Name: Recuperação aprimorada do óleo usando uma combinação de biosurfactantes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Aprenda métodos de triagem e caracterização de biosurfactantes produzidos por Rhodococcus, Lysinibacillus e Paenibacillus para recuperação aprimorada de óleo residual. Esta técnica sustentável oferece vantagens ambientais significativas.

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Os autores gostariam de agradecer ao Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia, pelo apoio financeiro.

1. Crescimento de cepas microbianas
<ol><li>Pese 2 g de pó de Caldo de Luria e adicione a 50 mL de água destilada em um frasco cônico de 250 mL. Misture o conteúdo até que o pó se dissolva completamente e coma o volume de 100 mL usando água destilada.</li>
	<li>Da mesma forma, prepare mais dois frascos de 100 mL de Caldo de Luria e coloque tampões de algodão no pescoço dos frascos.</li>
	<li>Cubra os plugues de algodão com papel alumínio e autoclave os frascos por 15 min a 121 °C e 15 psi para esterilizar a mídia.</li>
	<li>Depois de autoclaving, deixe a mídia esfriar até a temperatura ambiente.</li>
	<li>Para a preparação da cultura primária de uma cepa, escolha uma única colônia de uma placa de LA usando um laço de inoculação e inoculada em um tubo de ensaio contendo 5 mL de caldo Luria estéril.</li>
	<li>Incubar o tubo de ensaio durante a noite a 30 °C a 180 rpm.</li>
	<li>Inocular os frascos contendo 100 mL de Caldo de Luria autoclaved adicionando 1 mL de culturas de sementes cultivadas durante a noite aos frascos dentro do armário de fluxo de ar laminar.</li>
	<li>Incubar os frascos em uma incubadora rotativa a 30 °C e 180 rpm durante 7 dias.</li>
	<li>Após a conclusão do período de incubação, colhia os frascos e transfira o caldo de cultura para os tubos de centrífuga. Centrifugar a cultura a 4.500 x g por 20 min em uma centrífuga refrigerada a 4 °C.</li>
	<li>Suavemente, despeje a célula livre de supernasce em um béquer fresco e use-a em ensaios de triagem para produção biosurfactante.</li>
</ol>2. Ensaios de triagem para produção biosurfactante
NOTA: Nas seções a seguir, o surfactante comercial (Saponin) foi usado como controle positivo, enquanto a água e a mídia não vacinada foram utilizadas como controle negativo.
<ol><li>Ensaio de colapso de queda
	<ol>
<li>Pegue uma lâmina de vidro limpa e cubra a superfície do slide com 200 μL de óleo.</li>
		<li>Adicione 20 μL da supernasce livre de células ao centro do óleo e deixe-o intacto por 2-3 min. NOTA: Se a queda entrar em colapso, marque o supernatante positivo para a presença de biosurfactante.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio de espalhamento de óleo
	<ol>
<li>Pegue 20 mL de água dupla destilada em uma placa de Petri (75 mm de diâmetro) e adicione 200 μL de petróleo bruto à superfície da água.</li>
		<li>Adicione 20 μL de supernanato livre de células ao centro do óleo e deixe-o intacto por 1 min. NOTA: Se uma zona de desobstrução for formada por causa do deslocamento do óleo, escore o positivo sobrenante para a presença do biosurfactante.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio do índice de emulsão (ensaio E24 )
	<ol>
<li>Adicione 4 mL de gasolina (gasolina) e supernanato sem células cada um em um tubo de ensaio de vidro limpo.</li>
		<li>Vórtice a mistura vigorosamente por 3 min e deixá-la intacta pelas próximas 24 horas.</li>
		<li>Após 24 horas, determine o índice E24 como uma porcentagem da altura da camada emulsificada (cm) em relação à altura de toda a coluna líquida (cm). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63207/63207eq01.jpg" style="margin: auto;"> NOTA: Se uma emulsão (óleo na água ou água no óleo) for observada após 24h, é provável que o supernatante contenha o biosurfactante.</li>
	</ol></li>
	<li>Medição da tensão superficial NOTA: A tensão superficial foi medida utilizando o método do anel Du Noüy17. O instrumento utilizado neste experimento (ver Tabela de Materiais) é muito sensível, por isso garanta a limpeza adequada do vaso de vidro e da sonda.<ol>
<li>Ligue o sistema e clique duas vezes no software associado para abri-lo.</li>
		<li>Limpe o recipiente de vidro com o líquido cuja tensão superficial deve ser determinada.</li>
		<li>Adicione o líquido (40 mL) no recipiente e monte o recipiente no suporte do vaso.</li>
		<li>Desbloqueie o suporte da sonda e monte a sonda nele. Agora bloqueie o suporte da sonda pressionando o botão Travar no controlador manual.</li>
		<li>Usando o controlador manual, ajuste a altura da plataforma de modo que a sonda esteja a cerca de 2-3 mm de distância da superfície do líquido.</li>
		<li>Agora use o software para medir a tensão superficial. Clique em Arquivo localizado no painel superior esquerdo da tela. Clique em Abrir espaço de trabalho. Uma janela pop-up aparecerá.</li>
		<li>Role para baixo e clique duas vezes no ícone K100: Surface and Interfacial Tension .</li>
		<li>Agora, clique no ícone Arquivo localizado no canto superior esquerdo da tela. Clique em Novo Banco de Dados. Digite o nome para salvar os dados e clique em OK.</li>
		<li>Novamente, clique em Arquivo &gt; Nova medição &gt; SFT &gt; Ring. Digite o nome para a medição. Certifique-se de que o modelo de configuração mostra o anel SFT.</li>
		<li>Preencha os detalhes na janela Configuração de medição selecionando a sonda e a nave que está sendo usada para a medição. Além disso, preencha os detalhes do líquido e da fase gasosa. NOTA: A fase líquida será de água, enquanto a fase gasosa será de ar. A densidade da fase líquida é a densidade do supernanato livre de células. Isso pode ser determinado tomando o peso de 50 mL do líquido e calculando a densidade como Kg/m3.</li>
		<li>Agora clique na guia Procedimento e preencha os seguintes detalhes: Velocidade de detecção: 6 mm/min, Sensibilidade de detecção: 0,005 g, Velocidade de Pesquisa: 6 mm/min, Sensibilidade à pesquisa: 0,005 g, Velocidade de Medição: 3 mm/min, Sensibilidade de Medição: 0,001 g, Profundidade de Imersão: 3 mm, Distância de Retorno: 10%, correção: Harkins &amp; Jordan, valores máximos: 5. Clique em OK.</li>
		<li>Na janela pop-up, selecione o banco de dados para armazenar dados e clique em OK. NOTA: Pode-se criar um novo banco de dados aqui ou adicionar novas medidas aos dados existentes.</li>
		<li>Agora clique no botão Reproduzir localizado no centro superior da tela. O sistema começará a executar o script. Depois que o sistema estabilizar, detectará a superfície. Mergulhe a sonda no líquido, mova a sonda para frente e para trás e detecte a tensão na lamella formada.</li>
		<li>Para obter os resultados, clique no ícone Medição no lado meio-esquerdo da tela. Clique em Data e note abaixo a tensão superficial determinada.</li>
		<li>Após a conclusão da medição, baixe a altura da plataforma e desbloqueie e desmonte a sonda e o vaso do instrumento. NOTA: Para determinar a diminuição da tensão superficial devido à produção biosurfactante, a LB não vacinada deve ser usada como controle.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Extração biosurfactante
<ol><li>Ajuste o pH do supernanato livre de células para 2 usando 2 N HCl. Armazene a mistura a 4 °C durante a noite.</li>
	<li>Adicione o volume igual de mistura clorofórmio-metanol (2:1) ao supernante e misture vigorosamente por 20 minutos.</li>
	<li>Deixe a mistura intacta para que a separação de fase ocorra.</li>
	<li>Remova a fase superior contendo água e metanol e deixe a fase inferior contendo o biosurfactante para evaporar em um capô de fumaça.</li>
	<li>Após a evaporação da fase orgânica, ressolar o biosurfactante bruto cor de mel em 3 mL de clorofórmio e usar esta mistura para maior identificação e caracterização do biosurfactante.</li>
</ol>4. Estudos de estabilidade da emulsão
<ol><li>
Estabilidade de emulsão em diferentes temperaturas
	<ol>
<li>Tome 5 mL de supernantes livres de células em diferentes tubos de ensaio.</li>
		<li>Adicione 5 mL de gasolina a cada tubo de ensaio e misture vigorosamente por vórtice por 3 minutos.</li>
		<li>Incubar os tubos de ensaio durante a noite em diferentes banhos de água em diferentes temperaturas (30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C e 70 °C).</li>
		<li>Após 24h, estime os índices de emulsão mencionados anteriormente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estabilidade de emulsão em diferentes valores de pH
	<ol>
<li>Tome 5 mL da supernasce sem células em tubos de ensaio limpos.</li>
		<li>Ajuste o pH de supernacantes livres de células (2, 4, 6, 8 e 10) usando 1 N HCl e 1 N NaOH.</li>
		<li>Adicione uma quantidade igual de gasolina aos tubos de ensaio e misture vigorosamente por vórtice por 3 minutos.</li>
		<li>Deixe os tubos de ensaio imperturbáveis à temperatura ambiente por 24 horas.</li>
		<li>Estime o índice de emulsão como mencionado anteriormente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estabilidade de emulsão em diferentes concentrações de sal
	<ol>
<li>Tome 5 mL da supernasce sem células em tubos de ensaio limpos.</li>
		<li>Adicione diferentes quantidades de sal (NaCl) aos supernantes (0 g/L, 5 g/L, 10 g/L, 20 g/L, 60 g/L e 80 g/L).</li>
		<li>Dissolva os sais nas células livres de supernaentes por vórtice por 3 minutos.</li>
		<li>Adicione uma quantidade igual de gasolina aos tubos de ensaio e misture vigorosamente por vórtice por 3 minutos.</li>
		<li>Deixe os tubos de ensaio imperturbáveis à temperatura ambiente por 24 horas.</li>
		<li>Estime o índice de emulsão após 24 h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Determinando a natureza do biosurfactante
<ol><li>
TLC do biosurfactante extraído
	<ol>
<li>Local 20 μL dos biosurfactantes em placas TLC. Ponto 2 μL de uma só vez.</li>
		<li>Localmente, os biosurfactantes em três placas TLC diferentes.</li>
		<li>Prepare uma mistura de 100 mL do eluent contendo clorofórmio:metanol (2:1) e adicione o eluente à câmara TLC. Feche a tampa da câmara e deixe-a saturar por 20 minutos.</li>
		<li>Depois de secar as placas, coloque as placas TLC dentro da câmara saturadas com uma mistura de metanol clorofórmio e execute o TLC.</li>
		<li>Depois que o eluente atingir a parte superior da placa TLC (1 cm de distância da parte superior), retire as placas e deixe-a secar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coloração para detecção de lipídios
	<ol>
<li>Pegue uma câmara TLC limpa e adicione alguns (5-10) grânulos de iodo na câmara fresca e saturar a câmara por 5 a 10 minutos.</li>
		<li>Coloque a placa TLC dentro da câmara e observe para o desenvolvimento das manchas amarelas. Se as manchas aparecerem, escore o biosurfactante positivo para a presença do componente lipíduo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coloração para detecção de peptídeos ou aminoácidos
	<ol>
<li>Prepare uma solução de ninidrina dissolvendo 0,4 g de ninidrina em 20 mL de butanol. Adicione 0,6 mL de ácido acético glacial 100% à mistura.</li>
		<li>Pulverize a placa TLC com solução de ninidrina e deixe secar o ar por 2 minutos. Aqueça a placa a 110 °C e observe o desenvolvimento da cor. NOTA: Se as manchas azuis aparecerem, escore o biosurfactante positivo para a presença de qualquer cadeia de peptídeo ou aminoácido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coloração para detecção de carboidratos
	<ol>
<li>Prepare uma solução de p-anisaldeído adicionando 2 mL de p-anisaldeído a 48 mL de ácido acético glacial contendo 1 mL de H2SO4. Adicione 0,6 mL de ácido acético à mistura.</li>
		<li>Pulverize a mistura uniformemente em uma placa TLC e deixe secar o ar por 2 minutos.</li>
		<li>Incubar a placa a 110 °C e monitorar o desenvolvimento das manchas. NOTA: Se aparecerem as manchas verdes ou pardas, escore o biosurfactante positivo para a presença de quaisquer carboidratos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Identificação química do biosurfactante
<ol><li>LCMS do biosurfactante
	<ol>
<li>Dissolva 25 mg do biosurfactante extraído em 1 mL de clorofórmio.</li>
		<li>Execute LCMS (em uma configuração de spray de bloqueio com uma frequência de varredura de referência de 10 s) usando uma coluna C18.</li>
		<li>Use clorofórmio:metanol (1:1) como fase móvel e injete 2 μL da amostra na coluna a uma taxa de fluxo de 0,1 mL/min.</li>
		<li>Definir os parâmetros experimentais para: polaridade: ES positiva, tensão capilar: 3 kV, temperatura-fonte: 80 °C, temperatura de desolação: 300 °C, taxa de fluxo de gás dessolvação: 7.000 L/h, e fluxo de gás de captura: 0,40 mL/min.</li>
		<li>Escaneie os 100 a 1.200 Da durante um tempo de detecção de 20 minutos e pesquise os íons no modo ES positivo.</li>
		<li>Analise os valores m/z usando qualquer software de espectrometria de massa.</li>
		<li>Para análise, entre no software.</li>
		<li>Clique em Pesquisa em Lote e insira a lista das massas obtidas. Pesquise os resultados em um modo de carga positiva e use M + H e M + Na como os adutos. Mantenha a precisão de 10 PPM e marque na Estrutura de Exibição.</li>
		<li>Clique em Pesquisar e na lista de compostos, selecione aquele com o nível de PPM mais baixo.</li>
	</ol></li>
	<li>1 H NMR do biosurfactante NOTA: 1H NMR do biosurfactante foi realizado utilizando um espectrômetro NMR de 400 MHz (ver Tabela de Materiais).<ol>
<li>Dissolva 5 mg do biosurfactante em 1 mL de clorofórmio deuterado (CdCl3).</li>
		<li>Transfira a mistura para um tubo NMR. Tampe o tubo corretamente e insira o tubo na chave inglesa. Ajuste a altura do tubo usando o tubo do ajustador.</li>
		<li>Coloque o tubo junto com a chave inglesa na máquina NMR e siga os passos mencionados abaixo para obter um espectro NMR.</li>
		<li>Para selecionar o tipo de tubo de amostra: sx N, onde N é a posição onde o tubo foi colocado (por exemplo, sx 13, se o tubo foi colocadona posição 13) em software associado.</li>
		<li>Digite edc e pressione Enter para criar uma nova pasta onde os dados podem ser armazenados.</li>
		<li>Um pop-up aparecerá. Selecione o solvente clicando no CdCl 3 na lista e digite o nome da amostra.</li>
		<li>Para iniciar o protocolo, digite "getprosol"; para travar o solvente, digite "lock cdcl3".</li>
		<li>Digite "topshim" para shim a amostra e, finalmente, digite "rga;zgefp" para adquirir os dados. Isso vai começar o protocolo.</li>
		<li>Após a obtenção do espectro, digite "apk;abs n" e pressione enter para correção de fase e linha de base.</li>
		<li>Para selecionar picos primários, digite "pp" e pressione Enter. Para selecionar apenas picos intensos, digite "mi" e digite a intensidade acima da qual os picos devem ser selecionados. O valor padrão será 0.2.</li>
		<li>Para integrar os picos, clique em Integrar e coloque o cursor no lado esquerdo do pico para ser integrado e enquanto segura o clique do cursor e arraste o cursor ao redor do pico.</li>
		<li>Salve os dados clicando em Arquivo no canto superior esquerdo e, em seguida, clique em Salvar.</li>
		<li>A amostra pode ser ejetada da máquina digitando "sx ej".</li>
		<li>Analise os picos e determine o ambiente dos átomos H.</li>
	</ol></li>
	<li>Fourier Transform Infrared Spectroscopy of the biosurfactant NOTA: FT-IR do biosurfactante extraído foi realizado utilizando-se um espectrômetro comercialmente disponível no modo ATR (ver Tabela de Materiais).<ol>
<li>Ligue o espectrômetro e verifique o expurgo, o dessecante e o detector.</li>
		<li>Para coletar um espectro, primeiro colete o espectro de fundo sem uma amostra no lugar.</li>
		<li>Pegue o biosurfactante extraído e seque-o completamente. Coloque o biosurfactante seco diretamente sobre o cristal de diamante, aplique pressão e pressione o ponto de toque ATR.</li>
		<li>No software, selecione o número das varreduras (digite 30) e escaneie o espectro de 400 cm-1 a 4.000 cm-1.</li>
		<li>Clique em OK para adicionar o espectro de amostra à janela espectral.</li>
		<li>Clique em Arquivos &gt; Salve &gt; Salve As e digite o nome do arquivo seguido de extensão .spa e clique em OK.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Aplicação biosurfactante (recuperação aprimorada do óleo)
NOTA: Neste experimento, a água dupla destilada foi utilizada como controle negativo e 10% SDS, 10% Tween 80 e 10% saponina comercial foram utilizadas como controles positivos.
<ol><li>Pegue o vidro e sele a tomada inferior com lã de vidro e contas de vidro.</li>
	<li>Embalar a coluna com solo arenoso de tal forma que algum líquido possa ser adicionado na parte superior do solo e o fluxo através pode ser coletado na parte inferior. Monte a coluna no suporte e adicione algumas contas de vidro em cima do solo.</li>
	<li>Inunde a coluna com 50 mL de solução de salmoura e colete o fluxo através para determinar o volume dos poros. volume de poros = volume de salmoura adicionado em cima - volume de fluxo através de coletado.</li>
	<li>Remova a salmoura da coluna forçando o petróleo cru a passar por ela depois de adicionar a partir da parte superior da coluna. Colete o volume da salmoura e do óleo que sai da coluna para determinar o volume inicial de saturação do óleo. O volume da salmoura liberada da coluna será o volume inicial de saturação do óleo ou o óleo original no local.</li>
	<li>Deixe a coluna intacta por 24 h.</li>
	<li>Após 24h, alagule a coluna com 10 volumes de poros de salmoura e recolhe o óleo que sai da coluna para estimar a recuperação secundária do óleo. O óleo deixado na coluna após a recuperação secundária do óleo corresponde ao óleo residual.</li>
	<li>Prepare uma mistura de biosurfactantes adicionando volumes iguais do biosurfactante extraído (extraído após a etapa 3.5) ao béquer de vidro. Adicione os biosurfactantes ao topo da coluna e incubar a coluna por 24h.</li>
	<li>Após 24 horas, meça a quantidade de óleo e água para determinar a recuperação adicional ou aprimorada do óleo. O volume do óleo liberado da coluna corresponderá ao óleo residual recuperado.</li>
	<li>Estimar uma recuperação aprimorada do óleo com a seguinte equação: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63207/63207eq02.jpg" style="margin: auto;">
</li>
</ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Os biosurfactantes são um dos mais versáteis grupos de componentes biologicamente ativos que estão se tornando alternativas atraentes para surfactantes químicos. Eles têm uma ampla gama de aplicações em inúmeras indústrias, como detergentes, tintas, cosméticos, alimentos, produtos farmacêuticos, agricultura, petróleo e tratamento de água devido à sua melhor capacidade de lintibilidade, menor CMC, estrutura diversificada e simpatia ambiental18. Isso levou a um maior interesse em descobrir mais cepa...

Biosurfactantes são as moléculas anfípáticas de superfície ativa produzidas por microrganismos que têm a capacidade de reduzir a superfície e a tensão interfacial entre duas fases1. Um biosurfactante típico contém uma parte hidrofílica que é geralmente composta de uma moiety de açúcar ou uma cadeia de peptídeos ou aminoácidos hidrofílicos e uma parte hidrofóbica que é composta de uma cadeia de ácidos graxos saturados ou insaturados2. Devido à sua natureza anfípppica, os biosurfactantes se reúnem na interface entre as duas fases e reduzem a tensão interfacial no limite, o que facilita a dispersão de uma fase para a outra 1,3. Vários tipos de biosurfactantes que foram relatados até agora incluem glicolipídios nos quais os carboidratos estão ligados a ácidos alifáticos de cadeia longa ou hidroxia-alifáticos através de ligações éster (por exemplo, rhamnolipids, trehalolipids e sophorolipids), lipopeptides nos quais lipoides são ligados a cadeias de polipeptídeos (por exemplo, surfactina e lichenysina), e biosurfactantes poliméricas que são geralmente compostos de complexos de proteínas polissacarídeos (por exemplo, emulsano, liposano, alasan e lipomannan)4. Outros tipos de biosurfactantes produzidos pelos microrganismos incluem ácidos graxos, fosfolipídios, lipídios neutros e biosurfactantesde partículas 5. A classe mais estudada de biosurfactídeos é a glicoslipids e entre eles a maioria dos estudos foram relatados sobre rhamnolipids6. Os rhamnolipids contêm uma ou duas moléculas de rhamnose (que formam a parte hidrofílica) ligadas a uma ou duas moléculas de ácido graxo de cadeia longa (geralmente ácido hidroxi-decanoico). Rhamnolipids são glicolipídios primários relatados primeiro de Pseudomonas aeruginosa7.
Os biosurfactantes têm ganhado cada vez mais foco em comparação com suas contrapartes químicas devido a várias propriedades únicas e distintas que oferecem8. Estes incluem maior especificidade, menor toxicidade, maior diversidade, facilidade de preparação, maior biodegradabilidade, melhor espuma, compatibilidade ambiental e atividade em condições extremas9. A diversidade estrutural dos biosurfactantes (Figura S1) é outra vantagem que lhes dá uma vantagem sobre as contrapartes químicas10. Eles são geralmente mais eficazes e eficientes em concentrações mais baixas, pois sua concentração crítica de micelas (CMC) é geralmente várias vezes menor do que os surfactantes químicos11. Eles têm sido relatados como altamente termostáveis (até 100 °C) e podem tolerar maior pH (até 9) e altas concentrações de sal (até 50 g/L)12 , assim, oferecem várias vantagens em processos industriais, que requerem exposição a condições extremas13. A biodegradabilidade e a menor toxicidade as tornam adequadas para aplicações ambientais, como a bioremediação. Devido às vantagens que oferecem, eles têm recebido maior atenção em várias indústrias como alimentos, agrícolas, detergentes, cosméticos e indústria petrolífera11. Os biosurfactantes também ganharam muita atenção na remediação do óleo para a remoção de contaminantes de petróleo e poluentes tóxicos14.
Aqui relatamos a produção, caracterização e aplicação de biosurfactantes produzidos por Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 e Paenibacillus sp. IITD108. As etapas envolvidas na triagem, caracterização e aplicação de uma combinação de biosurfactantes para maior recuperação do óleo estão descritas na Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63207/63207fig01.jpg"> Figura 1: Um método para maior recuperação do óleo usando uma combinação de Biosurfactantes. O fluxo de trabalho stepwise é mostrado. O trabalho foi realizado em quatro etapas. Primeiro, as cepas microbianas foram cultivadas e rastreadas para a produção de biosurfactantes por vários ensaios, que incluíram ensaio de colapso de queda, ensaio de espalhamento de óleo, ensaio de índice de emulsão e medição de tensão superficial. Em seguida, os biosurfactantes foram extraídos do caldo livre de células e sua natureza foi identificada por meio de cromatografia de camada fina e foram ainda identificadas usando LCMS, NMR e FT-IR. Na etapa seguinte, os biosurfactantes extraídos foram misturados e o potencial da mistura resultante para maior recuperação do óleo foi determinado utilizando-se a técnica da coluna de blocos de areia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63207/63207fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A triagem dessas cepas microbianas para produzir biosurfactantes foi feita pelo colapso da queda, propagação do óleo, ensaio do índice de emulsão e determinação de redução da tensão superficial do meio livre de células devido ao crescimento dos micróbios. Os biosurfactantes foram extraídos, caracterizados e quimicamente identificados por LCMS, 1H NMR e FT-IR. Finalmente, foi preparada uma mistura de biosurfactantes produzidos por esses micróbios e utilizada para recuperar o óleo residual em uma coluna simulada de embalagem de areia.
O presente estudo ilustra apenas os métodos envolvidos na triagem, identificação, caracterização estrutural e aplicação da combinação biosurfactante no aprimoramento da recuperação residual do óleo. Não fornece uma caracterização funcional detalhada dos biosurfactantes produzidos pelas cepas microbianas15,16. Vários experimentos como determinação crítica de micela, análise termogravimétrica, capacidade de wettability superficial e biodegradabilidade são realizados para caracterização funcional detalhada de qualquer biosurfactante. Mas como este artigo é um artigo de métodos, o foco é a triagem, identificação, caracterização estrutural e aplicação da combinação biosurfactante no aprimoramento da recuperação residual do óleo; esses experimentos não foram incluídos neste estudo.

<table><tbody><tr><td>Pipeta de 1 ml</td><td>Eppendorf, Alemanha</td><td>G54412G</td><td></td></tr><tr><td>1H NMR</td><td>Espectrômetro tipo Bruker Avance AV-III, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de 20 ul</td><td>Thermo scientific, EUA</td><td>H69820</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>JAISBO, Índia</td><td>Ser nº 5923</td><td>Jain Scientific</td></tr><tr><td>Queimador de chama azul</td><td>Rocker científico, Taiwan</td><td>dragon 200</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>GLR inovations, Índia</td><td>GLR09.022930</td><td></td></tr><tr><td>coluna C18</td><td>Agilent Technologies, EUA</td><td>770995-902</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf, Alemanha</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Merck, Índia</td><td>1.94506.2521</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio-d</td><td>SRL, Índia</td><td>57034</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon</td><td>Tarsons, Índia</td><td>546041</td><td>Polipropileno esterilizado por radiação</td></tr><tr><td>FT-IR</td><td>Thermo Fisher Scientific, EUA&</td><td>nbsp; Nicolet iS50</td><td></td></tr><tr><td>Exaustor</td><td>Khera, Índia</td><td>47408</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td> personalizado <td>Merck, Índia</td><td>1.93002</td><td></td></tr><tr><td>Contas de vidro</td><td>Merck, Índia</td><td>104014</td><td></td></tr><tr><td>Corrediças de vidro</td><td>Polar industrial Corporation, EUA</td><td>Blue Star</td><td>75 mm * 25 mm</td></tr><tr><td>Lã de vidro</td><td>Merk, Índia</td><td>104086</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Merck, Índia</td><td>1003170510</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Thermo Scientific, EUA</td><td>MaxQ600</td><td>Incubadora agitada</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Khera, Índia</td><td>Sunbim</td><td></td></tr><tr><td>Iodo resublimado</td><td>Merck, Índia</td><td>231-442-4</td><td>&nbsp; grânulos K12 resublimados</td></tr><tr><td>- Tensiômetro Kruss Kruss</td><td>Scientific, Alemanha</td><td>K100</td><td></td></tr><tr><td>Cabine de fluxo de ar laminar</td><td>Thermo Scientific, China</td><td>1300 Series A2</td><td></td></tr><tr><td>LCMS</td><td>Agilent Technologies, EUA</td><td>1260 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth</td><td>HIMEDIA, Índia</td><td>M575-500G</td><td>Metanol em pó</td></tr><tr><td></td><td>Merck, Índia</td><td>107018</td><td></td></tr><tr><td>Ninidrina</td><td>Titan Biotech Limited, Índia</td><td>1608</td><td></td></tr><tr><td>p- anisaldeído</td><td>Sigma, EUA</td><td>204-602-6</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Tarsons, Índia</td><td>460090-90 MM</td><td>Polipropileno esterilizado por radiação</td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Merck, Índia</td><td>232-462-6</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Merck, Índia</td><td>231-598-3</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensaio</td><td>Borosil, Índia</td><td>9800U06</td><td>Placas TLC de tubos de vidro</td></tr><tr><td></td><td>Merck, Índia</td><td>1055540007</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>GeNei, Índia</td><td>2006114318</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Julabo, Índia</td><td>SW21C</td><td></td></tr></tbody></table>

recuperação aprimorada do óleo usando uma combinação de biosurfactantes

Enhanced Oil Recovery using a Combination of Biosurfactants

Biosurfactantes são compostos ativos na superfície capazes de reduzir a tensão superficial entre duas fases de diferentes polaridades. Os biosurfactantes vêm surgindo como alternativas promissoras aos surfactantes químicos devido à menor toxicidade, alta biodegradabilidade, compatibilidade ambiental e tolerância a condições ambientais extremas. Aqui, ilustramos os métodos utilizados para a triagem de micróbios capazes de produzir biosurfactantes. Os micróbios produtores de biosurfactantes foram identificados usando o colapso da queda, a propagação do óleo e os ensaios do índice de emulsão. A produção biosufactante foi validada determinando a redução da tensão superficial da mídia devido ao crescimento dos membros microbianos. Descrevemos também os métodos envolvidos na caracterização e identificação de biosurfactantes. A cromatografia de camada fina do biosurfactante extraído seguido de coloração diferencial das placas foi realizada para determinar a natureza do biosurfactante. LCMS, 1H NMR e FT-IR foram utilizados para identificar quimicamente o biosurfactante. Ilustramos ainda os métodos para avaliar a aplicação da combinação de biosurfactantes produzidos para melhorar a recuperação residual do óleo em uma coluna simulada de embalagem de areia.

Três cepas bacterianas (Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 e Paenibacillus sp. IITD108) foram rastreadas para a produção de biosurfactantes por vários ensaios, que incluíram ensaio de colapso de queda, ensaio de deslocamento de óleo, ensaio do índice de emulsão e redução da tensão superficial. Supernantes livres de células de todas as três cepas bacterianas e uma solução de surfactante químico resultaram em um colapso de queda e, portanto, foram pontuados positivos para a prese...

Ilustramos os métodos envolvidos na triagem e identificação dos micróbios produtores biosurfactantes. Também são apresentados métodos de caracterização cromatografia e identificação química dos biosurfactantes, determinando a aplicabilidade industrial do biosurfactante no aprimoramento da recuperação residual do óleo.

Recuperação aprimorada do óleo usando uma combinação de biosurfactantes

Biosurfactants are surface-active compounds capable of reducing the surface tension between two phases of different polarities. Biosurfactants have been ...

Biosurfactantes são as moléculas ativas da superfície empática produzidas por microrganismos que têm a capacidade de reduzir a tensão superficial do líquido e a tensão interficial entre duas fases diferentes. A natureza empática dessas moléculas permite que elas se alinhem na interface entre duas fases diferentes, e melhorem a solubilização de uma fase em outra. Os biosurfactantes têm ganhado muita atenção em comparação com suas contrapartes químicas devido às várias vantagens que oferecem.Estes incluem maior especificidade, menor toxicidade, maior diversidade estrutural, facilidade de preparação, maior biodegradabilidade, maior compatibilidade ambiental e sua atividade em condições extremas de meio ambiente. Neste vídeo, demonstramos os métodos envolvidos na triagem, caracterização e biosurfactantes aplicação, produzidos por diferentes cepas de rodococcus, lysinibacillus e paenibacillus. Ilustramos ainda os métodos para avaliar a aplicação da combinação de biosurfactantes, produzida por essas três cepas microbianas na recuperação de óleo residual por uma técnica de coluna de blocos de areia.O trabalho foi realizado sob a orientação do Dr. Preeti Srivastava e do Dr. Manoj Kumar. Para o crescimento de micróbios, inocular os frascos contendo cem mililitros de caldo luria autoclaved, adicionando um mililitro de cultura de sementes cultivada durante a noite ao frasco dentro do armário de fluxo de ar laminar. Incubar os frascos em uma incubadora rotativa a 30 graus Celsius e 180 RPM por sete dias.Após a conclusão do período de incubação, colhe os frascos e transfira o caldo de cultura para os tubos de centrífuga. Centrifugar a cultura a 4.500 G por 20 minutos em uma centrífuga refrigerada a quatro graus Celsius. Despeje suavemente o supernatante sem células em um béquer fresco, e use-o em ensaios de triagem para produção biosurfactante.Para triagem da produção biosurfactante por um ensaio de colapso de queda, pegue um escorregador de vidro limpo e cubra a superfície do slide com 200 microliters de óleo. Agora adicione 20 microliters de supernanato livre de células ao centro do óleo, e deixe-o imperturbável por dois a três minutos. Se a queda entrar em colapso, marque o supernatant positivo para a presença de biosurfactante.Em ensaio de espalhamento de óleo, pegue 20 mililitros de água dupla destilada em uma placa de Petri e adicione 200 microliters de petróleo bruto na superfície da água. Agora adicione 20 microliters de supernanato livre de células ao centro do óleo, e deixe-o imperturbável por um minuto. Se uma zona de desobstrução for formada como resultado do deslocamento do óleo, escore o positivo sobrenatante para a presença de biosurfactante.No ensaio do índice de emulsão, adicione quatro mililitros de gasolina e supernanato livre de células cada um em um tubo de vidro limpo. Em seguida, o que a mistura vigorosamente por três minutos e deixá-la imperturbável para as próximas 24 horas. Para medir a tensão superficial do supernanato sem células, limpe o recipiente de vidro com o líquido cuja tensão superficial deve ser determinada.Adicione o líquido no recipiente e monte o recipiente no porta-vasos. Desbloqueie o suporte da sonda e monte a sonda nele. Usando o controlador manual ajuste a altura da plataforma, de modo que a sonda esteja a dois ou três milímetros de distância da superfície do líquido.Em seguida, vá para os softwares e siga os passos mencionados no papel para medir a tensão superficial. Após a conclusão da medição, baixe a altura da plataforma e desbloqueie e desmonte a sonda e o vaso do instrumento. Para extração de biosurfactante, ajuste o pH do supernanato livre de células para dois, usando dois ácidos clorídricos normais.Armazene a mistura a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, adicione o volume igual de mistura de metanol de clorofórmio e misture vigorosamente por 20 minutos. Deixe a mistura intacta para que ocorra uma separação gratuita.Remova a face superior, contendo água e metanol, e deixe a face inferior contendo biosurfactante para evaporar em um capô de fumaça. Após a evaporação da fase orgânica, ressolar o biosurfactante colorido de mel em três mililitros de clorofórmio, e usar essa mistura para caracterização e identificação do biosurfactante. Para caracterização cromatográfica do biosurfactante extraído, local 20 microlitres de biosurfactante em placas TLC.Depois de secar as placas, coloque a placa TLC dentro da câmara saturada com mistura de metanol clorofórmio e execute o TLC. Para detecção lipídica, adicione alguns grânulos de iodo na câmara fresca e satura a câmara por cinco a 10 minutos. Coloque o TLC dentro da câmara e observe para o desenvolvimento de manchas amarelas.Para detecção de proteínas e carboidratos, pulverize a placa TLC com não hidrogênio ou anisaldeído, e aqueça a 110 graus Celsius e observe para o desenvolvimento da cor. Para análise de RN, insira o tubo na chave inglesa. Ajuste a altura do tubo usando tubo ajustado.Coloque o tubo NMR, juntamente com a chave inglesa em uma máquina mr e siga os passos mencionados no papel para obter um espectro NMR. Para um experimento de recuperação de óleo aprimorado, pegue uma coluna de vidro e sele a saída inferior com lã de vidro e contas de vidro. Recue a coluna com solo de Areia de tal forma que algum líquido possa ser adicionado no topo do solo.Monte a coluna no suporte e adicione algumas contas de vidro em cima do solo. Inundar a coluna com 50 mililitros de solução de salmoura e coletar o fluxo através para determinar o volume ruim. Remova a salmoura da coluna forçando o petróleo bruto a passar por ela.Colete o volume de salmoura e óleo que sai da coluna para determinar o volume inicial de saturação do óleo. Após 24 horas, alage a coluna com 10 volumes fracos de salmoura, e recolhe o óleo que sai da coluna para estimar a recuperação secundária do óleo. O óleo deixado na coluna após a recuperação secundária do óleo corresponde ao óleo residual.Agora prepare uma mistura de biosurfactantes adicionando o biosurfactante extraído a um béquer de vidro. E adicione o biosurfactante e a mistura à coluna, e deixe-o imperturbável pelas próximas 24 horas. Após 24 horas, meça a quantidade de óleo e água que tem aludido para fora da coluna para determinar a recuperação adicional ou aprimorada do óleo.Os supernaentes livres de células das três cepas microbianas foram positivos para a presença de biosurfactantes, pois resultaram em colapso de gota, propagação de óleo e formação de emulsão. A confirmação da produção biosurfactante foi fornecida pela medição da tensão superficial do caldo livre de células. Devido ao crescimento de rhodococcus e lysinibacillus, a tensão superficial do meio reduziu de 59 para 45 mN por metro.Devido ao crescimento do paenibacillus, a tensão superficial do meio reduziu de 59 para 28,4 mN por metro. Os ensaios de estabilidade da emulsão mostraram que os biosurfactantes produzidos pelas três cepas microbianas apresentaram grande estabilidade em condições diversas e ambientais. Os índices de emulsão não apresentaram nenhuma alteração significativa quando a temperatura de incubação, o pH e a concentração de sal do caldo livre de células foram alterados.A caracterização do DLC do biosurfactante extraído mostrou que os biosurfactantes produzidos pelas três cepas eram glicóliptos. A identificação química dos biosurfactantes mostrou que rodococcus e lisinbacillus produziram o mesmo biosurfactante, que foi identificado como rhamnolipid, com uma massa de cerca de quatro 80 daltons. Paenibaccilus, por outro lado, produz um rhamnolipid contendo três cadeias lipídicas com uma massa de cerca de 802 daltons.A combinação de biosurfactantes foi capaz de recuperar 56,5% do óleo residual da coluna de areia. A produção biosurfactante das cepas de rodococcus, iinibaccilus e paenibacillus foi avaliada, e as cepas foram positivas para a produção de biosurfactante. Os biosurfactantes produzidos foram caracterizados e identificados como rhamnolipids.Como a combinação biosurfactante foi bem sucedida na recuperação de 56% do óleo residual em uma técnica de embalagem de areia, a combinação biosurfactante pode ser usada em aplicações de campo para recuperar o óleo residual preso dentro dos reservatórios de petróleo.

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Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Fonte: Villela, H. D. M. , et al. Prospectação de Cepas Microbianas para Biorremediação e Desenvolvimento de Probióticos para Pesquisa e Preservação de Metaorganismos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o isolamento seletivo de bactérias marinhas degradadoras do petróleo ao enriquecer amostras de água do mar em meios à base de petróleo, possibilitando a recuperação de cepas puras com potencial de aplicações na biorremediação de petróleo bruto e limpeza ambiental.

Enriquecimento seletivo e isolamento de bactérias marinhas degradadoras de óleo a partir de amostras de água do mar

Apresentado é o protocolo para biocatalisadores de célula inteira co-imobilização para a regeneração de cofactor e melhorada a capacidade de reutilização, utilizando a produção de L-xilulose como um exemplo. A regeneração cofator é conseguido acoplando duas estirpes de Escherichia coli que expressam enzimas funcionalmente complementares; a imobilização de células inteiras biocatalisador é conseguido por encapsulação de células em esferas de alginato de cálcio.

Imobilização de Multi-biocatalisadores em alginato Beads para Cofator Regeneração e melhorada Reutilização

O objetivo deste procedimento é rapidamente e facilmente produzir um dispositivo microfluidic com geometria personalizável e resistência ao inchaço por fluidos orgânicos para estudos de recuperação de óleo. Um molde de polidimetilsiloxano é gerado pela primeira vez e então usado para converter o dispositivo baseado em epóxi. Um estudo representativo do deslocamento é relatado.

Dispositivos microfluídicos para caracterizar processos de evento Pore-escala em meios porosos para aplicações de recuperação de óleo

A poluição afeta todos os biomas. Os ambientes marinhos têm sido particularmente impactados, especialmente os recifes de corais, um dos ecossistemas mais sensíveis da Terra. A bioremediação é a capacidade dos organismos para degradar contaminantes. Aqui, descrevemos metodologias para isolar e testar micróbios que apresentam capacidade de bioremediação e potenciais características probióticas para corais.

Prospecção de cepas microbianas para desenvolvimento de bioremediação e probióticos para pesquisa e preservação de metaorganismos

Apresentamos um protocolo para estudar a formação de hidratos na presença de surfactantes nonionicos na interface de uma gotícula de água submersa em ciclopentano. O protocolo consiste na construção de um regulador de temperatura de baixo custo, programável. O sistema de controle de temperatura é combinado com técnicas de visualização e aferição de pressão interna.

Estudando efeitos surfactantes na cristalização do hidrato em interfaces óleo-água usando um dispositivo modular modular integrado de baixo custo

Aqui, apresentamos um protocolo de triagem da biodiversidade do solo para procurar cepas fúngicas envolvidas na degradação de materiais recalcitrantes. Primeiro, as cepas fúngicas capazes de crescer em ácidos húlicos ou lignocelulose são isoladas. Sua atividade é então testada tanto em ensaios enzimáticos quanto em poluentes como hidrocarbonetos e plásticos.

Isolamento e Triagem da Biodiversidade do Solo para Fungos Envolvidos na Degradação de Materiais Recalcitrantes

Os óleos usados para aplicações de administração de medicamentos podem perturbar o perfil lipídico dos pacientes, o que é indesejável em doenças cardiovasculares. Os óleos ricos em ácidos graxos ômega-3 são uma alternativa saudável aos óleos convencionais e têm um enorme potencial para sistemas de administração de medicamentos autoemulsionados.

Auto-nanoemulsificação de óleos saudáveis para aumentar a solubilidade de drogas lipofílicas

Um método seguro de transesterificação assistida por ultrassom para óleos vegetais usando um catalisador alcalino é apresentado aqui. O método é rápido e eficiente para preparar produtos de biodiesel puro.

Preparação assistida por ultrassom de produtos de biodiesel a partir de óleos vegetais

Este estudo apresenta a metodologia para a geração de seis tipos diferentes de descargas de plasma dentro de um Reator de Plasma de Vórtice Hiperbólico para a degradação de micropoluentes na água, incluindo produtos farmacêuticos e substâncias per e polifluoroalquil (PFAS).

Implementação de um Reator de Plasma de Vórtice Hiperbólico para a Remoção de Micropoluentes na Água

O objetivo geral deste estudo foi demonstrar o mecanismo de contaminação cruzada potencial de patógenos de origem alimentar Listeria monocytogenes em um ambiente deli varejo. Esta metodologia pode ser aplicada a uma variedade de ambientes diferentes para controlar a contaminação do patógeno.

Rastreamento contaminação microbiana em ambientes de varejo com fontes fluorescentes Powder - Um ambiente de exemplo Retail Delicatessen

Aprenda métodos de triagem e caracterização de biosurfactantes produzidos por Rhodococcus, Lysinibacillus e Paenibacillus para recuperação aprimorada de óleo residual. Esta técnica sustentável oferece vantagens ambientais significativas.

Recuperação aprimorada do óleo usando uma combinação de biosurfactantes

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