Name: Modelagem de sinalização Wnt não canônica parácrina in vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Aprenda a modelar sinalização Wnt não canônica parácrina in vitro usando células de crista neural murinas e mioblastos C2C12. Este protocolo reprodutível permite avaliações funcionais e moleculares do eixo Wnt5a/ROR2.

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Este trabalho foi apoiado em parte pelos prêmios do NIH F30HL154324 para O.T. e K08HL121191 e R03HL154301 para S.R.K. Os autores gostariam de reconhecer que o esquema da Figura 1 deste manuscrito foi criado com biorender.com.

<ol><li>Ho, H. Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a-Ror-Dishevelled+signaling+constitutes+a+core+developmental+pathway+that+controls+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).</li>
<li>Čapek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+Frizzled7+reveals+a+permissive+role+of+noncanonical+wnt+signaling+in+mesendoderm+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration.</a> Elife. (8), 42093(2019).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+signaling+regulates+polarized+second+heart+field+morphogenesis+to+promote+both+arterial+and+venous+pole+septation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation.</a> Development. 146 (20), 181719(2019).</li>
<li>Lutze, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+WNT-signaling+controls+differentiation+of+lymphatics+and+extension+lymphangiogenesis+via+RAC+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4739(2019).</li>
<li>Buttler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maldevelopment+of+dermal+lymphatics+in+Wnt5a-knockout-mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice.</a> Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).</li>
<li>Betterman, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+cadherin+FAT4+orchestrates+lymphatic+endothelial+cell+polarity+in+response+to+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).</li>
<li>Descamps, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled+4+regulates+arterial+network+organization+through+noncanonical+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling.</a> Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).</li>
<li>Weeraratna, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+signaling+directly+affects+cell+motility+and+invasion+of+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma.</a> Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).</li>
<li>Henry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+novel+Wnt+receptor+ROR2+is+increased+in+breast+cancer+and+may+regulate+both+%CE%B2-catenin+dependent+and+independent+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).</li>
<li>Anastas, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+complex+of+SCRIB%2C+NOS1AP+and+VANGL1+regulates+cell+polarity+and+migration%2C+and+is+associated+with+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression.</a> Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).</li>
<li>Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+world+of+WNT+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The complex world of WNT receptor signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).</li>
<li>Dong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+redundancy+of+frizzled+3+and+frizzled+6+in+planar+cell+polarity+control+of+mouse+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles.</a> Development. 145 (19), (2018).</li>
<li>Bernascone, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sfrp3+modulates+stromal-epithelial+crosstalk+during+mammary+gland+development+by+regulating+Wnt+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 2481(2019).</li>
<li>Hendrickx, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNT16+requires+G%CE%B1+subunits+as+intracellular+partners+for+both+its+canonical+and+noncanonical+WNT+signalling+activity+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts.</a> Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).</li>
<li>Avgustinova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+cell-derived+Wnt7a+recruits+and+activates+fibroblasts+to+promote+tumour+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness.</a> Nature Communications. (7), 10305(2016).</li>
<li>Tseng, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAPE+suppresses+migration+and+invasion+of+prostate+cancer+cells+via+activation+of+noncanonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling.</a> Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Wnt%2FCa2%2B+signaling+in+actin+cytoskeleton+remodeling+and+cell+motility+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer.</a> PLoS One. 5 (5), 10456(2010).</li>
<li>Gibbs, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prickle1+mutation+causes+planar+cell+polarity+and+directional+cell+migration+defects+associated+with+cardiac+outflow+tract+anomalies+and+other+structural+birth+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects.</a> Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).</li>
<li>Cui, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+PCP+protein+required+for+ciliogenesis%2C+regulates+directional+cell+migration+and+cell+polarity+by+direct+modulation+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton.</a> PLoS Biology. 11 (11), 1001720(2013).</li>
<li>Gombos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formin+DAAM+functions+as+molecular+effector+of+the+planar+cell+polarity+pathway+during+axonal+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).</li>
<li>Toubat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Crest+Cell-derived+Wnt5a+Regulates+Planar+Cell+Polarity+in+Cranial+Second+Heart+Field+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells.</a> Circulation. 142, Suppl_3 12540(2020).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+cell+cohesion+by+Wnt5a+during+second+heart+field+progenitor+deployment%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment.</a> Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).</li>
<li>Sinha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Wnt5a+disrupts+second+heart+field+cell+deployment+and+may+contribute+to+OFT+malformations+in+DiGeorge+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).</li>
<li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+instruction+to+output%3A+Wnt%2FPCP+signaling+in+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer.</a> Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).</li>
<li>Shi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+Dishevelled-Mediated+Wnt+Signaling+in+Vertebrate+Early+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370(2020).</li>
<li>Butler, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity in development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).</li>
<li>Bradshaw, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+neural+crest+cells+during+outflow+tract+septation+in+the+neural+crest-deficient+mutant+Splotch2H%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H.</a> Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).</li>
<li>Kodo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Sema3c+and+the+interaction+between+cardiac+neural+crest+and+second+heart+field+during+outflow+tract+development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6771(2017).</li>
<li>Waldo, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neural+crest+is+necessary+for+normal+addition+of+the+myocardium+to+the+arterial+pole+from+the+secondary+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field.</a> Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).</li>
<li>Schleiffarth, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+is+required+for+cardiac+outflow+tract+septation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice.</a> Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).</li>
<li>Nguyen, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+Manipulation+of+O9-1+Neural+Crest+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).</li>
<li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).</li>
<li>Martinotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratch+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Scratch wound healing assay.</a> Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).</li>
</ol>

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

A via de sinalização não canônica Wnt/polaridade celular planar (PCP) é uma via de sinalização celular criticamente importante que tem sido implicada em múltiplos processos de desenvolvimento 24,25 e doença24,26. Durante o desenvolvimento embrionário, a sinalização Wnt não canônica envolve uma rede expansiva de sinais moleculares de células emissoras de sinais que, em última análise, induzem muda...

A sinalização Wnt não canônica é uma via conservada evolutivamente que regula a organização do filamento celular e a migração direcional. Essa via tem sido implicada em múltiplos processos biológicos, incluindo morfogênese do tecido embrionário 1,2,3, angiogênese linfática e vascular 4,5,6,7 e crescimento e metástase do câncer 8,9,10 . No nível celular, a sinalização Wnt não canônica é realizada através de interações parácrinas coordenadas entre as células emissoras e receptoras de sinal. Essas interações ocorrem frequentemente entre células de diferentes linhagens ou tipos e envolvem uma rede molecular diversificada que inclui até 19 ligantes e múltiplos receptores, co-receptores e efetores de transdução de sinal a jusante11. Complicando ainda mais esse processo de sinalização, estudos anteriores mostraram que as combinações ligante-receptor podem variar de maneira dependente do contexto e do tecido 12,13, e que os mesmos ligantes de origem que acionam a sinalização Wnt não canônica em células receptoras de sinal podem ser produzidos por múltiplos tipos de células emissoras de sinal 14,15 . Dada a complexidade celular e molecular associada à sinalização Wnt não canônica, a capacidade de estudar mecanismos individuais e clinicamente relevantes in vivo tem sido limitada.
Tentativas têm sido feitas para estudar a sinalização Wnt não canônica usando técnicas de cultura de células in vitro. Por exemplo, ensaios de cicatrização de feridas realizados em monocamadas celulares têm sido utilizados para avaliar funcionalmente a migração direcional celular 4,16,17,18,19. Técnicas de imunocoloração têm sido utilizadas para realizar análises espaciais da expressão de proteínas de superfície para avaliar alterações não canônicas induzidas por Wnt na morfologia celular 7,10, arquitetura e polarização assimétrica18,19,20. Embora essas abordagens tenham fornecido ferramentas importantes para caracterizar fenótipos relacionados à Wnt em células receptoras de sinal, a falta de componentes emissores de sinal nesses protocolos limita sua capacidade de modelar com precisão os mecanismos de sinalização parácrina observados in vivo. Como resultado, permanece uma necessidade crítica de desenvolver sistemas in vitro que permitam uma avaliação robusta e reprodutível das interações de sinalização parácrina entre células emissoras e receptoras de sinais da via Wnt não canônica, particularmente aquelas de diferentes tipos celulares.
Para tanto, o objetivo primário deste estudo foi estabelecer um protocolo para modelar interações de sinalização Wnt não canônicas parácrinas in vitro. Desenvolvemos um sistema de cocultura sem contato que recapitula os componentes de envio e recepção de sinal dessas interações e permite o uso de abordagens moleculares, genéticas ou farmacológicas padrão para estudar independentemente mecanismos específicos de ligantes-receptores na via Wnt não canônica. Os mecanismos de sinalização Wnt mediada por NCC foram examinados em mioblastos usando linhagens celulares murinas estabelecidas. Como prova de princípio, este modelo foi utilizado para corroborar achados de estudos in vivo prévios em camundongos que implicam o eixo Wnt5a-ROR2 como uma via de sinalização Wnt não canônica relevante entre os NCCs21 e os progenitores cardiomioblastos SHF 3,22,23.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem antidesvanecimento com DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td>Armazenado a 4 &graus; C</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2323</td><td>Armazenado a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>C2C12 linha celular de mioblastos murinos</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cultura de células, 75 cm2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Chamber Slide System, 4 poços</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia Modificada' s Meio (DMEM), glicose alta (4,5 g/L), L-glutamina (2 mM)</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td>Armazenado a 4 &graus; C</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cônicos Falcon, 15 mL</td> Suporte permeável Falcon <td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>para placa de 24 poços com 0,4 &micro; M membrana PET transparente</td><td>Corning</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3381E</td><td>Armazenado em alíquotas de 50 mL a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Solução de gelatina, 0,1%</td> <td>ATCC</td><td>PCS-999-027</td><td>Armazenado a 4 °; C</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta graduadas e estéreis, 10 &micro; L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3810</td><td></td></tr><tr><td>Fator inibidor de leucemia (LIF), 106 unidades/mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais MEM (MEM NEAA) 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Meio essencial mínimo (MEM)</td><td>Corning</td><td>10-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas antiaderentes de vidro automático, 24 x 55 mm</td> Linha celular de crista neural <td>Springside Scientific</td><td>HRTCG2455</td><td></td></tr><tr><td>O9-1</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCC049</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I, 1x</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído solução em PBS, 4%</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>Armazenado a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL de penicilina e 10.000 &mu; g/mL de estreptomicina)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3470H</td><td>Armazenado em alíquotas de 10 mL a -20 &graus; C</td></tr><tr><td>Faloidina-flúor 488</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td>Armazenado a -20 &deg; C, Mantenha fora da luz</td></tr><tr><td>Solução salina tampão fosfato (PBS), 1x, sem cálcio e magnésio, pH 7,4</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>Armazenado a 4 &graus; C</td></tr><tr><td>Fator de crescimento de fibroblastos humanos recombinantes-básico (rhFGF-básico)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Proteína Wnt5a recombinante humana/camundongo R</td><td>& D Systems</td><td>645-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio, 100 mM</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri quadrada com grade</td><td>Thomas Scientific</td><td>1219C98</td><td></td></tr><tr><td>STO células alimentadoras de fibroblastos murinos</td><td>ATCC</td><td>CRL-1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 solução</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA, 0,25%</td> <td>Fisher Scientific</td><td>W3513C</td><td>Armazenado a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Zeiss Apotome.2 microscópio de fluorescência</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss microscópio de luz Axio Vert.A1 invertido</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen lite 2012 software de microscopia</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>software de imagem</td></tr></tbody></table>

modelagem de sinalização wnt não canônica parácrina in vitro

Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro

A sinalização Wnt não canônica regula a organização do filamento de actina intracelular e a migração polarizada de células progenitoras durante a embriogênese. Este processo requer interações parácrinas complexas e coordenadas entre as células de envio e recepção de sinal. Dado que essas interações podem ocorrer entre vários tipos de células de diferentes linhagens, a avaliação in vivo de defeitos específicos da célula pode ser um desafio. O presente estudo descreve um método altamente reprodutível para avaliar a sinalização de Wnt parácrina não canônica in vitro. Este protocolo foi projetado com a capacidade de (1) realizar avaliações funcionais e moleculares de sinalização Wnt não canônica entre quaisquer dois tipos de células de interesse; (2) dissecar o papel das moléculas de envio de sinal versus moléculas receptoras de sinal na via de sinalização Wnt não canônica; e (3) realizar experimentos de resgate fenotípico com abordagens moleculares ou farmacológicas padrão.
Este protocolo foi utilizado para avaliar a sinalização Wnt não canônica mediada por células da crista neural (NCC) em mioblastos. A presença de NCCs está associada a um aumento do número de filopódios citoplasmáticos positivos para faloidina e lamellipodos nos mioblastos e à melhora da migração mioblástica em um ensaio de cicatrização de feridas. O eixo Wnt5a-ROR2 foi identificado como uma via de sinalização Wnt não canônica crucial entre os progenitores de cardiomioblastos NCC e do segundo campo cardíaco (SHF). Em conclusão, este é um protocolo altamente tratável para estudar mecanismos de sinalização Wnt não canônicos parácrinos in vitro.

Efeitos dos psicanalistas sobre a capacidade migratória de mioblastos murinos Este ensaio foi aplicado pela primeira vez para avaliar o impacto dos psicanalistas na capacidade migratória dos mioblastos. A Figura 1 descreve o modelo esquemático do ensaio. Para testar esse impacto, ensaios de arranhões foram realizados com mioblastos que foram cultivados isoladamente (sem inserções NCC) em comparação com aqueles cultivados na presença de inserções. Como controle positivo, 5...

O presente estudo descreve um método altamente reprodutível e tratável para estudar eventos de sinalização Wnt não canônica parácrina in vitro. Este protocolo foi aplicado para avaliar o impacto da sinalização parácrina Wnt5a em células da crista neural murina e mioblastos.

Modelagem de sinalização Wnt não canônica parácrina in vitro

Noncanonical Wnt signaling regulates intracellular actin filament organization and polarized migration of progenitor cells during embryogenesis. This ...

Este protocolo descreve um método altamente reprodutível para avaliar funcional e molecularmente a sinalização Wnt não canônica parácrina em qualquer população celular de interesse. Avaliações funcionais e moleculares são realizadas na mesma população celular e podem ser aplicadas para estudar qualquer componente da via Wnt/PCP. Para começar, ressuspeite a célula C2C12 previamente peletizada em 10 mililitros de meio C2C12.Para diluir as células na proporção de 1:20, adicionar 0,5 mililitros de suspensão celular em um tubo de 15 mililitros contendo 9,5 mililitros de meio C2C12 fresco e misturar suavemente com uma pipeta sorológica usando uma pipeta P1000, adicionar um mililitro da suspensão celular diluída a cada poço de um novo poço de quatro câmaras e colocá-lo na incubadora. Para chapear as inserções de células de O9-1, ressussuscite o pellet de célula de O9-1 em 10 mililitros de meio de crescimento de O9-1. E semelhante à diluição das células C2C12, dilua as células O9-1 na proporção de 1:20.Em seguida, coloque uma única inserção permeável dentro de cada poço de um novo poço de quatro câmaras preenchido com um mililitro de meio de crescimento O9-1. Adicione 300 microlitros da suspensão de células O9-1 diluídas a cada pastilha e certifique-se de que a pastilha está completamente submersa. Em seguida, incube o poço a 37 graus Celsius.Para realizar a derrubada de siRNA nas células de O9-1, dilua o siRNA e o reagente de transfecção no meio sérico reduzido de acordo com as recomendações do fabricante nas concentrações desejadas. Misture suavemente o siRNA diluído e o reagente de transfecção e incube a mistura à temperatura ambiente durante sete minutos. Após 18 a 24 horas de revestimento celular, adicione os complexos lipídicos de siRNA às inserções de células O9-1 e incube por aproximadamente 34 a 48 horas.Quando as células atingirem 70 a 80% de confluência, remova bem o meio da câmara C2C12 e lave as células uma vez com PBS. Depois de remover o PBS, comece a arranhar as células passando uma ponta de pipeta P10 estéril firmemente em uma única direção para abranger todo o comprimento ou largura da monocamada da célula. Uma vez que as células estão arranhadas, adicione rapidamente um mililitro de PBS.Em seguida, ligue o computador e o microscópio. Coloque o slide da câmara no palco e gire o mostrador da objetiva para aumentar 5X. Abra o software de imagem.Clique na guia da câmera e, em seguida, clique no botão Live para visualizar as células na guia AxioCam IC. Certifique-se de que o filtro de luz é puxado todo o caminho para fora para permitir que a luz passe para a câmera e tela do computador, mova manualmente ou gire o slide da câmara para posicionar a área da ferida no centro da imagem ao vivo na guia AxioCam IC. Para tirar imagens, clique em Ajustar para abrir uma nova guia ao lado da guia AxioCam IC que contém a imagem.Para salvar essa imagem estática, clique no arquivo, selecione salvar como, selecione área de trabalho na barra à esquerda para salvar o arquivo na área de trabalho, digite o nome do arquivo na caixa de nome do arquivo e salve a figura no formato de arquivo czi. Para salvar a imagem como um tiff, clique em arquivo, selecione salvar como, digite o nome do arquivo na caixa Nome do arquivo. Clique no botão Salvar como tipo e selecione tiff no menu suspenso.Reposicione manualmente a lâmina da câmara para tirar mais duas a três imagens em outros pontos da ferida no mesmo poço. Após a imagem, remova o PBS de cada poço e adicione um mililitro de meio C2C12. Monte o sistema de co-cultura de inserção de poços colocando manualmente as inserções contendo as células de O9-1 em cada poço do poço da câmara.Empurre suavemente as inserções para baixo no poço, de modo que a parte inferior da inserção fique logo acima das células C2C12 subjacentes. Devolva as construções de inserção do poço à incubadora e permita que as células migrem por um total de nove a 12 horas. Para determinar o tempo de migração ideal, verifique as células em seis horas após a criação da ferida e, em seguida, a cada duas a três horas depois disso.Termine o experimento quando as células em condições de controle cobrirem completamente a ferida. Inicie a terminação do ensaio de migração e insira bem a desconstrução do sistema removendo as inserções de células O9-1 após nove a 12 horas do período de migração. Aspirar cuidadosamente o meio C2C12.Adicione 0,5 mililitros de PBS aos poços da câmara e tire as imagens finais das células após a migração. Aspirar cuidadosamente todos os PBS misturados com meio e remover as câmaras de plástico dos poços da câmara usando as instruções do kit. Deixando a lâmina subjacente contendo as células C2C12.Para imunocoloração, incubar imediatamente a lâmina com aldeído paraforme a 4% por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, remova o paraformaldeído e lave a lâmina com 0,1% de Triton X-100 contendo PBST por 15 minutos à temperatura ambiente. Após 15 minutos, despeje o PBST e lave a lâmina duas vezes com PBS por 10 minutos cada.Em seguida, crie um limite hidrofóbico com uma caneta hidrofóbica ao redor da lâmina para evitar que as soluções se derramem da lâmina, impedindo a interrupção das células de aderência. Em seguida, adicione aproximadamente 0,5 mililitros de solução de bloqueio de 1% de BSA à lâmina dentro do limite hidrofóbico e incube a lâmina por uma hora à temperatura ambiente em uma câmara de lâmina umidificada. No final da incubação, remova a solução de bloqueio e adicione o anticorpo de faloidina a esta lâmina dentro do limite hidrofóbico e incube a quatro graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, coloque o slide em um suporte de slide protegido da exposição à luz. Lave as células três vezes com PBS por 10 minutos cada à temperatura ambiente. Adicione o meio de montagem contendo DAPI, monte as lâminas com lâminas de tampa de vidro e capture as células usando um microscópio de fluorescência padrão.No presente estudo, a adição de Wnt5a recombinante a poços de cocultura acelerou a migração mioblástica com recuperação completa de algumas áreas em nove horas. Os mioblastos migratórios nas três condições exibiram morfologia celular migratória normal, incluindo filópodedos e lamellipodos bem formados e salientes e polarização assimétrica das projeções citoesqueléticas de actina. O efeito parácrino do Wnt5a derivado de NCC na migração mioblástica foi estudado.O tratamento com 50 siRNA nanomolares contra Wnt5a reduziu a expressão gênica de Wnt5a em 64% em comparação com o controle negativo. A migração de blastos de C2C12 milhas com redução significativa após o knockdown de Wnt5a em NCCs e a adição de Wnt5a recombinante exógeno resgataram esse déficit migratório e defeito morfológico nesses mioblastos. Para melhor compreensão dos mecanismos celulares receptores de sinal no modelo parácrino, o receptor ROR2 foi derrubado e a expressão gênica foi reduzida em 54%Knockdown de ROR2 em mioblastos reduz sua capacidade migratória, apesar da presença de psic.O Wnt5a recombinante exógeno não conseguiu resgatar a migração de mioblastos após o knockdown do ROR2, sugerindo que a depleção do ROR2 interrompe a capacidade dos mioblastos de receber sinais Wnt5a. Células de cultura para arranhão de densidade adequada com ponta P10 apenas uma vez montam e desmontam o sistema de co-cultura com cuidado sem interromper a célula subjacente. Esta técnica foi usada como prova de conceito para estudar um eixo de sinalização molecular específico dentro da complexa via Wnt/PCP com relevância para a biologia da crista neural e do segundo campo cardíaco.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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