoVE Journal

Produção Eficiente e Escalável de Variantes de Huntingtina Humana de Comprimento Completo em Células de Mamíferos utilizando um Sistema de Expressão Transitória

Explorar mais vídeos