Name: Um ensaio de quimiotaxis melhorado para a identificação rápida de quimioattractants rizobacterianos em Exudates radiculares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Aprenda um ensaio de quimiotaxis otimizado para identificar quimioattractants de rizobactérias em exsudatos radiculares. Este método reduz erros e custos, acelerando pesquisas sobre interações planta-microorganismo.

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Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (Nos. 31870493), os Principais Projetos de Pesquisa e Desenvolvimento em Heilongjiang, China (GA21B007), e as Taxas Básicas de Pesquisa das Universidades da Província de Heilongjiang, China (No. 135409103).

1. Materiais e equipamentos
NOTA: Bacillus altitudinis LZP02 (CP075052) foi isolado da rizosfera do arroz no nordeste da China12,13 para este estudo.
<ol><li>Cultura B. altitudinis LZP02 em Luria-Bertani (LB) médio (peptone, 10 g L-1; NaCl, 8 g L-1 e extrato de levedura, 5 g L-1) por 10 h. Colete células por centrifugação a 9.569 x g por 2 min a 4 °C. e armazene com 15% de glicerol a -80 °C. NOTA: Para este experimento, as sementes de arroz (Oryza sativa Longgeng 46) foram fornecidas pelo Instituto de Pesquisa de Arroz da Academia heilongjiang de Ciências Agrícolas.</li>
</ol>2. Coleção de exsudatos de raiz
<ol><li>Distribua aleatoriamente sementes de arroz em uma câmara de crescimento. NOTA: As sementes de arroz foram esterilizadas com 30% de H2O2 por 30 min e encharcadas em água durante a noite. As condições foram as seguintes: luz controlada (ciclo claro/escuro de 16/8 horas), temperatura (22 ± 2 °C) e umidade relativa (͂ 70%).</li>
	<li>Cultura sementes de arroz por uma semana e adicione água estéril duas vezes.</li>
	<li>Selecione mudas de arroz de tamanho semelhante e plante em 50 mL de meio líquido Murashige e Skoog (MS). Incubar por 48 h a 22 °C em condições assépticas. NOTA: Os exsudatos de raiz de arroz serão liberados no ms médio14,15,16.</li>
</ol>3. Análise de espectrometria de massa cromatografia líquida de exsudatos radiculares
<ol><li>Colete 100 μL da amostra (meio MS contendo exsudatos radiculares) em um tubo centrífuga de 1,5 mL. Adicione 20 μL do solvente de extração (acetonitrilo-água de metanol, 2:2:1, incluindo padrão interno). Homogeneize a amostra a 45 Hz por 4 min, seguida de ultrassônica no gelo por 5 minutos em banho-maria.</li>
	<li>Repita a homogeneização e o ciclo ultrassônico três vezes. Incubar a amostra a -20 °C por 1h, seguida de centrifugação a 133.778 x g e 4 °C por 15 min.</li>
	<li>Transfira o supernatante resultante para frascos LC-MS e armazene a -80 °C até análise UHPLC-QE. Prepare as amostras de controle de qualidade (QC) misturando partes iguais do sobrenatante de todas as amostras. NOTA: Cada volume amostral foi de 600 μL (seis réplicas por experimento) no experimento apresentado.</li>
	<li>Realize a análise LC-MS/MS utilizando o sistema UHPLC, a coluna UPLC HSS T3 (2,1 mm x 100 mm, 1,8 μm) e a Q Exactive12.<ol>
<li>Use solução aquosa de ácido fórmico de 0,1% e solução aquosa de acetato de amônio 5 mmol/L como fase móvel A e acetonitrilo como fase móvel B. Use ácido fórmico e acetato de amônio como modos positivos e negativos de íons, respectivamente.</li>
		<li>Coloque o gradiente de elução da seguinte forma: 0 min, 1% B; 1 min, 1% B; 8 min, 99% B. 10 min, 99% B. 10,1 min, 1% B; 12 min, 1% B. Ajuste a taxa de fluxo e o volume de injeção para 0,5 mL/min e 2 μL, respectivamente. NOTA: A macromolécula (&gt;1.000 Daltons) não pode ser detectada.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Ensaio de quimioterapia
<ol><li>Prepare a solução aquosa quimioattractant. Certifique-se de que é estéril. Filtre a solução de quimioterapia com um filtro de bactérias de 0,22 μm. NOTA: A solução aquosa quimioattractant foi a única substância obtida dos estudos de LC-MS dissolvidos na água. A concentração e o volume podem ser ajustados adequadamente de acordo com diferentes estudos. A solução de ácido cítrico foi usada como exemplo. Todas as ações devem ser realizadas ao lado de uma lâmpada.</li>
	<li>Marque a posição do meio do deslizamento de vidro em um intervalo de 1 cm. Certifique-se de que a lâmina de vidro seja esterilizada várias vezes na chama.</li>
	<li>Adicione os 30 μL de solução de quimioattractant à esquerda do slide de vidro. Certifique-se de que as bactérias foram cultivadas até o estágio logarítmico (2 x 108 UFC/mL) em meio LB. Adicione 30 μL da solução bacteriana à direita do escorregador de vidro. NOTA: Prepare um grupo de controle negativo com um volume igual de água estéril. A solução salina (0,9% NaCI) foi utilizada como controle positivo para eliminar as alterações causadas pela força intermolecular no experimento.</li>
	<li>Esterilize um laço inoculante várias vezes na chama. Use o laço inoculante para conectar a solução aquosa quimioattractant à solução bacteriana e mantê-la em temperatura ambiente por 20 minutos em um banco limpo. NOTA: O experimento deve ser realizado em um ambiente sem vento. Ajuste o tempo antes de desconectar a linha de conexão para cepas de diferentes habilidades atléticas adequadamente.</li>
	<li>Após 20 min, desconecte a linha de conexão com papel filtro.</li>
	<li>Certifique-se de que o tubo centrífuga de 1,5 mL é estéril. Colete a solução aquosa quimioattractant à esquerda do escorregador de vidro. Transfira a solução para o tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL.</li>
	<li>Adicione o volume apropriado de safranin ao tubo centrífuga. Após 2 minutos, colete os líquidos miscíveis para contar bactérias e observação microscópica com uma câmara de contagem de sangue.</li>
</ol>5. Análise de resultados
<ol><li>Determine o número de microrganismos viáveis atraídos usando a seguinte equação: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63249/63249eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> onde NBC: Número total de células bacterianas; N: Número de bactérias em 80 grades. NOTA: O software de análise estatística foi utilizado para análise de dados. O erro foi baseado em três diferentes valores experimentais replicados e foi calculado utilizando-se de uma ANOVA unidirecional, seguida pela análise pós-hoc da Turquia. P ≤ 0,05 foi considerado significativo.</li>
</ol>

<ol><li>Belas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%2C+flagella%2C+and+mechanosensing+of+surfaces+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria.</a> Trends in Microbiology. 22 (9), 517-527 (2014).</li>
<li>Haichar, Z., Santaella, C., Heulin, T., Achouak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+exudates+mediated+interactions+belowground%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Root exudates mediated interactions belowground.</a> Soil Biology and Biochemistry. 77 (7), 69-80 (2014).</li>
<li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+plant+root+exudates+and+their+organic+acid+components+on+chemotaxis%2C+biofilm+formation+and+colonization+by+beneficial+rhizosphere-associated+bacterial+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Soil%22%5BJournal%5D)">Effects of different plant root exudates and their organic acid components on chemotaxis, biofilm formation and colonization by beneficial rhizosphere-associated bacterial strains.</a> Plant and Soil. 374 (1-2), 689-700 (2014).</li>
<li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+transcriptomic+analysis+of+the+plant-beneficial+rhizobacterium+Bacillus+amyloliquefaciens+SQR9+during+enhanced+biofilm+formation+regulated+by+maize+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Whole transcriptomic analysis of the plant-beneficial rhizobacterium Bacillus amyloliquefaciens SQR9 during enhanced biofilm formation regulated by maize root exudates.</a> BMC Genomics. 16 (1), 685(2015).</li>
<li>Lui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+root-secreted+D-galactose+functions+as+a+chemoattractant+and+enhances+the+biofilm+formation+of+Bacillus+velezensis+SQR9+in+an+mcpa-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Induced root-secreted D-galactose functions as a chemoattractant and enhances the biofilm formation of Bacillus velezensis SQR9 in an mcpa-dependent manner.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (17), 785-797 (2020).</li>
<li>Vora, S. M., Joshi, P., Belwalkar, M., Archana, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+exudates+influence+chemotaxis+and+colonization+of+diverse+plant+growth-promoting+rhizobacteria+in+the+Cajanus+cajan+-+Zea+mays+intercropping+system%5BTitle%5D)+AND+%22Rhizosphere%22%5BJournal%5D)">Root exudates influence chemotaxis and colonization of diverse plant growth-promoting rhizobacteria in the Cajanus cajan - Zea mays intercropping system.</a> Rhizosphere. 18 (12), 100331(2021).</li>
<li>Sampedro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+halophyte+root+exudates+and+their+components+on+chemotaxis%2C+biofilm+formation+and+colonization+of+the+halophilic+bacterium+halomonas+anticariensis+FP35T%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Effects of halophyte root exudates and their components on chemotaxis, biofilm formation and colonization of the halophilic bacterium halomonas anticariensis FP35T.</a> Microorganisms. 8 (4), 575(2020).</li>
<li>Liu, X. L., Raza, W., Ma, J. H., Huang, Q. W., Shen, Q. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+role+amino+acid+from+sesbania+rostrata+seed+exudates+in+the+chemotaxis+response+of+Azorhizobium+caulinodans+ORS571%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">A dual role amino acid from sesbania rostrata seed exudates in the chemotaxis response of Azorhizobium caulinodans ORS571.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1134-1147 (2019).</li>
<li>Ling, N., Raza, W., Ma, J. H., Huang, Q. W., Shen, Q. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+role+of+organic+acids+in+watermelon+root+exudates+for+recruiting+Paenibacillus+polymyxa+SQR-21+in+the+rhizosphere%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Soil+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and role of organic acids in watermelon root exudates for recruiting Paenibacillus polymyxa SQR-21 in the rhizosphere.</a> European Journal of Soil Biology. 47 (6), 374-379 (2011).</li>
<li>Rudrappa, T., Czymmek, K. J., Pare, P. W., Bais, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root-secreted+malic+acid+recruits+beneficial+soil+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Root-secreted malic acid recruits beneficial soil bacteria.</a> Plant Physiology. 148 (3), 1547-1556 (2008).</li>
<li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+chemotaxis+on+Slipchip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Bacterial chemotaxis on Slipchip.</a> Lab on a Chip. 14 (16), 3074-3080 (2014).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+pumilus+LZP02+promotes+rice+root+growth+by+improving+carbohydrate+metabolism+and+phenylpropanoid+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Bacillus pumilus LZP02 promotes rice root growth by improving carbohydrate metabolism and phenylpropanoid biosynthesis.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (10), 1222-1231 (2020).</li>
<li>Goswami, M., Deka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+novel+rhizobacteria+having+multiple+plant+growth+promoting+traits+and+antifungal+activity+against+certain+phytopathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation of a novel rhizobacteria having multiple plant growth promoting traits and antifungal activity against certain phytopathogens.</a> Microbiological Research. 240, 126516(2020).</li>
<li>Kaiira, M., Chemining'Wa, G., Ayuke, F., Baguma, Y., Nganga, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiles+of+compounds+in+root+exudates+of+rice%2C+cymbopogon%2C+desmodium%2C+mucuna+and+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+Sciences+Belgrade%22%5BJournal%5D)">Profiles of compounds in root exudates of rice, cymbopogon, desmodium, mucuna and maize.</a> Journal of Agricultural Sciences Belgrade. 64 (4), 399-412 (2019).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+rice+root+exudates+and+strain+combination+on+biofilm+formation+of+Paenibacillus+polymyxa+and+Paenibacillus+macerans%5BTitle%5D)+AND+%22African+Journal+of+Microbiology+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of rice root exudates and strain combination on biofilm formation of Paenibacillus polymyxa and Paenibacillus macerans.</a> African Journal of Microbiology Research. 6 (13), 3343-3347 (2012).</li>
<li>Lee, H. W., Ghimire, S. R., Shin, D. H., Lee, I. J., Kim, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelopathic+effect+of+the+root+exudates+of+K21%2C+a+potent+allelopathic+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Biology+and+Management%22%5BJournal%5D)">Allelopathic effect of the root exudates of K21, a potent allelopathic rice.</a> Weed Biology and Management. 8 (2), 85-90 (2008).</li>
<li>Belimov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizobacteria+that+produce+auxins+and+contain+1-amino-cyclopropane-1-carboxylic+acid+deaminase+decrease+amino+acid+concentrations+in+the+rhizosphere+and+improve+growth+and+yield+of+well-watered+and+water-limited+potato+%28Solanum+tuberosum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Applied+Biology%22%5BJournal%5D)">Rhizobacteria that produce auxins and contain 1-amino-cyclopropane-1-carboxylic acid deaminase decrease amino acid concentrations in the rhizosphere and improve growth and yield of well-watered and water-limited potato (Solanum tuberosum).</a> Annals of Applied Biology. 167 (1), 11-25 (2015).</li>
<li>Ankati, S., Podile, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolites+in+the+root+exudates+of+groundnut+change+during+interaction+with+plant+growth+promoting+rhizobacteria+in+a+strain-specific+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Metabolites in the root exudates of groundnut change during interaction with plant growth promoting rhizobacteria in a strain-specific manner.</a> Journal of Plant Physiology. 243, 153057(2019).</li>
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<li>Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+root+exudates+in+rhizosphere+interactions+with+plants+and+other+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms.</a> Annual Review of Plant Biology. 57, 233-266 (2006).</li>
<li>Badri, D. V., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environment%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of root exudates.</a> Plant Cell Environment. 32 (6), 666-681 (2009).</li>
<li>Badri, D. V., Weir, T. L., Lelie, D., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizosphere+chemical+dialogues%3A+plant-microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotech.+Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rhizosphere chemical dialogues: plant-microbe interactions.</a> Curr Opin Biotech. Current Opinion in Biotechnology. 20 (6), 642-650 (2009).</li>
<li>Kamilova, F., Kravchenko, L. V., Shaposhnikov, A. I., Makarova, N., Lugtenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+tomato+pathogen+Fusarium+oxysporum+f.+sp.+radicis-lycopersici+and+of+the+biocontrol+bacterium+Pseudomonas+fluorescens+WCS365%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Effects of the tomato pathogen Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici and of the biocontrol bacterium Pseudomonas fluorescens WCS365.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (10), 1121-1126 (2006).</li>
<li>Kamilova, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+acids%2C+sugars%2C+and+L-tryptophane+in+exudates+of+vegetables+growing+on+stonewool+and+their+effects+on+activities+of+rhizosphere+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Organic acids, sugars, and L-tryptophane in exudates of vegetables growing on stonewool and their effects on activities of rhizosphere bacteria.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (3), 250-256 (2006).</li>
<li>Badri, D. V., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+function+of+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environment%22%5BJournal%5D)">Regulation and function of root exudates.</a> Plant Cell Environment. 32 (6), 666-681 (2009).</li>
<li>Hao, W. Y., Ren, L. X., Ran, W., Shen, Q. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelopathic+effects+of+root+exudates+from+watermelon+and+rice+plants+on+Fusarium+oxysporum+f.sp.+Niveum%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Soil%22%5BJournal%5D)">Allelopathic effects of root exudates from watermelon and rice plants on Fusarium oxysporum f.sp. Niveum.</a> Plant and Soil. 336 (1-2), 485-497 (2010).</li>
<li>Hao, Z. P., Wang, Q., Christie, P., Li, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelopathic+potential+of+watermelon+tissues+and+root+exudates%5BTitle%5D)+AND+%22Scientia+Horticulturae%22%5BJournal%5D)">Allelopathic potential of watermelon tissues and root exudates.</a> Scientia Horticulturae. 112 (3), 315-320 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Pesquisas crescentes indicam que as interações entre plantas e bactérias ocorrem principalmente na rizosfera e são influenciadas por exsudates raiz20,21,22,23,24. Os exsudatos de raízes vegetais incluem uma variedade diversificada de metabólitos primários, incluindo ácidos fenólicos, ácidos orgânicos e aminoácidos, bem como compostos secundários mais complexo...

A quimiotaxis é importante para a colonização da rizobacteriana promotora do crescimento vegetal (PGPR) nas raízes e para a compreensão das interações entre plantas e micróbios1. Uma classe de compostos de baixo peso molecular (quimioattractants) em exudatas de raízes vegetais induzem o movimento quimotactic de PGPR à rizosfera2. Ácido malicílico, ácido cítrico e outros componentes nos exsudatos radiculares estimulam a quimotaxis das cepas de Bacillus3. Por exemplo, glicose, ácido cítrico e ácido fumarico na raiz do milho exsudam bactérias para a superfície raiz4. D-galactose, que é derivado de exudatas raiz, induz a quimiotaxis de Bacillus velezensis SQR95. Ácidos orgânicos, incluindo fumarato, ácido málico e succinato, influenciam a quimiotaxis e a colonização de vários PGPR no Cajan cajan - Zea mays intercropping system6. O ácido oleanolico em exsudates de raiz de arroz, atua como um quimioattractant para a cepa FP357. Outros exsudatos de plantas (incluindo histidina, arginina e aspartato) podem desempenhar um papel crucial na resposta quimotactica das bactérias8. Exsudatos vegetais funcionam como um sinal para direcionar o movimento das bactérias, que é o primeiro passo durante a colonização da rizofera. A colonização vegetal pela PGPR é um processo de enorme relevância, pois o PGPR é benéfico para o hospedeiro da planta.
Muitos métodos têm sido usados para analisar quimotaxis bacterianos. O método da placa de natação é um dos métodos descritos anteriormente9. Neste método, as placas foram feitas com um meio semisoólido. Um tampão quimotactic contendo ágar (1,0%, w/v) foi adicionado à placa. O tampão é aquecido e misturado com o quimioattractant. Em seguida, 8 μL de suspensão bacteriana foi adicionado dropwise ao meio da placa e a placa foi colocada em uma incubadora a 28 °C. A placa era regularmente observada e fotografada. No entanto, o ciclo experimental do método da placa de natação foi muito longo. No método capilar10, uma ponta de pipeta serve como câmara para segurar 100 μL de suspensão bacteriana. A agulha de seringa de 1 mL foi usada como capilar. Uma agulha de seringa contendo quimioattractants com diferentes gradientes de concentração foi inserida na ponta de pipeta de 100 μL. Após a incubação à temperatura ambiente por 3h, a agulha da seringa foi removida, o conteúdo foi diluído e banhado no meio. O acúmulo bacteriano na seringa foi representado por unidades formadoras de colônias (UFC) nas placas. No entanto, o erro experimental dentro das réplicas para o método capilar foi grande. Outro método utilizou um dispositivo SlipChip microfluidic11. Resumidamente, a solução de albumina de soro bovino (BSA) foi injetada em todos os canais e removida usando um vácuo. As soluções contendo diferentes quimioattractants (concentração de 1 mM apenas para detecção qualitativa), células bacterianas suspensas em soro fisiológico tampão salino tampão tampão tampão de fosfato (controle negativo) foram adicionadas às micro-habitas superior, média e inferior, respectivamente. A incubação foi então realizada em um ambiente escuro à temperatura ambiente por 30 minutos. As células bacterianas foram então detectadas nos microwells. O dispositivo Microfluídico SlipChip, no entanto, era caro. Portanto, cada um dos métodos descritos acima tinha vantagens e desvantagens.
Estabelecemos um ensaio de quimiotaxis melhorado para a identificação rápida de quimioattractants rizobacterianos em exsudatos radiculares usando lâminas de vidro estéreis sem etapas complicadas. Neste estudo, por meio de múltiplas comparações de resultados experimentais, o método superou múltiplas deficiências dos métodos tradicionais de quimioterapia bacteriana. O método reduziu o erro de contagem de placas e encurtou o ciclo experimental. Portanto, se usado para identificar uma substância quimiofos, este novo método pode economizar de 2 a 3 dias e reduzir o custo de materiais experimentais.

<table><tbody><tr><td>Ácido 2,5-dihidroxibenzóico</td><td>Beijing InnoChem Science & Tecnologia C., Ltd.</td><td>490-79-9</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>CNW Technologies</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amônio</td><td>CNW Technologies</td><td>631-61-8</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cafeico</td><td>Pequim InnoChem Science & Tecnologia C., Ltd.</td><td>331-39-5</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Fresco17</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Pequim InnoChem Science & Tecnologia C., Ltd.</td><td>77-92-9</td><td></td></tr><tr><td>Bancada limpa</td><td>Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd.</td><td>BJ-CD</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ferúlico</td><td>Pequim InnoChem Ciência & Tecnologia C., Ltd.</td><td>1135-24-6</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>CNW Technologies</td><td>64-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Frutose</td><td>Pequim InnoChem Science & Tecnologia C., Ltd.</td><td>57-48-7</td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Pequim InnoChem Ciência e amp Tecnologia C., Ltd.</td><td>59-23-4</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Pequim InnoChem Ciência & Tecnologia C., Ltd.</td><td>56-40-6</td><td></td></tr><tr><td>Moinho de moagem</td><td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.</td><td>JXFSTPRP-24</td><td></td></tr><tr><td>Histidine</td><td>Beijing InnoChem Ciência e Tecnologia C., Ltd.</td><td>71-00-1</td><td></td></tr><tr><td>Padrão interno: 2-Cloro-L-fenilalanina</td><td>Shanghai Hengbai Biotech C., Ltd.</td><td>103616-89-3</td><td></td></tr><tr><td>Leucina</td><td>Pequim InnoChem Ciência & Tecnologia C., Ltd.</td><td>61-90-5</td><td></td></tr><tr><td>Ácido málico</td><td>Pequim InnoChem Science & Tecnologia C., Ltd.</td><td>6915-15-7</td><td></td></tr><tr><td>Manose</td><td>Pequim InnoChem Ciência & Tecnologia C., Ltd.</td><td>3458-28-4</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de Massa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q Foco</td><td></td>Exativo</tr><tr><td>Metanol</td><td>CNW Technologies</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Óptico</td><td>Olympus</td><td>BX43</td><td></td></tr><tr><td>Fenilalanina</td><td>Pequim InnoChem Science & Tecnologia C., Ltd.</td><td>63-91-2</td><td></td></tr><tr><td>Proline</td><td>Beijing InnoChem Ciência & Tecnologia C., Ltd.</td><td>147-85-3</td><td></td></tr><tr><td>Escalas</td><td>Sartorius</td><td>BSA124S-CW</td><td></td></tr><tr><td>Serine</td><td>Beijing InnoChem Science & Tecnologia C., Ltd.</td><td>56-45-1</td><td></td></tr><tr><td>Treonina</td><td>Pequim InnoChem Ciência & Tecnologia C., Ltd.</td><td>72-19-5</td><td></td></tr><tr><td>UHPLC</td><td>Agilent</td><td>1290 UHPLC</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento de Ultrassom</td><td>Shenzhen Leidebang Electronics Co., Ltd.</td><td>PS-60AL</td><td></td></tr><tr><td>Valina</td><td>Pequim InnoChem Ciência & Tecnologia C., Ltd.</td><td>7004-03-7</td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio de quimiotaxis melhorado para a identificação rápida de quimioattractants rizobacterianos em exudates radiculares

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

A identificação de quimiotaxis é muito importante para a pesquisa e aplicação de bactérias promotoras do crescimento da rizofera. Estabelecemos um método simples para identificar rapidamente os quimioattractants que poderiam induzir o movimento quimotactic de bactérias promotoras do crescimento da rizosfera em lâminas de vidro estéreis através de passos simples. A solução bacteriana (OD600 = 0,5) e a solução aquosa quimioattractant estéril foram adicionadas dropwise no slide de vidro em um intervalo de 1 cm. Um loop inoculante foi usado para conectar a solução aquosa quimioattractant à solução bacteriana. O slide foi mantido em temperatura ambiente por 20 minutos no banco limpo. Finalmente, foi coletada a solução aquosa quimioattractant para contagem bacteriana e observação microscópica. Neste estudo, por meio de múltiplas comparações de resultados experimentais, o método superou múltiplas deficiências dos métodos tradicionais de quimioterapia bacteriana. O método reduziu o erro de contagem de placas e encurtou o ciclo experimental. Para a identificação de substâncias quimioattractant, este novo método pode economizar de 2 a 3 dias em comparação com o método tradicional. Além disso, este método permite que qualquer pesquisador complete sistematicamente um experimento de quimiotaxis bacteriana dentro de 1-2 dias. O protocolo pode ser considerado um recurso valioso para entender as interações entre plantas e micróbios.

Foram detectados 584 e 937 metabólitos conhecidos nos índices de íons positivos e negativos, respectivamente. Estudos anteriores mostraram que os quimioattractants são tipicamente ácidos orgânicos, aminoácidos e carboidratos17,18.
Neste estudo, foram selecionados 16 tipos de quimioattractants dos estudos da LC-MS nos exsudatos da rizosfera de arroz para experimentos subsequentes (Tabela 1). Usando o método da placa de ...

Aqui, apresentamos um protocolo de ensaio de quimiotaxis melhorado. O objetivo deste protocolo é reduzir as etapas e custos dos métodos tradicionais de quimioterapia bacteriana e servir como um recurso valioso para a compreensão das interações entre plantas e micróbios.

Um ensaio de quimiotaxis melhorado para a identificação rápida de quimioattractants rizobacterianos em Exudates radiculares

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

O artigo relatou a identificação de quimioattractant de rizobactérias em exudatas raiz usando um ensaio de quimiotaxis melhorado. Os acionamentos radiculares do implante de quimiotaxis são significativos para a colonização das raízes para o crescimento das plantas, promovendo bactérias rizobia e para fornecer as facções úteis de interações entre plantas e micróbios. Muitos métodos foram utilizados para a análise de quimifis bacterianas.Por exemplo, método de placa de natação, cappilary como método, dispositivo de deslizamento microfluido. O ciclo de experiência do método da placa de natação foi longo. O erro experimental do método cappilary foi lançado, o dispositivo de deslizamento microfluido é caro para experimentar.Estabelecemos um método simples para identificar rapidamente o quimioattractant que poderia induzir o movimento quimotactic de bactérias promotoras do crescimento da rizosfera usando lâminas de vidro estéreis sem passos complicados. O método reduziu o erro da contagem da placa e encurtou o ciclo de experimentos. Em relação à identificação de uma substância quimiofos, o novo método poderia economizar de 2 a 3 dias e também reduzir o custo dos materiais experimentais.Distribua aleatoriamente sementes de arroz na cultura de câmara cresce por uma semana e adicione água estéril duas vezes. Selecione as mudas de arroz de tamanho semelhante e plante em um meio líquido de 50 mililitros. Incubar por 48 horas a 22 graus Celsius e em condições sépticas.Exsudates de raiz de arroz serão lançados no médium da Sra. A análise de espectrometria de massa de cromatografia líquida foi realizada utilizando-se o sistema UHPLC. Prepare a solução aquosa quimioattractant para garantir que seja estéril.Filtre a solução de quimioterapia com um filtro de bactérias de 0,22 micrômetro. A solução aquosa quimioattractant foi a única substância obtida dos estudos LCMS dissolvidos na água. A solução de ácido citrix foi usada como exemplo.Todas as ações devem ser realizadas ao lado da lâmpada. Marque a posição média do deslizamento de vidro em um intervalo de 1 centímetro. Certifique-se de que a lâmina de vidro seja esterilizada várias vezes na chama.Na solução de 30 microliter quimioattractant à esquerda do escorregador de vidro garantir que as bactérias foram cultivadas até o estágio logarítmico. Adicione a solução de bactérias de 30 microliter à direita do escorregador de vidro. Esterilizar o laço inoculante várias vezes na chama usando o laço inoculante para conectar a solução aquosa quimioattractant à solução de bactérias e mantê-la em temperatura ambiente por 20 minutos em um banco limpo.Após 20 minutos desconecte a linha de conexão com papel filtro. Certifique-se de que o tubo centrífugo de 1,5 mililitro é estéril. Colete a solução aquosa quimioattractant à esquerda do escorregador de vidro.Transfira a solução para o tubo centrífugo estéril de 1,5 mililitros. Adicione o volume apropriado do corante frontal da célula ao tubo centrifutado. Após 2 minutos, colete os líquidos permitidos para contagem de bactérias e observação microscópica com uma câmara de contagem de sangue.Determine o número de microrganismos viáveis atraídos usando uma equação a seguir. Um RCI mais alto indica uma forte reação ao quimioattractant. Os resultados indicaram que o ácido cítrico e o ácido fálico têm os maiores índices de quimiotaxis.Os resultados do novo método de ensaio de quimiotaxis escreveram que a concentração bacteriana de ácido cátrico, ácido fálico e experimentos de Galactose foram significativamente maiores do que os do grupo controle e controle positivo. O ácido cítrico escreveu a quimiotaxis mais forte. Os resultados experimentais estavam de acordo com os resultados dos métodos tradicionais.Este protocolo de vídeo pode ser apresentado como um recurso valioso para o esclarecimento das interações entre plantas e micróbios.

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Research

JoVE Journal

Biology

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