Name: Usando coloração vermelha de alizarina para detectar perda óssea quimicamente induzida em larvas de peixe-zebra (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Aprenda a usar a coloração vermelha de alizarina para detectar toxicidade óssea induzida por produtos químicos em larvas de peixe-zebra. Este método permite avaliar alterações na mineralização óssea causadas por acetato de chumbo.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81872646; 81811540034; 81573173) e pelo Programa Acadêmico Prioritário de Desenvolvimento das Instituições de Ensino Superior de Jiangsu (PAPD).

Todos os procedimentos de animais descritos aqui foram revisados e aprovados pelo Instituto de Cuidados com Animais do Comitê de Ética da Universidade de Soochow.
1. Criação de peixes e colheita de embriões 14
<ol><li>Alimentar os peixes três vezes por dia; Assegurar que o peixe-zebra é mantido a 28,5 ± 0,5 °C com um ciclo claro/escuro de 14:10 h.</li>
	<li>Separe os peixes adultos machos e fêmeas por placas de isolamento em tanques de desova em uma proporção de 2: 1 macho para fêmea à noite.</li>
	<li>Na manhã seguinte, retire as placas de isolamento às 9:00 da manhã e colete os embriões 2 h depois.</li>
	<li>Colocar os embriões numa incubadora bioquímica mantida a 28,5 °C antes da experiência.</li>
</ol>2. Exposição química
<ol><li>Prepare o estoque-mãe: pese o acetato de chumbo tri-hidratado (5 g) e dissolva-o em água ultrapura (50 mL) com agitação. CUIDADO: A PbAc é tóxica. Use máscaras de poeira adequadas, roupas de proteção e luvas. Realize o experimento sob um exaustor.</li>
	<li>Selecionar e distribuir aleatoriamente embriões de peixe-zebra em placas limpas de 6 poços (30 embriões por poço em 3 mL de água de reprodução de peixe-zebra; ver Tabela 1 para sua composição). Tratar os embriões com PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) de 2 a 120 h após a fecundação (hpf). NOTA: As concentrações de PbAc foram escolhidas de acordo com os experimentos de determinação da faixa de dose. Os resultados mostraram que a CL50 de acetato de chumbo em embriões de peixe-zebra foi de 41,044 mg/L a 120 hpf. Assim, a maior concentração foi ajustada para metade da CL50 e uma série de soluções preparadas por diluição de 2 vezes.</li>
	<li>Alimente as larvas duas vezes ao dia a partir de 5 dias após a fertilização (dpf). Manter os embriões de peixe-zebra a 28,5 ± 0,5 °C com um ciclo claro/escuro de 14:10 h.</li>
	<li>Refrescar o meio sem Pb (água de reprodução de peixe-zebra) a cada 24 h até 9 dpf. NOTA: Após a conclusão dos experimentos, todas as soluções contendo chumbo foram despejadas em um tanque líquido designado e tratadas pelo centro de gerenciamento de experimentos.</li>
</ol>3. Coloração vermelha de alizarina
NOTA: Use máscaras de poeira, roupas de proteção e luvas adequadas durante todo o processo de coloração. As composições de todas as soluções são apresentadas na Tabela 1.
<ol><li>Etapas específicas de coloração NOTA: O processo de tingimento foi realizado em placa de 24 poços à temperatura ambiente. Depois que cada solução foi adicionada, coloque a placa de 24 poços na mesa de agitação colocada a uma velocidade baixa.<ol><li>Remova 10 larvas de peixe-zebra aleatoriamente de cada grupo a 9 dpf e fixe o peixe em 1 mL de solução salina tamponada com paraformaldeído a 2%/1x fosfato por 2 h.</li>
		<li>Decantar a solução e lavar as larvas de peixe-zebra com 100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2 durante 10 min.</li>
		<li>Decante a solução e incubar as larvas nas seguintes soluções por 5 min cada para descoloração: solução de etanol anidro (EtOH) (80% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2, 50% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH=7,5) e 25% EtOH/100mM Tris-HCl (pH=7,5).</li>
		<li>Decantar a solução, remover o pigmento por branqueamento com uma solução constituída por 3% H2O2 e 0,5% KOH, e observar uma vez a cada 10 min até que o pigmento seja completamente removido.</li>
		<li>Lave as larvas de peixe-zebra várias vezes com 25% de glicerina / 0,1% de KOH por 10 min cada até que não haja bolhas. NOTA: É importante evitar bolhas; caso contrário, as bolhas no corpo do peixe-zebra aparecerão como um campo de visão preto sob o microscópio, o que afetará as observações e a análise quantitativa.</li>
		<li>Coloração das larvas por imersão em 1 mL de alizarina a 0,01% por 50 min.</li>
		<li>Decantar a solução e adicionar 1mL de glicerina a 50%/KOH a 0,1% por 10 min para limpar o fundo. Armazene os peixes em fresco 50% de glicerina / 0,1% de KOH para observação subsequente.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Aquisição de imagens
<ol><li>Transfira uma larva para a lâmina de vidro de cada vez, mantendo a larva no meio da gota líquida.</li>
	<li>Observe as larvas sob um microscópio estéreo.</li>
	<li>Ligue a câmera, abra o software (consulte a Tabela de materiais) e mantenha as configurações padrão.</li>
	<li>Clique em AE e escolha um tempo de exposição apropriado (60 ms neste experimento) para obter a melhor imagem.</li>
	<li>Capture todas as imagens nas mesmas configurações. Salve as imagens em formato .tif para análise posterior.</li>
</ol>5. Análise de imagem
Observação : consulte o arquivo suplementar para obter um exemplo com um conjunto de gráficos de exemplo para análise de imagem.
<ol><li>Clique duas vezes no ícone ImageJ e analise as imagens salvas na etapa 4.5.<ol><li>Clique em Arquivo | Abra para abrir as imagens salvas na etapa 4.5.</li>
		<li>Clique na imagem | Digite, selecione 8 bits.</li>
		<li>Clique em Editar | Inverter.</li>
		<li>Clique em Analisar | Calibrar, selecione OD não calibrado na interface pop-up, marque Calibração global no canto inferior esquerdo da interface inferior e clique em OK.</li>
		<li>Clique em Analisar | Definir escala | Clique para remover escala na interface pop-up, marque Global abaixo e clique em OK.</li>
		<li>Clique em Analisar | Defina Medidas, selecione a área do item na interface pop-up, marque o limite Limite abaixo (para medir apenas o intervalo selecionado) e clique em OK.</li>
		<li>Clique na imagem | Ajustar| Limite, deslize o controle deslizante no meio da interface pop-up para selecionar o limite apropriado (altere o limite para cada imagem) para que todos os destinos a serem testados em uma imagem sejam selecionados e clique em Definir.</li>
		<li>Clique em Analisar | Medida. Registre as datas de cada grupo.</li>
	</ol></li>
	<li>Use ANOVA one-way seguida do teste de comparação múltipla de Tukey para analisar as diferenças e defina o nível de significância em p < 0,001 (***).</li>
</ol>

<ol><li>Compston, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+registration+of+agents+for+prevention+and+treatment+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis%3A+an+update+from+the+Group+for+the+Respect+of+Ethics+and+Excellence+in+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporosis+International%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science.</a> Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).</li>
<li>Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+preventing+bone+loss+induced+by+aromatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors.</a> Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).</li>
<li>Kataba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+exposure+to+environmentally+relevant+lead+levels+induces+oxidative+stress+and+neurobehavioral+alterations+in+larval+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio).</a> Aquatic Toxicology. 227, 105607(2020).</li>
<li>Morin, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+fracture+prevalence+and+in+bone+mineral+density+between+Chinese+and+White+Canadians%3A+the+Canadian+Multicentre+Osteoporosis+Study+%28CaMos%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Osteoporosis%22%5BJournal%5D)">Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos).</a> Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147(2020).</li>
<li>Lee, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lead+poisoning+magnifies+bone+detrimental+effects+in+an+ovariectomized+rat+model+of+postmenopausal+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis.</a> Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).</li>
<li>Theppeang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+bone+mineral+density+and+lead+levels+in+blood%2C+tibia%2C+and+patella+in+urban-dwelling+women%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women.</a> Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoporosis+in+a+Chinese+population+due+to+occupational+exposure+to+lead%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Industrial+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead.</a> American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).</li>
<li>Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+and+bone+mass+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Exercise and bone mass in adults.</a> Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).</li>
<li>Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+structure+and+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Collagen structure and functional implications.</a> Micron. 32 (3), 251-260 (2001).</li>
<li>Kelly, W. L., Bryden, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+differential+stain+for+cartilage+and+bone+in+whole+mount+preparations+of+mammalian+fetuses+and+small+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates.</a> Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).</li>
<li>Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+high+content%2C+in+vivo+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+as+a+model+to+assess+chemical+toxicity+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Fish as a model to assess chemical toxicity in bone.</a> Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GH%2FIGF+axis+in+arsenite-induced+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos.</a> Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820(2020).</li>
<li>Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+emerging+model+for+osteoporosis%3A+a+primary+testing+platform+for+screening+new+osteo-active+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, 6(2019).</li>
<li>Charles, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+quantitative+micro-computed+tomographic+analysis+in+zebrafish+to+define+gene+function+during+skeletogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis.</a> Bone. 101, 162-171 (2017).</li>
<li>Hammond, C. L., Moro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+transgenic+reporters+to+visualize+bone+and+cartilage+signaling+during+development+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 91(2012).</li>
<li>Bensimon-Brito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+in+vivo+staining+with+alizarin+red+S--a+valuable+approach+to+analyse+zebrafish+skeletal+mineralization+during+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Revisiting in vivo staining with alizarin red S--a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration.</a> BMC Developmental Biology. 16, 2(2016).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

O peixe-zebra é um modelo adequado para o estudo da doença metabólica óssea. Em comparação com os modelos de roedores, os modelos de peixe-zebra são relativamente rápidos de estabelecer, e a medição da gravidade da doença é mais fácil. Em larvas de peixe-zebra do tipo selvagem, a mineralização do esqueleto da cabeça ocorre a 5 dpf e do esqueleto axial a 7 dpf15. Assim, ossos cranianos como PS, OP, CB e NC estão bem desenvolvidos a 9 dpf. Depois que as larvas foram completamente descoradas e branqu...

Estudos recentes têm confirmado que a osteoporose decorrente de glicocorticoides, inibidores da aromatase e consumo excessivo de álcool é comum 1,2. O chumbo (Pb) é um metal tóxico encontrado em plantas, solo e ambientes aquáticos3. Embora os efeitos adversos do Pb no corpo humano tenham atraído muita atenção, seu impacto irreversível no osso precisa ser investigado mais a fundo. A intoxicação por chumbo causa uma gama diversificada de alterações patológicas no esqueleto em desenvolvimento e no adulto, afetando as atividades normais da vida. Estudos encontraram associação entre exposição crônica ao Pb e danos ósseos4, incluindo estruturas ósseas prejudicadas5,6, redução da densidade mineral óssea e até aumento do risco de osteoporose7.
O tecido mineralizado é de grande importância para a resistência óssea8, e a deposição da matriz de mineralização óssea é um índice crítico de formação óssea9. O vermelho de alizarina tem alta afinidade por íons cálcio, e a coloração vermelha de alizarina é um procedimento padrão para avaliar a formação óssea10. De acordo com este método, o tecido mineralizado é manchado de vermelho, enquanto todos os outros tecidos permanecem transparentes. A área corada é então quantificada por análise de imagem digital11.
O peixe-zebra é um importante organismo modelo amplamente utilizado na descoberta de medicamentos e modelos de doenças. Estudos genéticos em peixes-zebra e humanos demonstraram semelhanças nos mecanismos subjacentes da morfogênese esquelética em nível molecular12. Além disso, o rastreamento de fármacos ou biomoléculas de alto rendimento é mais viável em grandes embreagens de peixe-zebra do que em modelos murinos, facilitando o estudo mecanicista de moléculas proosteogênicas ou osteotóxicas13. A coloração diferencial do esqueleto em toto10 é frequentemente usada no estudo da displasia esquelética em pequenos vertebrados e fetos de mamíferos. A coloração vermelha de alizarina foi realizada para investigar a toxicidade do desenvolvimento ósseo de produtos químicos em larvas de peixe-zebra. Aqui, usamos o chumbo como exemplo para descrever um protocolo para detectar defeitos ósseos induzidos por acetato de chumbo em larvas de peixe-zebra.

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl (pH = 7,5)</td> <td>Solarbio, Pequim, China</td><td>21</td><td>para deter</td></tr><tr><td>4% de solução de fixação de paraformaldeído</td><td>BBI, Xangai, China</td><td>14</td><td>fixação de tecidos</td></tr><tr><td>10x PBS buffer</td><td>BBI, Xangai, China</td><td>15</td><td>para fixação</td></tr><tr><td>de 35% H 2 O2</td> <td>Yonghua, Jiangsu, China</td><td>8</td><td>removendo pigmento</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga de 50 mL</td><td>AKX, Jiangsu, China</td><td>4</td><td></td></tr><tr><td>95% de etanol anidro</td><td>Enox, Jiangsu, China</td><td>2</td><td>destaining</td></tr><tr><td>Alizarin red (Pureza 99,5%)</td> <td>Solarbio, Beijing, China</td><td>1</td><td>coloração</td></tr><tr><td>Incubadora bioquímica</td><td>Yiheng, Shanghai, China</td><td>3</td><td>criação de embriões de peixe-zebra</td></tr><tr><td>Balança eletrônica</td><td>Sartorius, Alemanha</td><td>5</td><td>pesando as matérias-primas sólidas</td></tr><tr><td>Glicerina (Pureza 99,5%)</td><td>BBI,Xangai,China</td><td>7</td><td>armazenando o peixe manchado</td></tr><tr><td>ImageJ (software)</td><td>EUA</td><td>9</td><td>análise digital</td></tr><tr><td>KOH (Pureza 99,9%)</td><td>Sigma,América</td><td>10</td><td>solução de branqueamento</td></tr><tr><td>Trihidrato de acetato de chumbo (Pureza 99,5%)</td><td>Aladdin,Shanghai,China</td><td>11</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (Pureza 99,9%)</td><td>Aladdin,Shanghai,China</td><td>12</td><td>solução de limpeza</td></tr><tr><td>NIS-Elements F (software)</td><td>Nikon, Japão</td><td>13</td><td>observando e tirando fotos</td></tr><tr><td>Pipe</td><td>AKX, Jiangsu, China</td><td>18</td><td>remoção de embriões e</td></tr><tr><td>placas de solução (24 poços)</td><td>Corning,América</td><td>17</td><td>recipiente para coloração de placas de embriões</td></tr><tr><td>(6 poços)</td><td>Corning,América</td><td>recipiente 16</td><td>para a criação de embriões</td></tr><tr><td>Agitando a tabela</td><td>Beyotime, China</td><td>19</td><td>que mistura a solução</td></tr><tr><td>Microscópio estereofónico</td><td>Nikon, Japão</td><td>20</td><td>que observa e que toma fotos</td></tr><tr><td>Zebrafish</td><td>Centro experimental do experimento do peixe-zebra da universidade de Soochow, Suzhou, China</td><td>22</td><td>animal experimental</td></tr></tbody></table>

usando coloração vermelha de alizarina para detectar perda óssea quimicamente induzida em larvas de peixe-zebra

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

A perda óssea induzida quimicamente devido à exposição ao chumbo (Pb) pode desencadear uma série de impactos adversos nos sistemas esqueléticos humanos e animais. No entanto, os efeitos e mecanismos específicos no peixe-zebra permanecem obscuros. O vermelho de alizarina tem uma alta afinidade por íons de cálcio e pode ajudar a visualizar o osso e ilustrar a massa mineral esquelética. Neste estudo, nosso objetivo foi detectar a perda óssea induzida por acetato de chumbo (PbAc) em larvas de peixe-zebra utilizando a coloração vermelha de alizarina. Embriões de peixe-zebra foram tratados com uma série de concentrações de PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) entre 2 e 120 h após a fertilização. A coloração esquelética de montagem inteira foi realizada em larvas aos 9 dias após a fertilização, e a área total corada foi quantificada usando o software ImageJ. Os resultados indicaram que os tecidos mineralizados foram corados em vermelho, e a área corada diminuiu significativamente no grupo de exposição ao PbAc, com uma mudança dose-dependente na mineralização óssea. Este trabalho apresenta um protocolo de coloração para investigar alterações esqueléticas em defeitos ósseos induzidos por PbAc. O método também pode ser usado em larvas de peixe-zebra para a detecção de perda óssea induzida por outros produtos químicos.

A coloração vermelha de alizarina é um método sensível e específico para medir mudanças na mineralização óssea em larvas de peixe-zebra. Neste estudo, observamos que a PbAc teve efeitos adversos sobre as larvas de peixe-zebra, incluindo morte, malformação, diminuição da frequência cardíaca e encurtamento do comprimento corporal. Além disso, as áreas do esqueleto mineral de larvas de peixe-zebra foram avaliadas para examinar a perda óssea induzida por PbAc. A 9 dpf (Figura 1A), muitos ossos d...

Aqui, usamos a coloração vermelha de alizarina para mostrar que a exposição ao acetato de chumbo causa uma mudança na massa óssea nas larvas de peixe-zebra. Este método de coloração pode ser adaptado para a investigação da perda óssea em larvas de peixe-zebra induzida por outros tóxicos perigosos.

Usando coloração vermelha de alizarina para detectar perda óssea quimicamente induzida em larvas de peixe-zebra

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

Este método pode ajudar a detectar a toxicidade óssea induzida por produtos químicos no peixe-zebra. A coloração vermelha de alizarina do tecido fixo gera um registro permanente de alterações esqueléticas que podem facilitar comparações de vários espécimes. Esta técnica pode ser útil para estudar a osteoporose no modelo do peixe-zebra, uma vez que uma das características da osteoporose é a diminuição da massa óssea.Remova 10 larvas de peixe-zebra aleatoriamente de cada grupo aos nove dias após a fertilização e fixe o peixe em um mililitro de aldeído paraforme a 2% e 1X PBS por duas horas. Decantar a solução e lavar a larva de peixe-zebra utilizando 100 milimolares Tris HCL com um pH de 7,5 ou 10 milimolares de cloreto de magnésio. Para descoloração, decantar a solução e incubar a larva por cinco minutos em uma série de soluções, conforme descrito no manuscrito.Após a incubação final, decantar a solução e remover o pigmento por branqueamento com uma solução constituída por peróxido de hidrogénio a 3% e hidróxido de potássio a 0,5%. Observe uma vez a cada 10 minutos até que o pigmento seja completamente removido. Lave a larva do peixe-zebra várias vezes com 25% de glicerina, hidróxido de potássio a 0,1% por 10 minutos cada até que não haja bolhas.Manchar a larva por imersão em um mililitro de 0,01% Alizarina. Decante a solução e adicione um mililitro de 50% de glicerina ou hidróxido de potássio a 0,1% para limpar o fundo. Conservar o peixe em 50% de glicerina fresca ou hidróxido de potássio a 0,1% para observação subsequente.Transfira uma larva de cada vez para a lâmina de vidro mantendo a larva no meio da gota líquida. Observe a larva sob um microscópio estéreo. Ligue a câmera.Abra o software e mantenha as configurações padrão. Clique em AE e escolha um tempo de exposição adequado para obter a melhor imagem. Capture todas as imagens nas mesmas configurações.Salve as imagens no formato dot tiff para análise posterior. Clique duas vezes no ícone imageJ. Para analisar as imagens salvas, clique em arquivo, em seguida, abra, em seguida, clique em imagem, em seguida, digite e selecione oito bits.Clique em editar e inverta. Clique em analisar e, em seguida, calibre. Selecione OD não calibrado na interface pop-up.Verifique a calibração global no canto inferior esquerdo da interface inferior e clique em OK. Clique em analisar, defina a escala e, em seguida, remova a escala. Confira global abaixo, e clique em OK.Clique em analisar e, em seguida, defina as medições. Selecione a área do item na interface pop-up. Verifique o limite para o limite abaixo para medir apenas o intervalo selecionado e clique em OK.Clique na imagem, ajuste, depois limite e deslize o controle deslizante no meio da interface pop-up. Para selecionar o limite apropriado para que todos os destinos a serem testados em uma imagem sejam selecionados. E clique em definir.Clique em analisar, em seguida, medir, salvar as datas. A coloração vermelha de alizarina é um método sensível e específico para medir mudanças na mineralização óssea em larvas de peixe-zebra. Aos nove dias após a fertilização, muitos ossos do esqueleto da cabeça, como parasfenóide, opercular, ceratobranquial e notocordina são mineralizados e, portanto, corados de vermelho.Em contraste, estruturas não ósseas, como otólitos, parecem pretas marrons. A análise digital realizada para quantificar a área total corada, mostrou uma diminuição significativa na área corada para os grupos de tratamento com acetato de chumbo de 10 e 20 miligramas por litro. As alterações na mineralização óssea mostraram dependência da dose.Para um melhor efeito de coloração e observação, é importante remover o pigmento original das larvas de peixe-zebra e remover as bolhas após o branqueamento.

using-alizarin-red-staining-to-detect-chemically-induced-bone-loss

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo demonstra uma técnica de coloração para detectar a extensão da mineralização ou deposição de cálcio em osteoblastos primários cultivados usando corante vermelho de alizarina.

Coloração com vermelho de alizarina: uma técnica para visualizar a mineralização por osteoblastos cultivados

Neste vídeo, descrevemos um método para a detecção de depósitos de cálcio secretados por osteoblastos usando um corante aniônico, Vermelho de Alizarina S. Os osteoblastos cultivados são primeiro corados e, em seguida, o corante é recuperado para quantificação colorimétrica dos depósitos de cálcio ou do grau de mineralização dos osteoblastos.

Ensaio de mineralização in vitro: um método colorimétrico para quantificar depósitos de cálcio osteoblástico em substituto de enxerto ósseo por coloração e extração de vermelho de alizarina S

Porque muitos modelos de peixe-zebra de doenças neurológicas e não neurológicas são estudadas no peixe adulto, em vez de o embrião / larvas, foi desenvolvido um ensaio quantitativo regenerativa linha lateral, que pode ser aplicada aos modelos de doenças de peixes-zebra adultos. O ensaio envolveu a resolução neuromasto 1) e 2) os níveis de células de cabelo individuais.

Um ensaio para a lateral de Regeneração de Linha em Zebrafish Adulto

Neste estudo, descrevemos um método simples para realizar a análise do Corante Azul de Evans (EBD) em larvas de peixe-zebra.  Esta técnica é uma ferramenta poderosa para a caracterização da integridade do músculo esquelético e delineamento de modelos de distrofia muscular de peixe-zebra, e é um método valioso para o desenvolvimento de novas terapêuticas.

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

Pequenos peixes de laboratório tornaram-se modelos populares para pesquisa óssea sobre os mecanismos subjacentes aos distúrbios ósseos humanos e para a triagem de drogas moduladoras ósseas. Neste relato, descrevemos um protocolo para avaliar o efeito do alendronato em células ósseas em larvas de medaka com lesões osteoporóticas.

Tratamento de drogas e<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Osteoblast-osteoclastos Interações em um modelo de Medaka Peixe Osteoporose

O objetivo do presente protocolo é alterar a penetrância de letais esqueléticos fenótipos mutantes no zebrafish por reprodução seletiva. Letais mutantes não podem ser cultivados até a idade adulta e se criados, portanto este protocolo descreve um método de controle e selecionando penetrância através de várias gerações por testes de progênie.

Deslocando o Zebrafish letal esquelético mutante penetrância por teste de progênie

Aqui, descrevemos 3 modelos de lesão de zebrafish adultos e seu uso combinado com tratamento de drogas imunossupressoras. Nós fornecemos orientação nas imagens de regenerar tecidos e na detecção de mineralização óssea nele.

Modelos de lesão adulto Zebrafish para estudar os efeitos de prednisolona na regeneração de tecido ósseo

Este protocolo descreve a coleta e visualização de escamas elasmoides de zebrafish durante a regeneração in vivo . Além disso, é apresentado o cultivo ex vivo dessas cochonilhas por até 7 dias após a colheita.

Regeneração de Escamas de Zebrafish em Toto e Cultura Ex Vivo de Escamas

Este protocolo oferece um método para estudar a dinâmica celular usando uma técnica simples de cultura in vitro . Ele oferece uma oportunidade para pesquisadores e educadores de peixes-zebra estudarem processos celulares, como aqueles relacionados à homeostase óssea e biologia celular básica, visualizando núcleos fluorescentes e células apoptóticas dentro das escamas.

Técnica de cultivo in vitro para estudo da dinâmica celular em escamas de peixe-zebra

Este protocolo descreve uma abordagem de ablação a laser de dois fótons realizada em larvas de peixe-zebra, que serve como modelo para estudar a regeneração óssea e os efeitos da resposta imune à ablação.

Ablação mediada por laser de dois fótons de osteoblastos em larvas de peixe-zebra em desenvolvimento

O protocolo descrito aqui apresenta um procedimento simples e fácil de seguir para coloração e dissecação de cartilagens craniofaciais em uma larva de peixe-zebra com 5 dias de idade. Ele pode ser usado para estudar a anatomia, a forma e o tamanho dessas estruturas sob várias condições de desenvolvimento.

Dissecção de tecidos craniofaciais de peixe-zebra após coloração com azul de Alcian

Aprenda a usar a coloração vermelha de alizarina para detectar toxicidade óssea induzida por produtos químicos em larvas de peixe-zebra. Este método permite avaliar alterações na mineralização óssea causadas por acetato de chumbo.

Usando coloração vermelha de alizarina para detectar perda óssea quimicamente induzida em larvas de peixe-zebra

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