Name: Isolamento de Células Endoteliais Primárias de Pulmão de Camundongo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Aprenda a isolar células endoteliais primárias de pulmão de camundongo com alta pureza usando imunobeads magnéticos. Este protocolo reprodutível preserva o rendimento celular e permite estudos de função endotelial in vitro.

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Este trabalho foi apoiado por NIH T32GM008440 (JH/EW) e NIH R01AI058106 (JH). Agradecemos o UCSF Parnassus Flow Cytometry Core (RRID:SCR_018206) apoiado em parte pelo Grant NIH P30 DK063720 e pelo NIH S10 Instrumentation Grant S10 1S10OD021822-01.

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia em São Francisco. Filhotes de camundongos neonatais machos C57BL/6 (idade 5-7 dias) foram usados para o estudo. Todo o protocolo leva de 7 a 10 dias (Figura 1).
1. Preparo do meio de células endoteliais
<ol><li>Preparar o meio basal: Meio Águia Modificado de Dulbecco com 4.500 mg/L de glicose e 4 mM de L-Glutamina (DMEM) suplementado com 20% (v/v) de soro fetal bovino inativado pelo calor, 100 U/100 μg/mL de penicilina/estreptomicina e 25 mM de HEPES (ver Tabela de Materiais). Filtro estéril com filtro de 22 μM. Conservar o meio basal a 4 °C e utilizá-lo no prazo de um mês após a preparação.</li>
	<li>Preparar o meio completo: Meio basal suplementado com 100 μg/mL de heparina, 100 μg/mL de suplemento de crescimento de células endoteliais, 1x aminoácidos não essenciais e 1 mM de piruvato de sódio (ver Tabela de Materiais). Filtro estéril com filtro de 22 μM. Conservar a 4 °C e utilizar no prazo de um mês após a preparação.</li>
</ol>2. Pré-revestimento de esferas magnéticas anti-rato13
<ol><li>Fazer 50 mL de tampão de lavagem de contas: Solução tamponada com fosfato (PBS) suplementada com albumina de soro bovino (BSA) a 0,1% (p/v). Filtro estéril com filtro de 22 μM e conservar a 4 °C e utilizar no prazo de um mês após a preparação.</li>
	<li>Vórtice as esferas magnéticas por alguns segundos para ressuspender as contas e pipetar 50 μL das contas (2 x 107 contas) em dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, um para CD-31 e outro para CD-102 (ver Tabela de Materiais). Adicione 1 mL de tampão de lavagem de contas e misture bem. NOTA: Todos os volumes mencionados foram utilizados para isolar células endoteliais de 3-4 filhotes neonatais de camundongos (5-7 dias de idade). CD-31 e CD-102 são os marcadores de superfície celular endotelial utilizados para a seleção de imunoesferas magnéticas.</li>
	<li>Coloque os tubos num separador magnético e retire o sobrenadante com uma pipeta de vidro Pasteur. Repita a lavagem 3 vezes com 1 mL de tampão de lavagem de contas de cada vez.</li>
	<li>Ressuspenda as contas no volume original do talão, 50 μL, com tampão de lavagem do talão. Em seguida, adicione 5 μL (2,5 μg) de anticorpo (CD-31/CD-102) a cada 50 μL de contas.</li>
	<li>Incubar a suspensão de esferas em rotação suave num rotador de ponta a ponta durante a noite a 4 °C ou durante 3 h à temperatura ambiente. Repita a lavagem 4 vezes.</li>
	<li>Ressuspender as imunoesferas no volume original, 50 μL, com tampão de lavagem de contas e armazenar a 4 °C e usar dentro de 1-2 semanas.</li>
</ol>3. Isolamento e plaqueamento das células pulmonares
<ol><li>Preparar solução de colagenase tipo 1 no dia do isolamento: Adicionar 25 mg de colagenase tipo 1 a 25 ml de HBSS (ver Tabela de Materiais). Incubar a 37 °C durante 1 h com rotação suave e filtro estéril utilizando filtro de 22 μM. Manter a solução aquecida a 37 °C.</li>
	<li>Injetar heparina (25 μL/camundongo, 1.000 U/mL) 10 minutos antes da eutanásia para minimizar a ativação das células endoteliais e a formação de coágulos por via intramuscular14,15.</li>
	<li>Eutanasiar o filhote de camundongo com decapitação usando tesouras afiadas de acordo com as Diretrizes AVMA para Eutanásia de 2020. Em seguida, fixe o mouse em uma placa de dissecção com o lado ventral para cima.</li>
	<li>Borrifar a carcaça com etanol a 70% e, em seguida, expor a cavidade torácica cortando primeiro o diafragma e, em seguida, cortando superiormente para cima ao longo de todas as paredes laterais do tórax. Refletir a caixa torácica de volta expõe o coração e os pulmões. NOTA: Use pinças e tesouras menores para esta etapa, dado o pequeno tamanho dos ratos neonatais, e certifique-se de não perfurar o coração ou os pulmões, pois isso levará à remoção inadequada de sangue dos pulmões.</li>
	<li>Anexe uma agulha de 25 G a uma seringa de 10 mL e injete 5 mL de DMEM frio no ventrículo direito do coração para remover o sangue dos pulmões. Os pulmões ficarão brancos.</li>
	<li>Remova os pulmões da cavidade torácica, um lobo de cada vez, cortando os lóbulos distais aos brônquios correspondentes.</li>
	<li>Agrupar todos os lobos pulmonares em um tubo cônico de 50 mL pré-preenchido com 20 mL de meio basal gelado (a partir do passo 1.1).</li>
	<li>Repita as etapas 3.2-3.7 com os outros filhotes de camundongo, agrupando todos os lobos pulmonares no mesmo tubo cônico de 50 mL.</li>
	<li>Agite suavemente o tubo à mão por 10-15 s para lavar qualquer excesso de glóbulos vermelhos visualmente apreciados na superfície dos pulmões. NOTA: Não é necessário remover todo o sangue de dentro ou ao redor dos pulmões; no entanto, isso melhora a pureza. Qualquer manipulação adicional de tecidos precisa ser feita em um capuz estéril.</li>
	<li>Use um filtro de células para remover os pulmões da mídia e transfira o tecido para uma placa de cultura de tecidos estéril e descartável de 100 mm de diâmetro e picanha com tesoura esterilizada.</li>
	<li>Transferir o tecido picado para o tubo cónico de 50 ml com 25 ml de solução de colagenase pré-aquecida (passo 3.1). Agitar suavemente num misturador rotativo durante 45 minutos a 37 °C. NOTA: A digestão excessiva por até 60 minutos pode levar a rendimentos mais baixos.</li>
	<li>Anexar uma seringa de 20 ml a uma cânula romba de 15 G (ver Tabela de Materiais) e triturar a suspensão 10-15 vezes para quebrar o tecido para uma suspensão celular. Seja vigoroso, mas evite espumar demais. NOTA: Não haverá mais pedaços visíveis do pulmão e, em vez disso, a suspensão ficará turva após a conclusão desta etapa.</li>
	<li>Filtrar a suspensão através de um filtro celular de 70 μm para um tubo cónico fresco de 50 ml. Além disso, enxágue o tubo cônico usado para a digestão e o filtro celular com mais 15 mL de meio basal.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão celular a 400 x g durante 8 min a 4 °C.</li>
	<li>Retire o sobrenadante com uma pipeta de vidro Pasteur e ressuspenda o pellet em 2 mL de meio completo. Transferir para um balão T-75 e adicionar 8 mL de meio de cultura completa a 37 °C em uma incubadora umidificada de CO2 a 5%.</li>
	<li>No dia seguinte, lavar os frascos duas vezes com 10 mL de Solução Salgada Balanceada de Hank sem cálcio e magnésio (HBSS/CMF) (ver Tabela de Materiais) e adicionar 10 mL de meio completo. NOTA: Após 2-3 dias, a cultura será 90-95% confluente e pronta para o isolamento primário de imunopartículas.</li>
</ol>4. Isolamento primário de imunoesferas e cultura de células endoteliais
<ol><li>Lavar duas vezes as células endoteliais aderentes com 10 mL HBSS/CMF. Adicionar 2 ml de solução de descolamento celular sem tripsina (ver Tabela de Materiais) e incubar a 37 °C durante ~5 min. Certifique-se de que todas as células foram retiradas do frasco. NOTA: Uma solução de descolamento livre de tripsina precisa ser usada em vez de tripsina, pois a tripsina pode interromper o marcador de adesão da superfície celular CD-31.</li>
	<li>Adicionar 8 mL de meio basal para neutralizar a solução de descolamento celular e transferir o conteúdo para um tubo cônico de 15 mL. Gire para baixo a 400 x g por 4 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Retirar o sobrenadante com pipeta de vidro Pasteur e ressuspender as células em 2 mL de meio basal. Transfira a suspensão celular de 2 mL para um tubo de poliestireno de fundo redondo de 5 mL (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Vortex anti-CD-31 revestido contas por alguns segundos para ressuspender as contas e adicionar 30 μL de contas para cada 2 mL de suspensão celular. Fixe a tampa.</li>
	<li>Incubar o tubo por 10 min à temperatura ambiente em um rotador de ponta a ponta. Em seguida, coloque os tubos em um separador magnético e deixe por 2 min.</li>
	<li>Usando suavemente uma pipeta de vidro Pasteur, aspirar o sobrenadante. Retire o tubo do ímã, ressuspenda o pellet de células de contas adicionando 3 mL de meio basal ao tubo e pipete várias vezes para cima e para baixo.</li>
	<li>Substitua o tubo no separador magnético por 2 min e, em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta de vidro Pasteur.</li>
	<li>Repetir as lavagens (passo 4.6-4.7) pelo menos 4 vezes até que o sobrenadante pareça límpido.</li>
	<li>Após a lavagem final, ressuspender o grânulo em meio de cultura completo de 3 mL e transferi-lo para um balão T-75. Adicionar 7 mL do meio de crescimento completo e incubar a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de CO2 .</li>
	<li>No dia seguinte, lave as células com HBSS/CMF e, em seguida, adicione 10 mL de meio completo fresco. Substitua o meio por 10 mL de meio fresco completo a cada 2-3 dias até 90-95% confluente. NOTA: Uma vez que as células são ~90-95% confluentes, o que leva ~3-4 dias, a cultura está pronta para o isolamento secundário de imunopartículas.</li>
</ol>5. Isolamento de imunoesferas secundárias e cultura de células endoteliais
<ol><li>Lavar duas vezes as células endoteliais aderentes com 10 mL de HBSS/CMF. Adicionar 2 mL de solução de descolamento celular sem tripsina e incubar a 37 °C por ~5 min. Certifique-se de que todas as células foram retiradas do frasco.</li>
	<li>Adicionar 8 mL de meio basal para neutralizar a solução de descolamento celular e transferir para um tubo cônico de 15 mL. Gire para baixo a 400 x g por 4 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Retirar o sobrenadante com uma pipeta de vidro de Pasteur e ressuspender as células em 2 mL de meio basal. Transfira a suspensão de 2 mL de células para um tubo de poliestireno de fundo redondo de 5 mL.</li>
	<li>Vortex anti-CD-102 revestido contas por alguns segundos para ressuspender as contas e adicionar 30 μL de contas para cada 2 mL de suspensão celular. Fixe a tampa.</li>
	<li>Incubar o tubo durante 10 minutos à temperatura ambiente num rotador de ponta a ponta. Coloque os tubos em um separador magnético e deixe por 2 min. Em seguida, aspirar suavemente o sobrenadante usando uma pipeta de vidro Pasteur.</li>
	<li>Retire o tubo do ímã, ressuspenda o pellet de células de contas adicionando 3 mL de meio basal ao tubo e pipete várias vezes para cima e para baixo.</li>
	<li>Substitua o tubo no separador magnético por 2 minutos antes de aspirar cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta de vidro Pasteur.</li>
	<li>Repita as lavagens (passo 5.6-5.7) 4 vezes ou mais até que o sobrenadante pareça claro.</li>
	<li>Após a lavagem final, ressuspender o grânulo em meio de cultura completo de 3 mL e transferi-lo para um balão T-75. Adicionar 7 mL de meio de cultura completo e incubar a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de CO2 .</li>
	<li>No dia seguinte, lave as células com HBSS/CMF e, em seguida, adicione 10 mL de meio completo fresco. Substitua o meio por 10 mL de meio fresco completo a cada 2-3 dias até 90-95% confluente. Uma vez que as células endoteliais estão totalmente confluentes, elas estão prontas para experimentação. As células não devem ser usadas além da passagem seis, pois a senescência pode ocorrer, e outros tipos de células podem assumir o controle.</li>
</ol>6. Confirmação dos marcadores de superfície celular endotelial por citometria de fluxo
<ol><li>Após o uso de solução de descolamento celular sem tripsina para desprendimento das células, ressuspenda o pellet de células para 1 x 10 5 células/mL e alíquota de 100 μL da suspensão celular em três tubos de microcentrífuga de1,5 mL, marcados 1, 2 e 3.</li>
	<li>Lavar as células com 1 mL de PBS 1x. Centrifugar a 500 x g durante 2 min a 4 °C. Retire o tampão de lavagem e repita duas vezes.</li>
	<li>Ressuspender o pellet celular em 100 μL de 1x PBS. Ao tubo 1, adicionar 1 μL de anticorpo conjugado anti-rato CD-31 (PECAM-1) (ex: anticorpo anti-doseirina (PE) anti-rato CD-31) e 1 μL de CD-102 conjugado anti-rato (ICAM-2) (ex: anticorpo anti-CD102 de rato isotiocianato de fluoresceína (FITC)) (ver Tabela de Materiais). Ao tubo 2, adicione os controles isotípicos apropriados. O tubo nº 3 permanecerá sem manchas.</li>
	<li>Incubar os tubos no gelo e no escuro por 30-45 min.</li>
	<li>Adicionar 1 ml de PBS a cada tubo, agitar suavemente o vórtice e centrifugar a 500 x g durante 2 minutos a 4 °C. Retire a lavagem e repita três vezes. Ressuspender o pellet final em 500 μL de PBS.</li>
	<li>Manter os tubos cobertos com papel alumínio a 4 °C até a análise. A análise precisa ser concluída dentro de 3-4 h.</li>
	<li>Adquira dados de fluxo usando um citômetro. Use uma amostra sem manchas como controle negativo para ajustar corretamente a tensão do laser de acordo com a autofluorescência celular. População total de células de portão com um gráfico de dispersão para a frente e gráfico de dispersão lateral. NOTA: Após a exclusão dos duplos, as células CD31+ CD102+ duplo-positivas são definidas como células endoteliais.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo simples presta-se a células endoteliais de alta pureza de pulmões murinos. Embora o tempo total do início ao fim seja de 7-10 dias, o tempo prático é de cerca de 3-4 h. Comparado a outros métodos13,14,15,16, o protocolo atual é simplificado, mantendo etapas essenciais sem comprometer o rendimento e a pureza.
Vale ressaltar alguns aspectos críticos desse protocolo. Primeiro, é importante usar filhotes neonatais em vez de camundongos adultos. Em nossa experiência, as células endoteliais de camundongos adultos não proliferam tão facilmente quanto as células de filhotes neonatais, sendo facilmente invadidas por células com morfologia fusiforme compatível com fibroblastos ou células-tronco mesenquimais15,16. Uma possível explicação para a diferença é que o desenvolvimento pulmonar encontra-se na fase alveolar em camundongos neonatais, caracterizado pela proliferação mais rápida de célulasendoteliais20. Também pode haver algum grau de senescência com oenvelhecimento21. O tempo de digestão enzimática também precisa ser preciso, pois a subdigestão pode levar a uma suspensão de célula única de baixo rendimento. Em contraste, a digestão excessiva pode levar a uma quantidade substancial de morte celular. Determinamos que o tempo ideal para a digestão da colagenase é de 45 minutos. Segue-se a dissociação mecânica com uma cânula romba. A instilação de colagenase intratraqueal durante a digestão enzimática também tem sido relatada14,15; No entanto, isso pode ser demorado e leva à digestão incompleta durante o trabalho atual. Por fim, alguns protocolos procedem diretamente ao isolamento de imunoesferas imediatamente após a digestão enzimática13,16. Descobrimos que cultivar as células do pulmão dissociado no meio por um ou dois dias antes de fazer a seleção de imunoesferas aumenta substancialmente o rendimento de células endoteliais viáveis e altamente puras. Isso pode estar relacionado à velocidade de entrada das células isoladas no meio de cultura de tecidos, o que leva a menor morte celular nos estágios iniciais após a remoção dos camundongos, maior densidade de semeadura inicial e tempo para as células endoteliais aderirem e proliferarem antes do primeiro isolamento do imunopérolo.
As limitações da preparação e análise de células endoteliais de camundongos são as seguintes. Cada mouse fornece apenas um número limitado de células que devem ser usadas dentro de algumas passagens. Esse problema pode ser superado com o acúmulo de digestão pulmonar de vários camundongos. Infelizmente, não temos sucesso em nossos esforços para criopreservar e descongelar as células para uso futuro. Apesar dessas limitações, as células endoteliais de camundongos apresentam algumas vantagens. Eles podem ser úteis, particularmente em situações em que células endoteliais humanas não podem ser usadas (por exemplo, nocaute gênico), quando estudos complementares são necessários para corroborar resultados com células humanas ou quando a heterogeneidade das respostas de células endoteliais de diferentes doadores humanos torna problemáticaa reprodutibilidade entre experimentos6. A população homogênea de células endoteliais de camundongos geneticamente idênticos permite a reprodutibilidade entre experimentos e o estudo de genes e vias específicas sob condições de fundo estáveis.
As células endoteliais de camundongos podem ser usadas para múltiplas aplicações para fornecer informações sobre a ativação e disfunção endotelial em diferentes processos patológicos. Por exemplo, as células endoteliais desempenham um papel fundamental na sepse, contribuindo para respostas tanto benéficas quanto patológicas por meio de seu papel na ativação da inflamação localizada e sistêmica, promovendo o tráfego e ativação de leucócitos nos tecidos, regulando a coagulação e modulando a permeabilidade endotelial 2,22,23 . Este protocolo simples fornece células endoteliais viáveis e funcionais que podem ser usadas em ensaios para cada um desses processos endoteliais.

O interesse em estudar o endotélio vascular tem crescido recentemente, uma vez que a disfunção das células endoteliais microvasculares ocorre em múltiplas doenças humanas, como acidente vascular cerebral, doença cardiovascular, diabetes, lesão pulmonar aguda, sepse e lesões não infecciosas 1,2,3,4,5. Para definir a patogênese dessas condições e entender o papel de genes específicos em respostas protetoras e desreguladas de células endoteliais, há necessidade de métodos confiáveis para isolar e cultivar células endoteliais microvasculares de alta pureza de camundongos. Embora muitos estudos utilizem células endoteliais humanas, como células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) ou células endoteliais microvasculares do pulmão humano (HMVEC), há várias razões para usar células endoteliais de camundongo para estudar a função e disfunção endotelial. Primeiro, há considerável heterogeneidade nas respostas de células endoteliais de diferentes doadores humanos, o que leva à variabilidade nos resultados entre experimentos individuais 6,7,8. Em segundo lugar, o silenciamento de alvos gênicos em linhagens celulares humanas primárias também pode levar a níveis variáveis de expressão proteica 9,10. Em contraste, há mínima heterogeneidade nas respostas das células endoteliais decamundongos11, supondo que o background genético seja o mesmo entre os grupos de estudo. Além disso, um grande número de células endoteliais de camundongos pode ser preparado pelo agrupamento de pulmões de vários camundongos neonatais. Esses fatores permitem resultados mais consistentes e reprodutíveis entre os experimentos. Finalmente, a disponibilidade de camundongos knockout ou transgênicos também proporciona o isolamento de tipos celulares carentes de proteínas de interesse.
Os consideráveis desafios com o isolamento de populações saudáveis e puras de células endoteliais de pulmão de camundongo usando métodos publicados 12,13,14,15,16 levaram ao desenvolvimento de um método mais confiável e direto para isolar células endoteliais microvasculares de pulmão de camundongo de alta qualidade. As vantagens do protocolo atual incluem o uso de camundongos neonatais, que estão prontamente disponíveis, limitando os custos de criação de animais e alojamento. Além disso, em nossa experiência, a viabilidade de células endoteliais de camundongos neonatais é substancialmente maior do que a de células endoteliais preparadas de camundongos adultos. Como os camundongos neonatais têm tecido pulmonar pequeno, as células endoteliais podem ser colhidas digerindo pulmões excisados em colagenase, em vez de usar instilação traqueal de colagenase, que é recomendada para coleta de camundongos adultos16. Isso também reduz o tempo entre a eutanásia de camundongos e a entrada de suas células endoteliais no meio de cultura celular e na incubadora, sem afetar a pureza, o rendimento ou a reprodutibilidade das respostas endoteliais. Por fim, populações de células puras foram isoladas sem citometria de fluxo, o que pode danificar ou levar a menores rendimentos das células endoteliais14,15,17.
O protocolo atual modificado leva consistentemente a células endoteliais viáveis e de alta pureza em 7-10 dias que podem ser usadas imediatamente para experimentos in vitro . Isolar células diretamente de animais nocautes também minimiza a manipulação das células antes da experimentação. Esses métodos poderiam ser usados para investigar o papel de várias proteínas na função endotelial para descobrir alvos terapêuticos baseados no endotélio para múltiplas doenças.

<table><tbody><tr><td>50 mL cônicos</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Accutase Solução de Desprendimento de Células</td><td>Innovative Cell Technologies, Inc</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>BD Agulha PrecisionGlide 25 G x 5/8"</td><td>Becton Disckinson</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>BioRender.com</td><td>Cânula BioRender</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blunt 15 G x 1-1/2"</td><td>Covidien</td><td>8881202314</td><td></td></tr><tr><td>CD-102 Rato anti-rato (3C4 (MIC2/4))BD</td> <td>Biosciences</td><td>553326</td><td></td></tr><tr><td>CD-31 Rato anti-rato (MEC 13.3)</td><td>BD Biosciences</td><td>557355</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase, Tipo 1</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>LS004194</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicose alta</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Ovelha Anti-Rato IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>Suprimento de Crescimento de Células Endoteliais</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>02-102</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de células Falcon (70 &micro; m)</td> <td>Corning Life Sciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal, inativado por calor</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Fina</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Fina</td><td>Ferramentas de Ciência</td><td>Fina 14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Pasteur de Vidro de Borosilicato Descartável Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-mouse CD102 (3C4)</td><td>BD Biosciences</td><td>557444</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat IgG2a,&nbsp; &kappa; Controle de Isotipo (R35-95)</td><td>BD Biosciences</td><td>553929</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps Fine</td><td>Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, sem cálcio, sem magnésio, sem vermelho de fenol</td> Injeções <td>de</td> Heparina <td>Sódica Gibco</td> 14175095 <td></td></tr><tr><td>(1.000 Unidades/mL)</td><td>Medline</td><td>0409-2720-02</td><td></td></tr><tr><td>Sal de heparina sódica da mucosa intestinal suína</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>PE Rato Anti-rato CD31 (MEC 13.3)</td><td>BD Biosciences</td><td>553373</td><td></td></tr><tr><td>PE Rato IgG2a,&nbsp; &kappa; &nbsp; Controle de Isotipo R35-95)</td><td>BD Biosciences</td><td>553930</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina (10,000 U/mL, 10,000 &micro; g/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>IFN murino recombinante-&gama;</td><td>Peprotech</td><td>315-05</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Murine IL-1&beta;</td><td>Peprotech</td><td>211-11B</td><td></td></tr><tr><td>TNF murino recombinante-&alfa;</td>Tubos de ensaio de poliestireno de fundo redondo <td>Peprotech</td><td>315-01A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Corning Life Sciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Semken Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Quick Release-GP Sistema de Filtração a Vácuo Estéril, 250 mL</td><td>Millipore</td><td>S2GPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de filtro superior de tubo de centrífuga estéril Steriflip-GP</td><td>Seringa</td><td>estéril Milipore SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>(10 mL)</td>Seringa estéril <td>Fisher Scientific</td><td>14-955-459</td><td></td></tr><tr><td>(20 mL)</td>Frasco de cultura de células <td>Fisher Scientific</td><td>14-955-460</td><td></td></tr><tr><td>T-75 com tampa de ventilação, tratado com CellBIND</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3290</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de células endoteliais primárias de pulmão de camundongo

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

As células endoteliais desempenham papéis críticos na regulação do tônus vascular, imunidade, coagulação e permeabilidade. A disfunção endotelial ocorre em condições médicas, incluindo diabetes, aterosclerose, sepse e lesão pulmonar aguda. Um método confiável e reprodutível para isolar células endoteliais puras de camundongos é necessário para investigar o papel das células endoteliais na patogênese dessas e de outras condições. Neste protocolo, células endoteliais microvasculares pulmonares foram preparadas a partir de filhotes de camundongos neonatais com 5-7 dias de idade. Os pulmões são colhidos, picados e digeridos enzimaticamente com colagenase I, e as células liberadas são cultivadas durante a noite. As células endoteliais são então selecionadas usando IgG anti-PECAM1 (CD-31) conjugada a esferas magnéticas, e as células são novamente cultivadas para confluência. Uma seleção celular secundária ocorre então com IgG anti-ICAM2 (CD-102) conjugada a esferas magnéticas para aumentar a pureza das células endoteliais, e as células são novamente cultivadas para confluência. Todo o processo leva aproximadamente 7-10 dias antes que as células possam ser usadas para experimentação. Este protocolo simples produz células endoteliais altamente puras (pureza >92%) que podem ser imediatamente utilizadas para estudos in vitro , incluindo os estudos focados na produção de citocinas e quimiocinas endoteliais, interações leucocito-endotelial, vias de coagulação endotelial e permeabilidade endotelial. Com muitos knockouts e linhagens de camundongos transgênicos disponíveis, esse procedimento também se presta a entender a função de genes específicos expressos por células endoteliais em respostas saudáveis e patológicas a lesões, infecções e inflamação.

Este protocolo simples permite isolar, cultivar e caracterizar células endoteliais microvasculares de camundongos ao longo de 7-10 dias (Figura 1). Resumidamente, os pulmões são excisados e digeridos enzimaticamente antes do plaqueamento. Imediatamente após o plaqueamento, as células endoteliais e outras células flutuarão nos meios de cultura celular. No dia seguinte, as células endoteliais e as células contaminantes estarão aderidas à placa, e uma técnica de lavagem vigorosa é necessária para remover os detritos e as células flutuantes. Uma vez que as células atingem a confluência, a primeira seleção de imunoesferas é realizada. As células CD-31 positivas começam então a crescer em uma formação de paralelepípedos (Figura 2). Células que não apresentam morfologia de paralelepípedos ou crescimento excessivo são contaminantes e não células endoteliais13,14,15,16.
Uma segunda seleção de imunoesferas é então realizada usando esferas revestidas com anti-CD-102 para aumentar a pureza das células endoteliais, semelhante a outros protocolos13,16. As células que cresceram até a confluência após a segunda seleção de imunoesferas podem então ser usadas para experimentação. A classificação celular ativada por fluorescência (FACS) é usada para confirmar que a população celular é positiva para CD-31 e CD-102 (Figura 3).
Essas células endoteliais podem então ser usadas para muitas aplicações, como o estudo das vias inflamatórias endoteliais e da função da barreira endotelial. Por exemplo, observou-se que o tratamento com citomix murino (IFNg, TNFa e IL1b, cada um a 10 ng/mL) induziu a produção de IL-6 pelas células endoteliais (Figura 4A). Em seguida, o Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS)18 foi usado para medir a resistência transendotelial (TER) ao fluxo de corrente elétrica através das monocamadas de células endoteliais pulmonares murinas. Observou-se que as células tratadas com citomix levaram a uma diminuição do TER (Figura 4B), o que é consistente com aumento da permeabilidade endotelial. Esses exemplos ilustram como as células endoteliais preparadas com esse protocolo podem estudar vários processos endoteliais. Isso permite que os pesquisadores estudem mais facilmente genes de interesse em células endoteliais, dado o número cada vez maior de camundongos nocaute e transgênicos disponíveis.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig01.jpg"> Figura 1: Esquema para isolamento das células endoteliais pulmonares murinas. Os pulmões de filhotes neonatais de 5 a 7 dias de idade são colhidos e picados. O tecido picado foi digerido enzimaticamente com colagenase I. A suspensão celular é plaqueada e cultivada por 2-3 dias. As células então são submetidas ao isolamento primário de imunoesferas com esferas revestidas de CD-31 e são cultivadas por mais 3-4 dias. Segundo isolamento de esferas imunodosas com esferas revestidas com CD-102 antes de cultivar mais 2-3 dias. As células estão agora prontas para a experimentação funcional. A imagem foi criada por uma ferramenta de ilustração baseada na web, Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig02.jpg"> Figura 2: Morfologia das células endoteliais pulmonares murinas. Células endoteliais de pulmão murino cultivadas exibem uma morfologia de paralelepípedos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig03v2.jpg"> Figura 3: Análise das células endoteliais por citometria de fluxo. (A) Todos os eventos são visualizados em um gráfico de pontos do Forward Scatter (FSC) e do Side Scatter (SSC). (B) Scatter plot confirmando que as células endoteliais pulmonares murinas foram positivas para ambos os antígenos de superfície celular específicos do endotélio CD-31 e CD-102. (C) Histograma da amostra isotípica e amostra corada com anticorpo específico CD-31/CD-102. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig03largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig04.jpg"> Figura 4: A mistura induz a produção de IL-6 de células endoteliais pulmonares murinas e a permeabilidade das células endoteliais. Células endoteliais microvasculares de pulmão murino de camundongos C57BL/6 foram tratadas com citomix (IFNg, TNFa e IL1b, cada um a 10 ng/mL). (A) Os níveis de IL-6 foram então quantificados em sobrenadantes de cultura em 15 h (**p&lt;0,01, n = 4 poços/condição). (B) O Sensor de Impedância Célula-Substrato Elétrico foi utilizado para medir a resistência transendotelial (RTE) repetidamente ao longo de 15 h. Os dados foram normalizados para a resistência imediatamente antes da adição da citomistura conforme designado e foram analisados por análise de variância (ANOVA) two-way seguida pelo pós-teste de Tukey19 (**p&lt;0,01, n = 4 poços/condição). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Neste artigo, células endoteliais primárias do pulmão foram isoladas e cultivadas de camundongos neonatais.

Isolamento de Células Endoteliais Primárias de Pulmão de Camundongo

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

O protocolo demonstra um método confiável e reprodutível para isolar e cultivar células endoteliais de alta pureza de camundongos que podem ter múltiplas aplicações. Esta técnica é um método mais simples que preserva o rendimento e a pureza das células endoteliais. Quem demonstrará o procedimento será Nina Nguyen, pesquisadora associada do meu laboratório.Para começar, agite as contas magnéticas por alguns segundos. Pipetar 50 microlitros das contas em dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro para CD31 e CD102. Adicione um mililitro de tampão de lavagem de contas e misture bem.Coloque os tubos num separador magnético e retire o sobrenadante com uma pipeta de vidro Pasteur. Ressuspenda as contas em 50 microlitros de tampão de lavagem de contas. Em seguida, adicione cinco microlitros ou 2,5 microgramas de anticorpos CD31 ou CD102 a cada 50 microlitros de contas.Incubar a suspensão de contas com rotação suave em uma extremidade sobre o rotador final durante a noite a quatro graus Celsius ou por três horas à temperatura ambiente. Lave as imunoesferas quatro vezes e, em seguida, ressuspenda as esferas em 50 microlitros de tampão de lavagem de contas. No dia do isolamento, adicione 25 mililitros de HBSS a 25 miligramas de colagenase tipo um e incube-a com rotação suave.Em seguida, filtre usando um filtro de 22 micrômetros. Após a eutanásia de um filhote de camundongo de cinco a sete dias, borrife a carcaça com etanol 70%. Em seguida, corte o diafragma superiormente para cima ao longo de toda a parede lateral do tórax para expor a cavidade torácica.Injete cinco mililitros de DMEM frio no ventrículo direito do coração até que os pulmões fiquem brancos. Em seguida, corte os lóbulos distais aos brônquios correspondentes, um a um, para remover os pulmões. Puxe os lóbulos pulmonares em um tubo cônico de 50 mililitros pré-preenchido com 20 mililitros de meio basal gelado.Agite suavemente o tubo à mão durante 10 a 15 segundos para lavar o excesso de glóbulos vermelhos. Retire os pulmões do meio com um filtro de células e pique com tesoura esterilizada. Transfira o tecido picado para o tubo cônico de 50 mililitros com 25 mililitros de solução de colagenase pré-aquecida.Agite suavemente em um misturador rotativo. Conecte uma seringa de 20 mililitros a uma cânula romba de calibre 15 e triture a suspensão vigorosamente sem espumar de 10 a 15 vezes em uma suspensão celular. Filtre a suspensão através de um filtro de células de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros.Em seguida, enxágue o tubo cônico usado para a digestão e o filtro celular com 15 mililitros de meio basal. Centrifugar a suspensão celular a 400 vezes G por oito minutos a quatro graus Celsius. Ressuspenda o pellet em dois mililitros de meio completo.Adicione oito mililitros de meio completo e incube. No dia seguinte, lavar os frascos duas vezes com 10 mililitros de HBSS sem cálcio e magnésio e adicionar 10 mililitros de meio completo. Uma vez que as células são 90 a 95% confluentes, elas estão prontas para o isolamento primário de imunopartículas.Lavar duas vezes as células endoteliais aderentes com 10 mililitros de HBSS sem cálcio e magnésio. Adicionar dois mililitros de solução de descolamento celular sem tripsina e incubá-la para garantir o levantamento de todas as células do frasco. Adicione oito mililitros de meio basal.Em seguida, gire as células a 400 vezes G por quatro minutos à temperatura ambiente e ressuspenda-as em dois mililitros do meio basal. Vortex anti-CD31 revestido contas por alguns segundos para ressuspender as contas. Adicione 30 microlitros de contas para cada dois mililitros de suspensão celular e prenda a tampa.Incubar o tubo por 10 minutos à temperatura ambiente em uma extremidade sobre o rotador da extremidade. Em seguida, coloque os tubos em um separador magnético por dois minutos. Aspirar o sobrenadante e remover o tubo do ímã.Ressuspenda o grânulo de células adicionando três mililitros de meio basal ao tubo e pipetando para cima e para baixo várias vezes. Substitua o tubo no separador magnético por dois minutos. Em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta de vidro Pasteur.Após a lavagem final, quando o sobrenadante ficar claro, ressuspender o pellet de células de contas em três mililitros de meio de crescimento completo e transferi-lo para um frasco T75. Adicione sete mililitros do meio de crescimento completo e incube-o. No dia seguinte, volte a lavar as células com HBSS sem cálcio e magnésio.Em seguida, adicione 10 mililitros de meio completo. Uma vez que as células são 90 a 95% confluentes, elas estão prontas para o isolamento secundário de imunopartículas. A primeira seleção de imunoesferas identifica as células CD31 positivas, que crescem em uma formação de paralelepípedos.Uma segunda seleção de esferas imunográficas com esferas revestidas com anti-CD102 aumenta a pureza das células endoteliais e a classificação de células ativadas por fluorescência é usada para confirmar que a população celular é CD31 positiva e CD102 positiva. Para estudar as vias inflamatórias endoteliais e a função da barreira endotelial, o tratamento com Cytomix murino foi usado para induzir produção significativa de IL-6 pelas células endoteliais com um valor de P menor que 0,01. Além disso, a resistência transendotelial diminuiu, mostrando aumento da permeabilidade endotelial.Células endoteliais isoladas podem ser usadas em estimulações de células endoteliais ou ensaios de função de barreira para descobrir alvos terapêuticos baseados no endotélio para distúrbios da disfunção endotelial.

isolation-of-primary-mouse-lung-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Aqui, nós descrevemos um protocolo para isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos. Este método compreende mecânico e dissociação enzimática do tecido pulmonar, bem como um processo de purificação passo 2, utilizando anti-PECAM-1 e anti-ICAM-2 anticorpos conjugados com esferas magnéticas, que produz uma população de células endoteliais pura de origem principalmente microvascular.

Isolamento e cultura de células endoteliais pulmonares de camundongos Neonatal

A preparação altamente purificada de células dendríticas pulmonares do rato é descrito. Ênfase específica é dada para o isolamento de um subconjunto de células dendríticas convencionais.

Isolamento de células dendríticas pulmonares do rato

As células endoteliais microvasculares cerebrais (BMEC) são interconectadas por proteínas juncionais específicas formando uma barreira altamente regulada que separa o sangue e o sistema nervoso central (SNC), a chamada barreira hematoencefálica (BBB). O isolamento de células endoteliais microvasculares cerebrais murinas primárias, conforme discutido neste protocolo, permite estudos in vitro detalhados da BHE.

Isolamento da Primária Murino Cérebro microvascular células endoteliais

As células endoteliais vasculares desempenham um papel significativo em muitos distúrbios cardiovasculares importantes. Este artigo descreve um método simples para isolar e expandir as células endoteliais da aorta do camundongo sem o uso de nenhum equipamento especial. Nosso protocolo fornece um meio eficaz de identificar mecanismos na fisiopatologia das células endoteliais.

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

Este protocolo está preparado para compartilhar nosso método de isolamento de células endoteliais coronárias de camundongos para fins de imagem ou para conduzir experimentos biológicos moleculares.

Isolamento de células de camundongo Coronária endoteliais

Células endoteliais microvasculares dos músculos esqueléticos (MMEC) forma a parede interna dos capilares musculares e regular a ambos, troca de fluidos/moléculas e migração de células (imunes) entre o tecido muscular e sangue. Isolamento de MMEC murino primário, conforme descrito aqui, permite investigações in vitro abrangentes da unidade"myovascular".

Isolamento de células endoteliais Microvascular do principal músculo esquelético murino

Aqui descrevemos e demonstramos um protocolo para o isolamento da célula endotelial do fígado do camundongo primário (LSEC). O protocolo é baseado na perfusão da colagem hepática, purificação celular não parenquimal por centrifugação de baixa velocidade e seleção de contas magnéticas CD146. Também fenótipo e caracterizamos esses LSECs isolados usando citometria de fluxo e microscopia eletrônica de varredura.

Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato

Apesar de desafiador, o isolamento das células endoteliais pulmonares é essencial para estudos sobre inflamação pulmonar. O presente protocolo descreve um procedimento para o isolamento de alto rendimento e pureza de células endoteliais macrovasculares e microvasculares.

Isolamento e Purificação de Células Endoteliais Microvasculares e Macrovasculares a partir de Amostras Derivadas de Pulmão

Este protocolo descreve o isolamento de células endoteliais de camundongos de todo o pâncreas.

Isolamento de células endoteliais pancreáticas de camundongo

Este protocolo detalha o isolamento de populações imunes e não imunes vivas do pulmão de camundongo em estado estacionário e após a infecção por influenza. Ele também fornece estratégias de gating para identificar subconjuntos de células epiteliais e mieloides.

Isolamento de populações de células mieloides e epiteliais vivas do pulmão de camundongo

Aprenda a isolar células endoteliais primárias de pulmão de camundongo com alta pureza usando imunobeads magnéticos. Este protocolo reprodutível preserva o rendimento celular e permite estudos de função endotelial in vitro.

Isolamento de Células Endoteliais Primárias de Pulmão de Camundongo

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