Imagem confocal de alta taxa de imagem confocal de sars-cov-2 trimers de pico conjugados de alta throughput para rastrear a vinculação e a endocitose em células HEK293T

Estabelecemos uma tecnologia de plataforma para SARS COVID 2 que pode ser aplicável a outros vírus com reconhecimento celular mediado de Spike e entrada como o primeiro passo na infecção viral celular. Os pontos quânticos são brilhantes, estáveis, e sua superfície pode ser funcionalizada para uma variedade de aplicações celulares. Usando este método, podemos visualizar e medir a internalização do Spike nas células.

Para preparar 0,1%BSA. Adicione 130 microliters de 7,5% BSA a 10 mililitros de mídia de imagem em mistura. Para uma diluição serial de 6,1 a três e triplicado adicione 14,26 microliters de QD Spike a 285,74 microliters do BSA de 0,1% para fazer a maior concentração de 20 nanomole.

Em seguida, adicione 100 microliters de 20 nanomole ou QD Spike a 200 microliters de 0,1%BSA para fazer a segunda ilusão de 6,67 nanomole QD Spike. Remova todas as mídias gastas de cada poço com um aspirador multicanal, lave uma vez com uma pipeta multicanal com 100 microliters de mídia de imagem por poço, depois aspire 100 microliters da mídia de imagem. Adicione 50 microliters de solução QD Spike por poço e incubar a placa por três horas em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Usando equipamentos de proteção, prepare 4%PFA e 0,1% DE MÍDIA DE IMAGEM PSA dentro de um gabinete de bio segurança estéril, aspire 50 microliters de QD Spike de cada poço e adicione 100 microliters de 4%PFA por poço com uma pipeta multicanal automatizada para evitar a secagem dos poços. Incubar por 15 minutos à temperatura ambiente, depois lavar três vezes com PBS, preparar o corante nuclear vermelho profundo diluindo a solução de estoque de cinco milímetros em um a 1000 em PBS, aspirar o PBS e adicionar de volta 50 microliters de corante nuclear diluído por poço. Incubar por 30 minutos à temperatura ambiente e depois lavar três vezes com PBS, imagear a placa ou selá-la usando um selador de placas para imagem posteriormente.

Guarde a placa a quatro graus Celsius. Inicie o software para a plataforma de imagem. Depois de fazer login na plataforma de imagem criar um novo protocolo de aquisição selecionando o tipo de placa como uma placa de imagem inferior transparente de parede 96, selecione o modo óptico se tornou focal e ampliação como 40 vezes imersão em água, selecione binning como um.

Selecione o modo para contrastes faciais digitais, como alto contraste para produzir corpos celulares bem definidos. Tire um instantâneo para confirmar que este título é apropriado, como visto na janela de imagem, selecione o canal fit C para uso com a linha celular ACE2-GFP para visualizar o tráfico DE ACE2 dentro da célula. Para fazer um canal QD personalizado, selecione o menu suspenso do triângulo e escolha a excitação na faixa de 405 nanômetros na faixa de 608 nanômetros, selecione um poço com um robusto sinal QD citoplasmico para definir o tempo de exposição, a potência do laser e a posição de altura Z.

Verifique se a altura padrão produz uma imagem das células no plano focal desejado. A posição Z será menor para a puncta de endócitose do que a posição Z para a membrana plasmática. Escolha um tempo de exposição, tipicamente entre 100 e 300 milissegundos que produz uma imagem brilhante com níveis cinzentos, pelo menos três vezes maior que o sinal de fundo.

A 20 nanomole os níveis cinzentos devem ser aproximadamente 6.000 unidades atômicas com 200 milissegundos de tempo de exposição e 80% de potência laser. Verifique os níveis cinzentos clicando à direita na imagem produzida com o recurso de instantâneo em cada canal e selecionando a intensidade do show, em seguida, clique no objeto de interesse ou plano de fundo para ver o nível cinza para esse pixel, ajuste a potência laser para ajustar a intensidade dos objetos de interesse. Salve o protocolo de aquisição, mude para executar o experimento e digite o nome da placa, execute o experimento.

A translocação de QDs e ACE2 foi visualizada utilizando microscopia de fluorescência e uma linha celular expressa de ACE2-GFP. A segmentação de imagens e análises subsequentes foram realizadas para extrair parâmetros relevantes, como contagem de manchas. Primeiro, os núcleos foram segmentados a partir do canal de marcadores nucleares para criar uma população de ROI.

Em seguida, uma região de ROI delineando a célula com segmentação usando o canal ACE2-GFP. Por fim, os pontos de pico QD 608 foram segmentados a partir da região do ROI celular, os sinais de QD internalizado e ACE2 mostraram forte co-localização. Um experimento de resposta de concentração com seis concentrações diferentes de QD Spike foi realizado em células HEK 293T.

Determinando concentrações ópticas de QD, QDS pode ser usado tão baixo quanto 2,22 nanomole, no entanto, recomenda-se usar concentrações de 10 nanomole ou superior para garantir uma resposta robusta. Durante a conjugação para a agregação de proteína qd pode ocorrer. Agregados foram detectados na solução QD como precipitados brilhantes e células HEK 293T, QDs foram incubados com anticorpos neutralizados a partir de 30 microgramas por microliter antes da adição às células, esses anticorpos bloquearam a internalização de ligação e causaram uma redução na contagem de manchas em comparação com células tratadas apenas com QD.

Este ensaio também pode ser usado para triagem de alto rendimento, avaliação de chumbo de anticorpos neutralizantes para identificar antivirais de trocadilhos para a entrada viral do bloco e ser adaptado para estudar variantes recém-emergentes.