Usando coloração vermelha de alizarina para detectar perda óssea quimicamente induzida em larvas de peixe-zebra
28 de dezembro de 2021
Aqui, usamos a coloração vermelha de alizarina para mostrar que a exposição ao acetato de chumbo causa uma mudança na massa óssea nas larvas de peixe-zebra. Este método de coloração pode ser adaptado para a investigação da perda óssea em larvas de peixe-zebra induzida por outros tóxicos perigosos.
Este método pode ajudar a detectar a toxicidade óssea induzida por produtos químicos no peixe-zebra. A coloração vermelha de alizarina do tecido fixo gera um registro permanente de alterações esqueléticas que podem facilitar comparações de vários espécimes. Esta técnica pode ser útil para estudar a osteoporose no modelo do peixe-zebra, uma vez que uma das características da osteoporose é a diminuição da massa óssea.
Remova 10 larvas de peixe-zebra aleatoriamente de cada grupo aos nove dias após a fertilização e fixe o peixe em um mililitro de aldeído paraforme a 2% e 1X PBS por duas horas. Decantar a solução e lavar a larva de peixe-zebra utilizando 100 milimolares Tris HCL com um pH de 7,5 ou 10 milimolares de cloreto de magnésio. Para descoloração, decantar a solução e incubar a larva por cinco minutos em uma série de soluções, conforme descrito no manuscrito.
Após a incubação final, decantar a solução e remover o pigmento por branqueamento com uma solução constituída por peróxido de hidrogénio a 3% e hidróxido de potássio a 0,5%. Observe uma vez a cada 10 minutos até que o pigmento seja completamente removido. Lave a larva do peixe-zebra várias vezes com 25% de glicerina, hidróxido de potássio a 0,1% por 10 minutos cada até que não haja bolhas.
Manchar a larva por imersão em um mililitro de 0,01% Alizarina. Decante a solução e adicione um mililitro de 50% de glicerina ou hidróxido de potássio a 0,1% para limpar o fundo. Conservar o peixe em 50% de glicerina fresca ou hidróxido de potássio a 0,1% para observação subsequente.
Transfira uma larva de cada vez para a lâmina de vidro mantendo a larva no meio da gota líquida. Observe a larva sob um microscópio estéreo. Ligue a câmera.
Abra o software e mantenha as configurações padrão. Clique em AE e escolha um tempo de exposição adequado para obter a melhor imagem. Capture todas as imagens nas mesmas configurações.
Salve as imagens no formato dot tiff para análise posterior. Clique duas vezes no ícone imageJ. Para analisar as imagens salvas, clique em arquivo, em seguida, abra, em seguida, clique em imagem, em seguida, digite e selecione oito bits.
Clique em editar e inverta. Clique em analisar e, em seguida, calibre. Selecione OD não calibrado na interface pop-up.
Verifique a calibração global no canto inferior esquerdo da interface inferior e clique em OK. Clique em analisar, defina a escala e, em seguida, remova a escala. Confira global abaixo, e clique em OK.
Clique em analisar e, em seguida, defina as medições. Selecione a área do item na interface pop-up. Verifique o limite para o limite abaixo para medir apenas o intervalo selecionado e clique em OK.
Clique na imagem, ajuste, depois limite e deslize o controle deslizante no meio da interface pop-up. Para selecionar o limite apropriado para que todos os destinos a serem testados em uma imagem sejam selecionados. E clique em definir.
Clique em analisar, em seguida, medir, salvar as datas. A coloração vermelha de alizarina é um método sensível e específico para medir mudanças na mineralização óssea em larvas de peixe-zebra. Aos nove dias após a fertilização, muitos ossos do esqueleto da cabeça, como parasfenóide, opercular, ceratobranquial e notocordina são mineralizados e, portanto, corados de vermelho.
Em contraste, estruturas não ósseas, como otólitos, parecem pretas marrons. A análise digital realizada para quantificar a área total corada, mostrou uma diminuição significativa na área corada para os grupos de tratamento com acetato de chumbo de 10 e 20 miligramas por litro. As alterações na mineralização óssea mostraram dependência da dose.
Para um melhor efeito de coloração e observação, é importante remover o pigmento original das larvas de peixe-zebra e remover as bolhas após o branqueamento.
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Visão Geral
Este estudo utiliza a coloração com alizarina vermelha para demonstrar que a exposição ao acetato de chumbo resulta em alterações na massa óssea de larvas de peixe-zebra. O método é adaptável para investigar a perda óssea causada por diversos toxicantes perigosos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Toxicologia
- Biologia do Desenvolvimento
Contexto
- A coloração com alizarina vermelha é uma técnica utilizada para visualizar estruturas esqueléticas.
- O peixe-zebra é um organismo modelo para o estudo do desenvolvimento ósseo e da toxicidade.
- O acetato de chumbo é conhecido por ter efeitos tóxicos sobre sistemas biológicos.
- A osteoporose caracteriza-se pela diminuição da massa óssea, o que pode ser modelado no peixe-zebra.
Objetivo do Estudo
- Avaliar o impacto do acetato de chumbo na massa óssea de larvas de peixe-zebra.
- Estabelecer um método para detectar toxicidade óssea induzida por substâncias químicas.
- Facilitar comparações de alterações esqueléticas entre espécimes.
Métodos Utilizados
- Coloração com vermelho de alizarina em tecido de peixe-zebra fixado.
- Fixação de larvas de peixe-zebra em paraformaldeído e PBS.
- Lavagem das larvas com Tris HCl ou cloreto de magnésio.
- Procedimentos de descoloração conforme descritos no manuscrito.
Resultados Principais
- A exposição ao acetato de chumbo resultou em alterações observáveis na massa óssea.
- O método de coloração forneceu um registro permanente das alterações esqueléticas.
- Os resultados apoiam o uso do peixe-zebra como modelo para o estudo da osteoporose.
- A metodologia permite a investigação de outros toxicantes perigosos.
Conclusões
- A coloração com vermelho de alizarina é eficaz para avaliar a toxicidade óssea em peixes-zebra.
- O estudo destaca o potencial do peixe-zebra na pesquisa toxicológica.
- Pesquisas futuras podem ampliar o conhecimento sobre os efeitos de diversos tóxicos na saúde óssea.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a detecção precoce da perda óssea induzida quimicamente em larvas de peixe-zebra, auxiliando na redução de riscos mecanicistas em toxicologia e na validação de alvos em vias de saúde esquelética. Ao quantificar alterações no tecido mineralizado por meio da coloração com alizarina vermelha, fornece uma leitura reprodutível e dependente da dose para avaliar os efeitos de compostos na mineralização óssea. A abordagem oferece confiança preditiva na otimização de fármacos e na triagem pré-clínica de segurança para compostos com atividade sobre o osso.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas à mineralização óssea e à integridade esquelética.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica ao fornecer um registro permanente e quantificável de alterações esqueléticas em diferentes espécimes.
- Valor Preditivo: Facilita a triagem de portfólios ao identificar compostos com efeitos dependentes da dose sobre a massa óssea no início da descoberta.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece medidas quantitativas baseadas em limiares da área corada para comparação objetiva entre grupos experimentais.
- Valor Operacional: Padroniza protocolos de preparação de amostras e aquisição de imagens para garantir reprodutibilidade e escalabilidade em formatos de múltiplas poças.
- Prontidão do Ensaio: Gera saídas digitais compatíveis com a análise no ImageJ, permitindo triagem de alto conteúdo de fenótipos de toxicidade óssea.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Modela respostas esqueléticas relevantes ao ser humano frente a toxicantes, apoiando o alinhamento translacional de biomarcadores para perda óssea.
- Valor Operacional: Conecta fluxos de descoberta e pré-clínicos ao fornecer um ensaio baseado em vertebrados conservados para mineralização óssea.
- Mitigação de Riscos: Orienta decisões de avanço com ajuste de risco ao detectar sinais de perda óssea antes dos estudos em mamíferos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos promissores e a avaliação pré-clínica de segurança, especialmente para compostos com efeitos potenciais fora do alvo sobre os sistemas esqueléticos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre os efeitos químicos nas vias de desenvolvimento e mineralização óssea em um modelo vertebrado.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios e leituras quantitativas para detectar alterações dependentes da dose na área corada.
- Análises: Fornece medições de área calibradas e baseadas em limiar, permitindo comparação estatística da mineralização óssea entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao modelar respostas esqueléticas conservadas a tóxicos em larvas de peixe-zebra.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para triagem de diversas bibliotecas químicas quanto ao risco de toxicidade óssea.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas vias relacionadas ao osso.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade por meio de etapas padronizadas de fixação, coloração e quantificação digital.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de prosseguir ou não ao fornecer sinais precoces e quantitativos de risco de perda óssea.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao identificar riscos de toxicidade esquelética antes de investimentos significativos.
Considerações de Implementação
- Exige experiência no manejo de peixes-zebra, histologia e imagens fluorescentes/colorimétricas.
- Depende de microscopia estereoscópica e software de análise de imagens (por exemplo, ImageJ) para quantificação padronizada.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de coloração e definições de limiar para resultados reproduzíveis.
- Envolve considerações de adaptação ao ser estendido a outros sistemas modelo ou classes químicas além do acetato de chumbo.
- Limitado pela necessidade de etapas de remoção de pigmentos e clareamento do fundo para garantir detecção precisa do sinal.
