Análise simplificada e de alto rendimento da contractilidade unicelular usando Elastômeros Micropatterned

Forças mecânicas geradas por células são essenciais para o bom funcionamento em vários órgãos em todo o corpo. Mais a bexiga do intestino, coração e outros. Esses órgãos devem gerar padrões estáveis de contração celular e relaxamento, para manter o estado hemostático interno.

A contração anormal das células musculares lisas pode levar ao aparecimento de vários distúrbios, incluindo a dismotilidade intestinal caracteriza padrões anormais do intestino com contração muscular, bem como condições como bexiga hiperativa ou subativa. E nas vias aéreas, algumas células musculares que contraem padrões irregulares podem desencadear hiper responsividade asmática. Claramente, mecanismos contratuais dentro de células e tecidos podem levar a doenças que requerem opções de tratamento.

E como essas condições podem decorrer diretamente de comportamentos disfuncionais contratuais das células, torna-se lógico e necessário medir a própria função contratil celular, ao selecionar potenciais candidatos a medicamentos. Após os recentes avanços na micro tecnologia, desenvolvemos um ensaio baseado em micro placas que permite medições quantitativas de contração de célula única. Em centenas de milhares de células chamadas flex, também conhecidas como superfícies elastoméricas hipotéticas.

Nesta abordagem, incorporamos micro padrões de proteína fluorescente, e assim filmes suaves, que se deformam e encolhem quando as células aplicam forças de tração a eles. É importante ressaltar que os micro padrões proteicos restringem a posição celular, forma e área de propagação. As condições uniformes de teste e permitem medidas simples baseadas apenas em suas mudanças dimensionais.

No geral, a plataforma, que inclui um módulo de análise de imagem baseado em navegador, permite a análise direta da força celular contraditória sem exigir procedimentos delicados de manuseio ou registro de marcadores fiduciários e pode ser operada por qualquer pesquisador com as culturas celulares básicas e microscópio fluorescente simples com baixa ampliação. Esta tecnologia deve ser projetada com o usuário final em mente, e visa reduzir a barreira à entrada para qualquer cientista de laboratório para estudar biologia da força celular Comece adicionando 20 mililitros de mídia em um tubo crônico, obtenha uma placa de 24 poços projetada para avaliar a contralução celular. Coloque sua pipeta em 500 microliters e obtenha um coador celular para patógeno celular.

Retire a tampa da placa de 24 poços, segure a placa assim e, em seguida, retire suavemente a camada de plástico em cima da placa. Coloque cuidadosamente a placa de volta para baixo. Aspire apenas a camada superior PBS de cada poço para evitar qualquer derramamento.

Agora, uma linha de cada vez, remova o PBS restante do poço e preencha rapidamente com 500 microliters de mídia celular. Agite a placa suavemente e toque de lado para garantir que toda a parte inferior do poço esteja coberta com solução. Uma vez que todos os Poços tenham sido preenchidos com mídia, coloque a placa para o lado.

Neste ponto, recupere sua cultura celular da incubadora. Vamos conduzir um protocolo de associação sólido. O objetivo deste protocolo é criar uma suspensão de 50.000 células por mililitro.

Antes de semear as células certifique-se de esticar suas células uma vez através do coador, a fim de quebrar aglomerados de células em células únicas, coloque cuidadosamente 500 microliters de sua solução celular em cada poço. Após a semeadura celular, é importante deixar as placas sentadas por uma hora para que as células possam se fixar diretamente nos padrões. Depois de uma hora, coloque a placa em uma incubadora durante a noite.

A segunda parte do experimento consiste em adicionar as drogas à placa de 24 poços e imagens fluorescentes da placa. Para esta parte do protocolo temos dois requisitos importantes para garantir a viabilidade e a resposta robustas das células. A primeira é que a concentração final de DMSO nos poços com células não é mais do que 1%, o que significa que precisamos fazer uma diluição total de 100 de nossos estoques de drogas.

A segunda é que não podemos adicionar DMSO tão diretamente aos poços porque ele vai cair na parte inferior dessa mistura, e depois prejudicar as células com uma concentração de alto nível. Em vez disso, devemos criar uma solução intermediária de droga e mídia DMS0, que possamos nos misturar completamente para evitar alta exposição local ao DSSO às células. Neste protocolo, faremos uma diluição de seis etapas oito vezes que abrange uma faixa de 40 micromolar até um nano molar Criar a série de diluição de seis passos oito vezes, transferindo 30 microliters de solução de medicamentos de estoque para volumes 210 microliteres consecutivos de DMSO e misturando-se completamente entre cada etapa de transferência Em nosso experimento, estaremos avaliando o efeito do blebbistatin.

em bexigas humanas através das células musculares. Para atender aos dois requisitos, primeiro criaremos um DMSO intermediário e uma solução de mídia. Isso rende uma diluição de 16,7 vezes de DMSO.

Então adicionaremos esta solução de drogas intermediárias às nossas células, utilizando proporções que produzem uma diluição adicional de seis vezes, resultando em um total de 100 diluição total e a concentração final de 1%DMSO Para conseguir isso, para cada solução de droga de estoque, misture 30 microlitres de droga em 470 microliters de meio de cultura celular, em seguida, transfira 200 microliters desta solução intermediária para o poço apropriado na placa de 24 poços, que contém 1000 microliters em cada poço. Isso rende coletivamente uma concentração final de 1% de Incubação DMSO pelo tempo adequado. Em nosso experimento, incubamos por 30 minutos, quando você estiver pronto para a imagem adicionar uma mancha nuclear ao vivo em todos os seus Poços adicionar uma diluição de 10.000 do estoque.

Deixe incubar por mais 15 minutos. Quando estiver pronto para a imagem, você precisará de um microscópio fluorescente que esteja equipado para visualizar os canais fluorescentes tanto para os núcleos celulares rotulados quanto para o corante fluorescente. Os micro padrões são rotulados com os quais, em nosso exemplo, é o canal tri C.

Agora, seremos núcleos fluorescentes de blebbistatina de imagem para identificar células únicas, certifique-se de visualizar os núcleos de células manchas na mesma posição que você vê o micro padrão para que eles possam ser alinhados durante a análise. Faça upload das imagens adquiridas para o computador para garantir que as imagens sejam rotuladas corretamente, de forma que os canais de padrão terminem em sublinhar o PT. E as imagens no canal nuclear terminam em sublinhar dapi. Agora, estaremos convertendo as imagens tif em imagens PNG, usando imagem J Uma vez que a imagem J esteja aberta, carregue em um canal de cada vez.

Primeiro estaremos carregando o canal de padrão e ajustando o contraste, a fim de maximizar o sinal, e minimizar o plano de fundo. Além disso, estaremos suavizando a imagem. Uma vez que a imagem tenha sido modificada ao nosso gosto, então mudaremos o tipo de imagem para oito bits.

Em seguida, exporte a imagem como um tipo PNG. Em seguida, verifique a caixa, use rótulos de fatias como nomes de arquivos. Crie uma nova pasta chamada PNGs.

Em seguida, salve os arquivos PNG lá, para analisar as imagens, navegue até Biodock dot AI, crie uma conta e entre em contato com os autores para obter acesso livre ao módulo de análise. Faça login assim que sua conta tiver sido criada. Aqui você poderá carregar novas imagens.

Chamaremos este novo lote, dados de experimentos da Web JoVE. Agora, podemos importar as imagens arrastando-as e, em seguida, soltando-as, pressione OK.At este ponto, selecione seus dados. Em seguida, clique em analisar, role até a análise de contrariedade rotulada pelo módulo e clique em selecionar.

Defina a ampliação para o mesmo valor que você usou para imagem Uma vez que os dados estão concluídos, clique nele, então podemos selecionar dados de download. Uma vez que os dados são baixados, podemos então ver pares de imagens sobrepostas para cada imagem inserida. Também temos acesso a uma estatística sumária que nos dará a contração média para cada conjunto de células.

A unidade de medida para contração está em pixels. Olhando para os dados podemos ver aqui que nos poços tratados apenas com DMSO, houve uma contração muito maior das células em comparação com as células que foram tratadas com blebbistatina. Também temos acesso a dados para cada padrão, que foi detectado em qualquer uma das imagens.

Isso nos dá informações detalhadas sobre a localização da imagem, a origem da imagem, o tipo de posição, o número de células, zero um ou mais de um, o tamanho do micro padrão e a contração calculada das células. Esta leiga consiste em cada padrão identificado dentro da micro placa. Os padrões de células únicas desta lista foram médios para calcular a contração média da imagem PNG no outro arquivo.

Você pode classificar e analisar os dados de células únicas conforme necessário para o seu experimento. Para esta parte do vídeo, estaremos exibindo dados representativos que são colecionáveis de uma placa de 24 poços mostrando esses dados de resposta de células musculares lisas da bexiga tratadas com duas drogas diferentes. Estas são imagens de poços tratados com DMSO e blebbistatin, respectivamente.

Aqui, podemos ver que as células tratadas apenas com DMSO, apresentam um grande número de micro padrões contratuais, mas as células tratadas com blebbistatina eram maiores e abertas a notar que há menos contração. Os dados deste histograma mostram a variação da contratude celular como resultado dos diferentes tratamentos para as células. O centro de distribuição de células tratadas com blebbistatina é inferior ao centro de distribuição de células que foram tratadas com o DMSO.

Isso é consistente com as informações exibidas nas imagens anteriores. Porque as células que foram tratadas com blebbistatina apresentaram contração muito menor. Isso denota que o tratamento com blebbistatina relaxa significativamente as células.

Cada um desses conjuntos de dados contribui para um ponto na curva de resposta da dose que é colecionável de uma única placa de 24 poços, seguindo os protocolos mostrados no vídeo. Aqui, podemos ver que a citochalasina D é mais potente do que o blebbistan, como mostrado pelos valores mais baixos de contração, dadas as maiores concentrações de droga. Se você deseja dimensionar significativamente seus experimentos, uma versão de placa de 384 poços está disponível, e isso pode ser usado com automação para dimensionar drasticamente os experimentos.

Estes dados são colecionáveis de uma placa de poço 384, em vez de ter seis passos de diluição para cada droga na placa de 24 poços, o 384 bem-placa nos permite conduzir 20 passos de diluição para cada droga com múltiplas réplicas. A tecnologia flocos de neve é única. Permite a visualização da contração unicelular usando microscopia, o que tem sido impossível até agora.

Assim, a tecnologia se baseia na forma de métricas que é padronizada com proteína fluorescentemente rotulada. Padrão sistemático é formar-se para contração celular e permite medir precisamente a modulação de um contrato de fenótipo por qualquer droga. É claro que essa tecnologia ainda está sendo desenvolvida ativamente para aplicações e muitas áreas diferentes da doença, como asma, doenças cardiovasculares, oncologia imunológica inflamatória e, claro, qualquer uma de nossas indicações de doença onde a contração celular anormal desempenha um papel fundamental na progressão da doença.

Como demonstramos esta tecnologia baseada em micro padronização para medir a contrariedade celular oferece uma alternativa simplificada à microscopia tradicional de força de tração, fornecendo análise intuitiva, observando o padrão encolher e fornecendo resolução de células únicas em populações de grandes células. Algumas considerações, este método pode representar desafios para o uso de células que são muito pequenas, como células T e neutrófilos, ou tipos de células que não aderem. Além disso, células que se ligam semanalmente, se ligam predominantemente ou que não se espalham completamente, não produzirão sinais contratuais mensuráveis.

Os usuários da tecnologia devem avaliar cuidadosamente diferentes formulações médias de cultura celular possíveis para seu tipo de célula particular. como diferentes componentes, fatores de crescimento, níveis de soro e sensibilidades ao pH podem impulsionar comportamentos variáveis. A otimização dos protocolos deve prosseguir com o dimensionamento de quaisquer fluxos de trabalho experimentais.

Em última análise, se a resolução de célula única não for necessária, ou se o tipo de célula alvo tiver capacidade mínima de difusão, então métodos tradicionais de microscopia de força de atração podem ser empregados para tais experimentos. Caso contrário, esperamos que esta ferramenta forneça um caminho adicional para os biólogos celulares estudarem a contração celular e realizarem seus estudos.