Name: Produção em massa de Fungos Entomopatômicos, Metarhizium robertsii e Metarhizium pinghaense, para Aplicação Comercial Contra Pragas de Insetos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T13:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprenda a produção em massa de conídios infectivos de Metarhizium robertsii e Metarhizium pinghaense para controle biológico de pragas agrícolas. O método utiliza arroz como substrato ideal e culturas de blastosporos para reduzir contaminação.

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Os autores gostariam de agradecer hort Pome, Hort Stone, e o Programa de Tecnologia e Recursos Humanos para a Indústria (THRIP: TP14062571871) pelo financiamento do projeto.
ORCID: Mathulwe http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
Antoinette Http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
Nomakholwa F. Stokwe http://orcid.org/0000-0003-2869-5652

1. Fonte de cepas fúngicas
<ol><li>Use cepas fúngicas isoladas sul-africanas tanto do M. pinghaense 5 HEID (número de adesão do GenBank: MT367414/MT895630) e M. robertsii 6EIKEN (MT378171/MT380849), coletados de pomares de maçã na província do Cabo Ocidental, África do Sul.</li>
	<li>Culturas de cultivo de cada EPF isolam em 60 g de sabouraud dextrose agar medium, suplementado com 1 g de extrato de levedura (SDAY) e 10 μL de Estreptomicina. NOTA: Incubar culturas EPF a uma temperatura controlada de ± 25 °C no escuro.</li>
</ol>2. Metarhizium pinghaense  e M. robertsii inoculação de suspensão conidial
<ol><li>Preparação dos substratos sólidos<ol>
<li>Utilize dois produtos agrícolas, a aveia em flocos e cevada flocada, como meios de crescimento para os dois isolados EPF e sacos autoclave (305 mm × 660 mm) como sacos de fermentação.</li>
		<li>Use um pequeno tubo de resíduos de polivinilcloro (1000 mm × 50 mm) para criar um pescoço para o saco de fermentação na extremidade aberta do saco de autoclave e use fita autoclave para fixar o tubo no saco.</li>
		<li>Feche o tubo com um plugue de algodão estéril para permitir a troca de gás suficiente durante a fermentação.</li>
		<li>Pesar grãos secos (200 g) tanto da aveia flocada quanto da cevada flocada e colocá-los nos sacos de fermentação, e a cada saco, adicione 100 mL de água destilada e misture completamente o conteúdo dos sacos.</li>
		<li>Deixe os grãos molhados descansarem por 15-30 min para absorver umidade antes de autoclavar e esterilizar. Prepare seis sacos para cada tipo de grão e, para evitar contaminação, coloque os sacos em outros sacos de autoclave e autoclave os substratos a 121 °C por 55 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de inóculo de suspensão conidial<ol>
<li>Colher conidia fúngica de 2-3 semanas de idade de culturas fúngicas tanto de M. pinghaense quanto M. robertsii raspando, usando uma lâmina cirúrgica estéril.</li>
		<li>Suspenda a conidia fúngica coletada em 20 mL de água destilada estéril, suplementada com 0,05% Tween 20, e misture as suspensões conidiais por 2 minutos.</li>
		<li>Prepare 20 mL de suspensões conidiais, com uma concentração de 1 × 107 conidia/mL, e inocula as substratas sólidas de aveia e cevada flocadas, respectivamente. NOTA: Use um hemócito para determinar concentrações conidiais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculação dos substratos sólidos<ol>
<li>Abra cada saco removendo os plugues de algodão e adicione a suspensão conidial preparada de 20 mL ao substrato autoclaved refrigerado.</li>
		<li>Feche os sacos novamente, usando os tampões do pescoço, e massageie o conteúdo do saco para permitir que o inóculo fúngico fique uniformemente misturado com o substrato de grãos.</li>
		<li>Incubar os sacos de fermentação a uma temperatura controlada de ± 25 °C, e garantir uma troca gasosa suficiente entre a cultura e o meio ambiente. NOTA: Este procedimento deve ser conduzido sob um gabinete de fluxo laminar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fase de fermentação<ol>
<li>Massageie manualmente os substratos de grãos nos sacos de fermentação 2 dias após a inoculação e incubação, quando ocorre crescimento micelial visível e o substrato começou a ser agrupado pelo fungo em crescimento. NOTA: Isso é feito para misturar os grânulos inoculados para permitir que a ramificação micelial ocorra durante os primeiros estágios iniciais do crescimento vegetativo dos fungos.</li>
		<li>Use um rolo de cozinha para manipular a cama do substrato para evitar a heterogeneidade física dos leitos de substrato de grãos e a espessura do leito da massa do substrato. NOTA: O processo promove o metabolismo fúngico, que otimiza a produção de esporos fúngicos, e maximiza a área da superfície, promovendo o rendimento conidial18.</li>
		<li>Deixe o processo de fermentação para continuar por até 4-5 semanas, e verifique os sacos de fermentação a cada 2 dias para a presença de qualquer crescimento vegetaldo branco que possa se desenvolver durante o processo de fermentação, o que pode afetar muito o rendimento da conidia fúngica. NOTA: Termine imediatamente a fermentação nos sacos de fermentação contendo qualquer crescimento vegetaldo branco e seque as culturas fúngicas18.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Inoculação de blastospore
<ol><li>Produção e inoculação de blastospore<ol>
<li>Prepare um meio de cultura líquida, contendo 1 L de água destilada, 30 g de glicose, 20 g de extrato de levedura, 4 g de fosfato de potássio diabasic (K2HPO4), 15 mL de licor íngreme de milho, e 10 μg/mL do antibiótico Streptomicina, tanto para o M. pinghaense quanto para o M robertsii.</li>
		<li>Primeiro, aqueça a água destilada, desligue antes de chegar ao ponto de ebulição, e adicione cada um dos ingredientes, exceto a estreptomicina, à água quente na panela. Leve o meio para ferver suavemente por 3-4 min, e mexa constantemente o meio para permitir a mistura adequada dos ingredientes e evitar a fixação de alguns dos ingredientes na parte inferior da panela.</li>
		<li>Despeje um total de 100 mL do meio em nove frascos diferentes de 250 mL e coloque um plugue de algodão em cada frasco, e cubra a lã de algodão com papel alumínio como rolha (Figura 1A).</li>
		<li>Autoclave o meio nos frascos por 55 min a 121 °C. Após a autoclavação, deixe o meio nos frascos esfriar e adicione 10 mg/mL de estreptomicina ao meio em cada frasco (Figura 1B).</li>
		<li>Colete de duas a três alças bacterianas de conidia fúngica de placas de cultura fúngica de 2-3 semanas de idade para os isolados EPF, M. pinghaense e M. robertsii, e transfira para cada mídia líquida de 100 mL nos frascos de 250 mL, em condições estéreis, e selar os frascos.</li>
		<li>Incubar os frascos de cultura líquida a ± 25 °C, em um agitador orbital a 140 rpm por 3 dias, e cessar a incubação uma vez que as culturas mostram sinais de alta turbidez com o crescimento de blastospore fúngico (Figura 1C).</li>
		<li>Para detectar qualquer possível contaminação bacteriana das culturas, retire uma amostra de 100 μL de cada frasco de cultura líquida após 24 horas durante a incubação e placa em três placas SDA por isolante. Incubar as placas por 48 h, a uma temperatura controlada de ± 25 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do substrato sólido<ol>
<li>Use arroz branco de grão longo parboiled como um meio de substrato sólido para os blastospores tanto de M. pinghaense quanto de M. robertsii (adaptado de Jaronski e Jackson18).</li>
		<li>Prepare os sacos de fermentação conforme detalhado acima, nas etapas 2.1.1-2.1.3, e para cada saco, adicione 1 kg de arroz e 300 mL de água destilada estéril.</li>
		<li>Misture suavemente o conteúdo dos sacos de fermentação e coloque em sacos de autoclave externos em uma posição vertical e autoclave a 121 °C por 55 min. Após a autoclavagem, permita que os substratos esfriem por ± 45 min em condições estéreis.</li>
	</ol></li>
	<li>Inoculação e fermentação<ol>
<li>Remova o fechamento de cada um dos frascos de cultura líquida tanto de M. pinghaense quanto M. robertsii sob um fluxo laminar e flame a borda de cada frasco por 10 s.</li>
		<li>Despeje as culturas líquidas de 100 mL nos sacos de fermentação removendo os plugues de algodão de seus pescoços (Figura 2). Coloque os plugues de algodão de volta e cubra a parte superior do pescoço do saco com papel cirúrgico preso com um elástico. NOTA: Determine a concentração de blastospore para cada frasco usando um hemócito, e use concentrações de blastospore de 1 × 107 - 5 × 108 blastospores/mL para innocular os substratos28.</li>
		<li>Torça a parte superior da bolsa e misture o conteúdo do saco tremendo e a manipulação leve do substrato por massagem, e incubar os sacos a ± 25 °C, achatando o substrato nos sacos para evitar a formação de camas grossas18.</li>
		<li>Quebre o substrato nos sacos de fermentação massageando o conteúdo das sacolas, 2-3 dias após a inoculação e a incubação, quando ocorreu o crescimento micelial visível e a ligação do substrato pelo fungo (adaptado da técnica de Jaronski e Jackson18). NOTA: Permitir que a fermentação continue por 4 semanas.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63246/63246fig01.jpg"> Figura 1: Cultura líquida em frascos de 250 mL. (A) Antes de autoclavar. (B) Após autoclavação e inoculação com esporos EPF. (C) Meio turva com blastospores fúngicos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63246/63246fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63246/63246fig02.jpg"> Figura 2: Meio de cultura líquida blastospore preparado. (A) Metarhizium robertsii e (B) Metarhizium pinghaense antes da inoculação do arroz como um substrato sólido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63246/63246fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
4. Secagem de culturas fúngicas
<ol><li>Seque as culturas fúngicas por 10-12 dias após a fermentação, antes de seu uso em ensaios, transferindo as culturas esporuladas em sacos de papel marrom de 26-30 kg (30 x 43 x 15250 cm3).</li>
	<li>Para melhorar a resistência à tração dos sacos de papel, corte horizontalmente um terço da parte superior de cada saco e forra a parte inferior do saco (Figura 3A, B).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63246/63246fig03.jpg"> Figura 3: Preparação de sacos de papel, procedimento de secagem de culturas e embalagem. (A,B) A preparação de sacos de papel marrom. O procedimento de secagem das culturas das espécies de Metarhizium cultivadas em (C,E) arroz parboiled e (D,F) cevada flocada. (G) Sacos de papel fechados com grampos para criar uma estrutura de tenda triangular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63246/63246fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="3"><li>Destrua suavemente o substrato em cada saco de fermentação, corte o canto de cada saco e transfira toda a cultura para os sacos de papel através do espaço deixado pelo canto de corte (Figura 3C-F). Para evitar a fuga excessiva de esporos fúngicos para o ar, realize este processo lentamente. NOTA: Conduza este processo em condições estéreis, utilizando fluxo laminar, para evitar contaminação.</li>
	<li>Rotule cada saco de papel e dobre sobre a extremidade superior de cada saco duas vezes e feche com grampos para criar uma estrutura de tenda triangular, e coloque os sacos em racks de secagem de arame para permitir a secagem adequada, mesmo secagem, a uma temperatura controlada de ± 25 °C e baixa umidade de 30-40%.</li>
	<li>Gire os sacos diariamente para permitir a secagem das culturas e evitar qualquer recrescimento vegetativo que possa ocorrer, o que diminuiria o rendimento dos esporos fúngicos colhiáveis.</li>
	<li>Pesar cada saco de secagem após cada 2 dias durante o processo de secagem, e continuar o processo de secagem de cada saco até que pouca ou nenhuma mudança seja observada na massa dos sacos entre os dias sucessivos.</li>
</ol>5. Colheita de conidia fúngica
<ol><li>Colher conidia fúngica mecanicamente das culturas usando três peneiras aninhadas, uma peneira de teste (ETS) tela nº 35 (com abertura de 500-μm), aninhada em uma peneira de teste (com abertura de 212-μm), aninhada na malha ETS nº 100 (com abertura de 150-μm), montada em uma panela de coleta.</li>
	<li>Carregue a amostra de cultura seca na peneira ETS nº 35 lentamente e coloque uma tampa na peneira para evitar a liberação de conídio fúngico no ar.</li>
	<li>Adicione 10-12 bolinhas de vidro nas peneiras para auxiliar a passagem da conídia fúngica através das telas de malha e evitar a retenção da conidia na peneira, o que pode resultar em redução da recuperação dos esporos.</li>
	<li>Fita e veda as juntas de peneira usando fita elétrica para evitar a fuga de pó conidial.</li>
	<li>Coloque as peneiras em um agitador vibratório, equipado com uma almofada pegajosa, para fixar a panela de coleta e peneiras, por 20-25 min, a um movimento de 560-640 vibrações por minuto (Figura 4). NOTA: Técnica adaptada de Jaronski e Jackson18.</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63246/63246fig04.jpg"> Figura 4: Colheita de esporos fúngicos das culturas secas de Metarhizium robertsii no arroz e cevada em flocos. (A) 10-12 mármores de vidro adicionados às peneiras para auxiliar a passagem da conidia fúngica através das telas de malha. M. robertsii conidia colhido de culturas em (B) arroz, e (C) flocou mal. (D) Peneira em um agitador vibratório. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63246/63246fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="6"><li>Remova as peneiras de teste da panela de coleta, colete conidia e armazene as conidia coletadas em sacos de zíper herméticos e impermeáveis para armazenamento a longo prazo (3-6 meses).</li>
</ol>6. Quantificação da conidia fúngica produzida
<ol><li>Meça e regise a massa de cada substrato de grãos antes da colheita da conídia fúngica de cada substrato.</li>
	<li>Meça o peso total da conidia coletada subtraindo a massa dos esporos coletados da massa do substrato sólido. NOTA: O rendimento total da conídia envolve não apenas a conídia colhida, mas também a conídia fúngica deixada no substrato sólido.</li>
	<li>Pese o substrato e remova 10 g do substrato pesado. Suspenda os 10 g do substrato em 0,05% Tween 20 e dilua em 10 mL de água destilada estéril.</li>
	<li>Misture a suspensão por 2 minutos e use um hemócito para fazer a contagem de esporos para determinar o número de conídios lavados do substrato.</li>
	<li>Realizar novas diluições transferindo 1000 μL da suspensão conidial lavada de 10 mL para 9 mL de água destilada estéril para compor 10 mL de suspensões de diluição.</li>
	<li>Misture as suspensões conidiais por 2 minutos e determine as concentrações conidiais. NOTA: Siga o procedimento e a fórmula descritos por Inglis, Enkerli e Goettel30 para determinar a concentração conidial das suspensões.</li>
	<li>Recolher e suspender um total de 0,1 g do pó conidial coletado de cada cultura em 10 mL de água destilada estéril suplementada com 0,05% Tween 20, e vórtice-mistura a suspensão conidial por 2 min, e determinar a concentração conidial usando um hemocitômetro.</li>
	<li>Realizar novas diluições transferindo 1000 μL da suspensão conidial de 10 mL para 9 mL de água destilada estéril para compor as diluições de suspensão de 10 mL.</li>
	<li>Misture as suspensões conidiais por 2 minutos, calcule as concentrações conidiais e determine o número de conidia por grama.</li>
	<li>Multiplique o número de conidia por grama de pó colhido pela massa inicial do pó conidial colhido. Multiplique o número de conidia lavada do substrato pelo peso total do substrato gasto, sendo o substrato do qual as conidias foram colhidas.</li>
	<li>Adicione os dois valores dados juntos e divida pelo peso seco inicial do substrato para calcular o número de conidia por kg ou g do substrato18. NOTA: Os cálculos foram feitos principalmente para o substrato de arroz. O teste de germinação ou viabilidade conidial foi realizado tanto para os isolados M. pinghaense quanto para o M. robertsii para determinar a viabilidade da conidia produzida.</li>
</ol>7. Análise de dados
<ol><li>Use um programa de software de computador adequado para realizar a análise estatística dos resultados obtidos. NOTA: A análise estatística dos dados foi feita utilizando-se a versão STATISTICA 13.5.0.17.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A integração bem-sucedida dos agentes microbianos para o controle biológico de importantes pragas de insetos agrícolas em um agroecossistema depende tanto do sucesso quanto da facilidade de produção em massa dos entomopatógenos como o primeiro passo em condições laboratoriais. A produção em massa de EPF é importante para a aplicação em larga escala e disponibilidade de produtos EPF para programas de IPM utilizando controle biológico 9,10,11,12,13.<sup ...

Os fungos entomopatômicos (EPF) ganharam importância como agentes de proteção de culturas no controle biológico de importantes pragas de insetos agrícolas 1,2. Os entomopatógenos, que ocorrem naturalmente no solo, causam epizooóticos nas populações de várias espécies de pragas3. As espécies de EPF são específicas do hospedeiro e representam relativamente poucos riscos em termos de ataque a espécies não-alvo, e não sãotóxiis para o meio ambiente4. A EPF tem um mecanismo único para invadir seu hospedeiro, bem como para propagar e persistir em seu ambiente imediato1. Eles atacam o hospedeiro principalmente através de esporos assexuados que se prendem e penetram na cutícula hospedeira para invadir e proliferar no hemocoel hospedeiro. O hospedeiro eventualmente morre devido ao esgotamento dos nutrientes hemofífonos ou como resultado da toxemia causada pelos metabólitos tóxicos liberados pelo fungo. Após a morte, sob condições ambientais ideais, o fungo emerge na superfície externa (micose exerce) do cadáverhospedeiro 5,6.
Preocupações crescentes com os efeitos negativos dos resíduos químicos na saúde humana, poluição ambiental e desenvolvimento da resistência a pragas levaram ao impulso global de reduzir os insumos de inseticidas de base química e a encontrar estratégias alternativas, novas e sustentáveis para a proteção das culturas e o controle de pragas 6,7,8 . Isso proporcionou oportunidades para desenvolver inseticidas à base de microbianos para uso em programas integrados de Manejo de Pragas (IPM), que são estratégias mais ecologicamente favoráveis do que o controle químico convencional 3,8.
Para desenvolver um agente de controle microbiano bem sucedido para uma praga agrícola, um organismo adequado deve primeiro ser isolado, caracterizado, identificado e sua patogenicidade para a praga alvo confirmada. No entanto, é necessário um método fácil e econômico para a produção em larga escala do agente microbiano para produzir um produto viável para uso em programas de controle biológico 9,10,11,12,13. A produção em massa de quantidades substanciais de entomopatógenos de boa qualidade depende da cepa microbiana, do meio ambiente, da praga-alvo, da formulação, do mercado, da estratégia de aplicação e do produto final desejado 14,15,16. O EPF pode ser produzido em massa usando fermentação de substrato líquido para produzir blastospores ou o processo de fermentação de substrato sólido para produzir conídio aéreo 6,17,18. No entanto, o processo de produção e formulação em massa de entomopatógenos influencia diretamente a virulência, o custo, a vida útil e a eficácia do campo do produto final. Para o uso bem-sucedido no IPM, o processo de produção dos entomopatógenos deve ser fácil de executar, exigir mão-de-obra mínima, produzir uma concentração de alto rendimento de propagules virulentas, viáveis e persistentes, e ser baixo no custo 4,13,14,16.
Compreender os requisitos nutricionais dos entomopatógenos é importante para o cultivo em massa com todos os métodos de cultivo 4,12. Os componentes nutricionais do meio de produção têm impacto significativo nos atributos dos propagules resultantes, incluindo eficácia de biocontrole, rendimento, tolerância à dessecação e persistência 8,19,20,21. A otimização dos procedimentos de produção é projetada para abordar tais fatores22. Para a EPF, os principais requisitos para o bom crescimento, esporulação e produção em massa de conídio fúngico são umidade adequada, temperatura de crescimento ideal, pH, troca de gás de CO2 e O2, e nutrição, incluindo boas fontes de fósforo, carboidratos, carbono e nitrogênio18.
Jaronski e Jackson18 descrevem o método de fermentação de substrato sólido como o método de aproximação mais eficiente e mais próximo do processo natural de produção de EPF em relação ao método de fermentação do substrato líquido porque, em condições naturais, o conidium fúngico é suportado em estruturas eretos sólidas, como a superfície dos cadáveres de insetos. Produtos agrícolas e subprodutos contendo amido são usados principalmente para a produção em massa de fungos hipocrealeanos, pois os fungos prontamente se decompõem o amido através da secreção de enzimas hidrolíticas altamente concentradas de suas pontas hífas, para penetrar a substância sólida e para acessar os nutrientes presentes na substância 11,17,18,23 . Os produtos de grãos também fornecem os requisitos para a produção saudável de biomassa, pois, quando são hidratados e esterilizados, os substratos podem absorver mais nutrientes de qualquer meio líquido 16,18,24.
Anteriormente, vários estudos tentaram cultivar espécies de EPF como Beauveria bassiana (Bals.) Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas e alguns dos metarhizium anisopliae (Metschn.) O complexo de espécies de Sorokin isola-se em vários substratos 16,23,24. Tais isolados produzidos em massa e comercialmente desenvolvidos incluem o Músculo® Verde (cepa IMI 330189), desenvolvido a partir de M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humber, Metarhizium 69 (Meta 69 strain ICIPE69), e Real Metarhizium 69 (L9281), desenvolvidos a partir de M. anisopliae, e Banda larga® (cepa PPRI 5339) e Eco-Bb®, desenvolvido a partir de B. bassiana25,26 . No entanto, tentativas limitadas foram feitas à cultura de massa Metarhizium robertsii J.F. Bisch., S.A. Rehner & Humber e Metarhizium pinghaense Chen & Guo. Esses dois isolados foram selecionados em estudo anterior como o mais eficaz para o controle do mealybug, Pseudococcus viburni Signoret (Hemiptera: Pseudococcidae)27. Portanto, o presente estudo teve como objetivo formular e produzir em massa um número suficiente de propagules infecciosos resilientes dos isolados locais de M. robertsii e M. pinghaense para aplicação comercial contra pragas de insetos. O método de fermentação de substrato sólido foi utilizado para produzir em massa a conídia fúngica para ambos os isolados de EPF. Dois métodos de inoculação de EPF, utilizando suspensões conidiais e a cultura fúngica líquida de blastospores, foram utilizados para inocular os substratos sólidos.

<table><tbody><tr><td>0,05% Tween 20</td><td>Lasec</td><td></td><td>Adicionado a suspensões de conídios para permitir que os esporos de fungos se misturem com a água</td></tr><tr><td>Garrafas McCartney de 20 mL</td><td>Lasec</td><td></td><td>Usado para fazer suspensões de conídios</td></tr><tr><td>Folha</td><td></td><td></td><td>de alumínio Usado como cobertura dos plugues de algodão em frasco de 250 mL</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td></td><td></td><td>Usado para esterilizar materiais e ingredientes usados para a produção de conídios Sacos de</td></tr><tr><td>autoclave</td><td>de processo Lasec</td><td></td><td>Sacos de fermentação ou recipientes de substrato sólido</td></tr><tr><td>Fita de autoclave</td><td>Lasec</td><td></td><td>Para fixar tubos de PVC nos sacos de fermentação</td></tr><tr><td>Sacos</td><td></td><td></td> de papel Kraft marrom <td>Usado para secar culturas de conídios em grãos agrícolas</td></tr><tr><td>Queimador de Bunsen</td><td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td><td></td><td>Usado para inflamar equipamentos (lâminas cirúrgicas, alças de inoculação e bordas de frascos)</td></tr> <tr><td>Peneira</td><td></td><td></td> de teste de borda clara <td>Usado para separar conídios fúngicos de substratos de grãos agrícolas</td></tr><tr><td>Licor de maceração de milho</td><td>SIGMA</td><td>66071-94-1</td><td>Ingrediente do meio líquido blastosporo</td></tr><tr><td>Lasec</td><td></td> de<td>algodão Usado</td><td>como tampão do pescoço para sacos de fermentação</td></tr><tr><td>Laboratório Duran </td><td>garrafas Neolab</td><td></td><td>Usado para autoclave meio SDA e água destilada</td></tr><tr><td>Fita</td><td></td><td></td> isolante <td>Usado para prender e selar as juntas da peneira para evitar a fuga de poeira de conídios</td></tr><tr><td>Peneira</td><td></td><td></td> de teste ENDECOTTS <td>Usado para separar conídios fúngicos de substratos de grãos agrícolas</td></tr><tr><td>Frascos Erlenmeyer, gargalo estreito, frasco de 250 mL</td><td>Lasec</td><td></td><td>Transportador do meio líquido blastosporo</td></tr><tr><td>Etanol (99%)</td><td>Lasec</td><td></td><td>Usado para esterilizar lâminas cirúrgicas e alças de inoculação</td></tr><tr><td>Cevada em flocos</td><td>Health Connection Wholefoods</td><td></td><td>Grão agrícola usado como meio de crescimento de substrato sólido para conídios de M. pinghaense e M. robertsii</td></tr><tr><td>Aveia em flocos</td><td>Marcas</td><td></td> <td>TigerGrão agrícola usado como meio de crescimento de substrato sólido para conídios de M. pinghaense e M. robertsii</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Merck</td><td></td><td>Ingrediente do meio líquido blastosporo</td></tr><tr><td>Câmara de crescimento/incubadoras</td><td></td><td></td><td>Para cultivo de cultura de conídios fúngicos</td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td></td><td></td><td>Usado para determinar as concentrações de conídios</td></tr><tr><td>Alças de inoculação</td><td>Lasec</td><td></td><td>Para a colheita de esporos para inocular o meio líquido para o crescimento de blastosporos</td></tr><tr><td>Rolo</td><td></td><td></td> de cozinha <td>Usado para manipular o leito de substrato de grãos sólidos</td></tr><tr><td>Gabinete de fluxo laminar Gabinete</td><td></td><td>de fluxo laminar ESCO</td><td>Fornecer como ambiente estéril durante a inoculação do substrato</td></tr><tr><td>Metarhizium pinghaense conidia</td><td>Stellenbosch Universidade</td><td>5HEID</td><td>Culturas usadas para cultura em massa de conídios de Metarhizium pinghaense</td></tr><tr><td>Metarhizium robertsii conídios</td><td>Stellenbosch University</td><td>6EIKEN</td><td>Culturas usadas para cultura em massa de conídios de Metarhizium robertsii</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>ZEIZZ (Escopo. A1)</td><td></td><td>Usado para determinar as concentrações de conídios e a viabilidade dos conídios</td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>IncoShake- LABOTEC</td><td></td><td>Usado para o processo de produção de blastosporos</td></tr><tr><td>Arroz parboilizado</td><td>Spekko Grão</td><td></td><td>agrícola usado como meio de crescimento de substrato sólido para conídios de ambos M. pinghaense e M. robertsii</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>SIGMA</td><td></td><td>Adicionado ao meio SDA para evitar a contaminação bacteriana</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Lasec</td><td></td><td>Recipientes para o meio SDA</td></tr><tr><td>Pipetas e pontas de pipeta</td><td>Labnet (BioPette PLUS)</td><td></td><td>Usado para medir ingredientes líquidos</td></tr><tr>Tubo <td></td><td></td> de<td>esgoto de Policloreto de vinila Marley</td><td>Usado para criar um gargalo para o saco de fermentação</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico (K2HPO4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>Ingrediente do meio líquido blastosporo</td></tr><tr><td>Elástico Usado</td><td></td><td></td><td>para fixar o papel cirúrgico sobre o saco de fermentação Gargalos de tubo de PVC</td></tr><tr><td>Ágar Sabaroud dextrose (SDA)</td> <td>NEOGEN Meio de</td><td></td> cultura <td>Meio usado para cultivar esporos de Metarhizium pinghaense e Metarhizium robertsii</td></tr><tr><td>Água destilada</td> <td>estéril</td><td></td><td>Para hidratar grãos agrícolas, para fazer suspensões de conídios</td></tr><tr>Almofada <td></td><td></td><td>pegajosa</td><td>Usado para prender as peneiras no agitador vibratório</td></tr><tr><td>Lâmina cirúrgica</td><td>Lasec</td><td></td><td>Usado para raspar esporos de culturas fúngicas</td></tr><tr><td>Papel cirúrgico</td><td>Lasec</td><td></td><td>Usado para cobrir os pescoços de PVC e tampões de algodão do saco de fermentação</td></tr><tr><td>Agitador</td><td></td><td></td> <td>vibratórioUsado para sacudir os conídios dos substratos de grãos agrícolas</td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td><td></td><td>Usado para misturar suspensões de conídios em garrafas Mc Cartney</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Biolab</td><td></td><td>Adicionado ao meio SDA para melhorar a germinação e o crescimento de esporos</td></tr><tr><td>Sacos com zíper</td><td>GLAD</td><td></td><td>Usado para armazenar conídios fúngicos colhidos</td></tr></tbody></table>

produção em massa de fungos entomopatômicos, metarhizium robertsii e metarhizium pinghaense, para aplicação comercial contra pragas de insetos

Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

Fungos entomopatômicos do complexo de espécies anisopliae metarhizium ganharam importância como agentes de controle biológico de pragas de insetos agrícolas. O aumento da resistência a pragas a inseticidas químicos, as crescentes preocupações com os efeitos negativos dos inseticidas na saúde humana e a poluição ambiental dos pesticidas levaram a um impulso global para encontrar novas estratégias sustentáveis para a proteção das culturas e o controle de pragas. Anteriormente, foram conduzidas tentativas de cultura de massa, tais espécies de fungos entomopatômicos (EPF) como Beauveria bassiana . No entanto, apenas tentativas limitadas foram conduzidas à cultura de massa Metarhizium robertsii e M. pinghaense para uso contra pragas de insetos. Este estudo teve como objetivo produzir em massa um número suficiente de propagules infecciosos resilientes de isolados sul-africanos de M. robertsii e M. pinghaense para aplicação comercial. Três produtos agrícolas de grãos, aveia em flocos, cevada em flocos e arroz, foram utilizados como substratos de fermentação sólida da EPF. Dois métodos de inoculação, suspensões conidiais e a cultura fúngica líquida de blastospores foram usados para inocular os substratos sólidos. Observou-se que a inoculação por suspensões conidiais foi relativamente menos eficaz, uma vez que foram observados níveis de contaminação aumentados nos substratos sólidos em relação ao uso do método de inoculação blastospore. A aveia flocada não foi um substrato de crescimento adequado tanto para M. robertsii quanto para M. pinghaense, uma vez que nenhuma conidia seca foi colhida do substrato. A cevada flocada foi encontrada para favorecer a produção de M. robertsii conidia sobre a de M. pinghaense, e uma média de 1,83 g ± 1,47 g de M. robertsii conidia seca e zero gramas de M. pinghaense conidia foi colhida do substrato. Os grãos de arroz foram encontrados para favorecer a produção em massa conidial tanto dos isolados M. pinghaense quanto M. robertsii , com média de 8,2 g ± 4,38 g e 6 g ± 2 g colhidas do substrato, respectivamente.

Um declínio na massa de conteúdo das culturas sobre arroz tanto para o M. pinghaense quanto para o M. robertsii foi observado ao longo do tempo durante a fase de secagem das culturas fúngicas, sem, ou pouco, mudança sendo observada na massa uma vez que as culturas estavam secas (Figura 5). O pó de conidia fúngica seca colhida tanto do M. pinghaense quanto do M. robertsii é mostrado na Figura 6.
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Fungos entomopatômicos ganharam importância como agentes de controle biológico de pragas de insetos agrícolas. Neste estudo, a produção em massa de um número suficiente de propagules infecciosos resilientes de isolados sul-africanos tanto de Metarhizium robertsii quanto de M. pinghaense para aplicação comercial contra pragas de insetos foi realizada com sucesso utilizando produtos agrícolas de grãos.

Produção em massa de Fungos Entomopatômicos, Metarhizium robertsii e Metarhizium pinghaense, para Aplicação Comercial Contra Pragas de Insetos

Entomopathogenic fungi of the Metarhizium anisopliae species complex have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. ...

Este método fornece novas informações sobre como produzir em massa conidia infecciosa de fungos entomopatômicos para controlar pragas de insetos importantes em agrossistemas comerciais, dada a situação atual em que a maioria dos inseticidas são eliminados gradualmente devido a preocupações de seu efeito tóxico sobre o meio ambiente e a saúde humana. A técnica descreve o método utilizado para garantir o rendimento ideal da conidia EPF durante a produção em massa. O método é útil para o manejo integrado de pragas e controle biológico, fornecendo uma visão sobre a eficácia da conidia produzida em massa para o manejo em larga escala de pragas prejudiciais de insetos resistentes a inseticidas nos agrosistematos.Este procedimento foi desenvolvido e demonstrado pelo Dr. Letodi Luki Mathulwe, Dr. Nomakholwa Faith Stokwe e pela professora Antoinette Paula Malan. Aqueça um litro de água destilada e desligue o fogo antes de chegar ao ponto de ebulição. Agora, adicione 30 gramas de glicose, quatro gramas de fosfato de potássio dibásico, 20 gramas de extrato de levedura, 15 mililitros de licor de milho íngreme, e leve o conteúdo para ferver suavemente por dois a três minutos.Despeje um total de

mass-production-entomopathogenic-fungi-metarhizium-robertsii

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Aqui, relatamos os diferentes estágios envolvidos no desenvolvimento baseado no conhecimento de um efetivo microssecticida, incluindo o isolamento, identificação, triagem e seleção do fungo entomopatogênico "melhor ajustado", Metarhizium anisopliae , para controle de pragas de insetos na agricultura .

Desenvolvimento de<em&gt; Metarhizium anisopliae</em&gt; Como um Mycoinsecticide: do isolamento ao desempenho do campo

Aqui apresentamos um protocolo baseado no sistema de isca mealworm (Tenebrio molitor)-isca que foi utilizado para isolar e selecionar fungos entomopatômicos (EPF) a partir de amostras de solo. Uma fórmula eficaz de número de conidia (ECN) é usada para selecionar EPF tolerante ao alto estresse com base em características fisiológicas para controle microbiano de pragas no campo.

Isolamento e Seleção de Fungos Entomopatômicos de Amostras de Solo e Avaliação da Virulência Fúngica contra Pragas de Insetos

Colônias fúngicas entomopatômicas são isoladas de amostras de solo tropical usando isca tenebrio , isca de Galleria , bem como meio artificial seletivo, ou seja, ágar de dextrose de batata enriquecido com extrato de levedura suplementado com clorofenicol, tiaabzolendae e ciclohexmida (meio CTC).

Comparação de métodos para isolar fungos entomopatômicos de amostras de solo

Aqui apresentamos um protocolo para obtenção de fungos entomopatogênicos de uma broca florestal e uma forma substitutiva de avaliar suas atividades entomopatogênicas usando um inseto modelo coleóptero. Este método é eficiente e conveniente para explorar recursos fúngicos entomopatogênicos de pragas de insetos perfuradores de madeira em florestas naturais.

Isolamento, Identificação Comportamental e Avaliação de Patogenicidade de Fungos Entomopatogênicos de uma Broca da Madeira Florestal

Apresentamos dois métodos para que agricultores propaguem em massa nematoides entomopatogênicos como bioinseticidas. O primeiro método utiliza gel de poliacrilamida como substrato de cultivo do nematoide, enquanto o segundo utiliza algodão revestido com polímero como substrato de cultivo. Ambos os métodos dependem da propagação in vivo de nematoides dentro de cadáveres de insetos.

Propagação In Vivo de Nematoides Entomopatogênicos Baseada em Cultivadores

Um método para preparar células de insetos e infectá-las com baculovírus com a finalidade de produção de recombinantes proteinand mCD1d gerando tetrâmeros mCD1d.

Um método para produção de proteína recombinante em células de inseto mCD1d.

Kindlins são fundamentais para a adesão celular através de integrinas mas os estudos deles foram prejudicados pela dificuldade encontrada em expressá-las de forma recombinante em hospedeiros bacterianos. Descrevemos aqui métodos para a sua produção eficiente em células de insecto infectadas com baculovírus.

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RNA-Seq as análises estão se tornando cada vez mais importantes para identificar os fundamentos moleculares de características adaptativas em organismos não modelo. Aqui, um protocolo para identificar genes diferencialmente expressos entre mosquitos Aedes albopictus diapausados e não diapausados é descrito, desde a criação de mosquitos até o sequenciamento de RNA e análises de bioinformática de dados de RNA-Seq.

Uma Experimental e Bioinformática Protocolo de Análises de RNA-seq de fotoperiódicas diapausa no Tigre Asiático Mosquito, Aedes albopictus

Corantes fluorescentes vitais são ferramentas essenciais para análises de imagens de células vivas na biologia moderna das células fúngicas. Este artigo detalha a aplicação de corantes fluorescentes estabelecidos e menos conhecidos para rastrear a dinâmica da membrana plasmática, endo-/exocitose e mordogênese da parede celular em fungos filamentous.

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O CRISPR/Cas9 é cada vez mais usado para caracterizar a função genética em organismos não-modelo. Este protocolo descreve como gerar linhas de knock-out de Culex pipiens, desde o preparo de misturas de injeção, até a obtenção e injeção de embriões de mosquitos, bem como como criar, atravessar e tela injetar mosquitos e sua prole para mutações desejadas.

Preparando e injetando embriões de mosquitos Culex para gerar mutações nulas usando CRISPR/Cas9

Aprenda a produção em massa de conídios infectivos de Metarhizium robertsii e Metarhizium pinghaense para controle biológico de pragas agrícolas. O método utiliza arroz como substrato ideal e culturas de blastosporos para reduzir contaminação.

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Produção em massa de Fungos Entomopatômicos, Metarhizium robertsii e Metarhizium pinghaense, para Aplicação Comercial Contra Pragas de Insetos

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