Avaliação quantitativa de reação em cadeia de polimerase em tempo real da expressão de microRNA em rim e soro de camundongos com comprometimento renal dependente da idade
29 de abril de 2022
Apresentamos um método para avaliar a expressão de microRNA no rim e soro de camundongos com comprometimento renal dependente da idade por reação quantitativa em cadeia de polimerase de transcrição reversa.
Este método qRT-PCR pode abordar questões relacionadas ao perfil de expressão microRNA no soro de camundongos em condições como comprometimento renal dependente da idade. A técnica permite a detecção de expressão de microRNA com alta precisão e sensibilidade por um processo simples que economiza tempo e previne erros técnicos. Para começar, inciso a pele do abdômen usando pinças e tesouras cirúrgicas.
Corte os músculos da membrana peritoneal da bexiga até a borda inferior esquerda das costelas. Levante a membrana peritoneal usando pinças e faça uma incisão lateral na borda superior com uma tesoura cirúrgica. Continue a incisão ao longo da borda mais baixa das costelas.
Identifique a veia cava inferior usando dois cotonetes de algodão umedecidos pbs. Insira uma agulha de 30 G presa a uma seringa de 1 mililitro na cava vena inferior e puxe a seringa. Puxe lentamente a agulha para fora para evitar hemólise.
Transfira o sangue para um tubo de spitz de 1 mililitro com heparina, e misture invertendo. Centrifugar o tubo de spitz por 10 minutos a 3000 vezes G à temperatura ambiente. Transfira o supernatante para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro fresco.
Pegue 200 microliters de amostra de soro e adicione 1.000 microliters de reagente de lise à base de fenol/guanidina. Vórtice a mistura por 5 segundos, e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos. Adicione 200 microliters de clorofórmio, e misture invertendo o tubo 15 vezes.
Incubar a amostra à temperatura ambiente por 3 minutos, seguida de centrifugação. Sem perturbar a pelota, transfira o supernatante para um tubo de microcentrífugo fresco de 1,5 mililitro. Adicione 450 microliters de 100% etanol, e vórtice do tubo por 5 segundos.
Em seguida, carregue 700 microliters da amostra em uma coluna de spin ancorada em membrana, e centrífuga-a. Descarte o fluxo-through e adicione 700 microliters de Wash Buffer 1 fornecidos no kit. Centrifugar novamente, e descartar o fluxo através.
Repita a lavagem com 500 microliters de Wash Buffer 2 para remover os sais de rastreamento. Adicione 500 microliters de 80% de etanol, centrífuga e descarte o fluxo do tubo de coleta. Centrifugar novamente a coluna de giro e transferir a coluna para um novo tubo de coleta de 1,5 mililitro.
Em seguida, adicione 14 microliters de água sem RNase e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente. Gire a coluna novamente por 1 minuto a 15000 vezes G à temperatura ambiente. Prepare uma solução de mixagem mestre e adicione 8 microliters por poço em um tubo de tira de 8 poços.
Adicione 12 microliters do RNA total extraído em cada tubo, e centrifugar o tubo por 15 segundos a 2000 vezes G à temperatura ambiente. Coloque o tubo em um cicloviário térmico e inicie a incubação para sintetizar o cDNA. Após a incubação, transfira o cDNA para um tubo de microcentrifuuge fresco.
Diluir o cDNA dez vezes com água destilada. Em seguida, vórtice, seguido de centrifugação por 5 segundos a 2000 vezes G à temperatura ambiente. Em um tubo de microcentrifuge, prepare a solução de mix mestre conforme descrito no protocolo de texto e o vórtice da solução.
Adicione 22,5 alíquotas de microliter em cada poço de uma placa de 96 poços, seguido por 2,5 microliters de cDNA. Sele a placa usando uma película adesiva e centrifufique a placa por 30 segundos a 1000 vezes G.Coloque a placa no sistema PCR em tempo real. Modifique as configurações fornecendo um nome para o experimento.
Em seguida, selecione 96-well 0.2 mililitros como o tipo de experimento, ct comparativo como o método de quantitação, padrão como o modo de execução do sistema, e reagentes SYBR Green como os reagentes para detectar a sequência de destino. Forneça nomes para a amostra e o miRNA alvo em cada poço. Atribua amostras duplicadas, escolha uma amostra de referência e controle endógeno e selecione nenhuma para o corante usar como referência passiva.
Para eliminar a contaminação cruzada do reagente, configure transcriptase reversa negativa e um controle não-modelo para expressão miRNA. Em seguida, certifique-se de que o volume de reação é definido para 20 microliters, e as condições de ciclismo PCR são definidas em 95 graus Celsius por 15 minutos, em seguida, 40 ciclos de desnaturação a 94 graus Celsius por 15 segundos, resmando a 55 graus Celsius por 30 segundos, e extensão a 70 graus Celsius por 30 segundos. Após a conclusão do processo, clique em analisar para analisar os dados do qRT-PCR.
Confirme se a linha de limiar automaticamente selecionada pelo programa é apropriada para cada poço. Verifique o valor do ciclo limiar do controle endógeno e os miRNAs de destino analisados em cada amostra. Determine os valores ct pela intersecção da curva de amplificação e linha limiar.
os dados do miRNA qRT-PCR para o modelo de comprometimento renal dependente da idade mostraram que, em comparação com os camundongos de controle SAMR1, o nível renal de miRNA-7219-5p aumentou significativamente em camundongos experimentais SAMP1, enquanto o nível renal de miRNA-7218-5p diminuiu. Os níveis de expressão do miRNA-223-3p não mudaram em nenhuma das cepas. Os níveis de soro tanto de miRNA-7219-5p quanto de miRNA-7218-5p foram consideravelmente aumentados nos camundongos SAMP1, enquanto os níveis de miRNA-223-3p foram inalterados.
Você deve inserir a agulha na veia cava inferior e extrair sangue sem penetrar no vaso. Este método pode ser usado para responder a perguntas-chave no perfil de expressão microRNA no soro de camundongos para uma ampla gama de condições patológicas.
Visão Geral
Este estudo apresenta um método de reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa quantitativa (qRT-PCR) para avaliar a expressão de microRNA no rim e soro de camundongos com comprometimento renal dependente da idade. A técnica permite alta precisão e sensibilidade na detecção da expressão de microRNA, facilitando pesquisas nesta área.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Pesquisa com microRNA
Contexto
- Os microRNAs desempenham um papel crucial na regulação gênica.
- A disfunção renal dependente da idade afeta a expressão de microRNAs.
- Compreender os perfis de microRNA pode fornecer informações sobre doenças renais.
- A PCR em tempo real (qRT-PCR) é um método amplamente utilizado para analisar a expressão de RNA.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a expressão de microRNAs em camundongos com comprometimento renal.
- Estabelecer um método confiável de qRT-PCR para amostras de soro e rim.
- Identificar microRNAs específicos associados a alterações renais relacionadas à idade.
Métodos Utilizados
- Coleta de amostras de soro e rim de camundongos.
- Extração de RNA total utilizando reagente de lise baseado em fenol/guanidina.
- Síntese de cDNA seguida de qRT-PCR para quantificação de microRNAs.
- Análise dos dados de qRT-PCR para determinar os níveis de expressão dos microRNAs-alvo.
Resultados Principais
- Em camundongos SAMP1, os níveis renais de miRNA-7219-5p aumentaram significativamente.
- Os níveis renais de miRNA-7218-5p diminuíram em camundongos SAMP1.
- Os níveis séricos de miRNA-7219-5p e miRNA-7218-5p aumentaram consideravelmente.
- Os níveis de miRNA-223-3p permaneceram inalterados em ambas as linhagens.
Conclusões
- O método de qRT-PCR caracteriza efetivamente a expressão de microRNAs na disfunção renal.
- MicroRNAs específicos estão associados a alterações renais dependentes da idade.
- Este método pode ser aplicado para investigar diversas condições patológicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O perfilhamento preciso da expressão de microRNAs em rim e soro permite a detecção precoce de mecanismos de comprometimento renal dependentes da idade, apoiando a validação de alvos em modelos pré-clínicos. Este método de qRT-PCR fornece dados quantitativos e reprodutíveis que aumentam a confiança preditiva em pipelines de descoberta de biomarcadores. Ele preenche uma lacuna crítica na padronização da análise de miRNAs para pesquisas renais translacionais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a quantificação das alterações na expressão do miRNA-7218-5p e do miRNA-7219-5p no rim e no soro.
- Valor Operacional: Oferece um método confiável para extrair e avaliar miRNA de amostras biológicas murinas, reduzindo a variabilidade técnica.
- Valor Estratégico: Apoia a desmistificação biológica de alvos renais ao esclarecer os padrões de desregulação de miRNA em modelos de comprometimento dependente da idade.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera valores CT quantitativos a partir de qRT-PCR, permitindo a medição padronizada da expressão de miRNA entre diferentes tipos de amostras.
- Valor Operacional: Estabelece um fluxo de trabalho reprodutível para extração de miRNA de soro e rim, síntese de cDNA e amplificação.
- Valor Estratégico: Facilita a preparação do ensaio para campanhas de triagem direcionadas a vias mediadas por miRNA em modelos de doenças renais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Esclarece a relação entre os níveis de miRNA no rim e no soro, apoiando a tradução de biomarcadores do tecido para fluidos biológicos.
- Valor Operacional: Permite o monitoramento longitudinal do miRNA-7218-5p e do miRNA-7219-5p em modelos pré-clínicos de comprometimento renal.
- Valor Estratégico: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco, fornecendo insights mecanicistas sobre alterações renais relacionadas à idade.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se no continuum de descoberta que vai da verificação da hipótese do alvo até a validação pré-clínica, particularmente para vias relacionadas à fibrose renal e ao envelhecimento.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a detecção de alterações significativas na expressão de miRNAs entre cepas de camundongos controle e com comprometimento.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos reprodutíveis (valores CT) que permitem a comparação dos níveis de miRNA entre diferentes condições experimentais.
- Análise: Utiliza o método comparativo de CT com controles endógenos para normalizar os dados de expressão, assegurando comparações confiáveis entre amostras.
- Pesquisa Translacional: Relaciona alterações de miRNA no rim com mudanças detectáveis no soro, apoiando o desenvolvimento de biomarcadores não invasivos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um protocolo padronizado para a quantificação de miRNA que pode ser reutilizado em diversos modelos de doenças renais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos por meio da detecção precisa e sensível de alterações na expressão de miRNA.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a padronização entre laboratórios ao definir etapas claras de extração de RNA e qRT-PCR.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de avançar ou não avançar ao fornecer dados de desvio de risco mecanicista sobre vias renais mediadas por miRNA.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização de alvos com base em risco, a partir da disfunção consistente de miRNA em modelos pré-clínicos.
Considerações de Implementação
- Requer experiência no manuseio de RNA, transcrição reversa e instrumentação de qRT-PCR.
- Depende do acesso a reagentes de lise com fenol/guanidina, colunas de centrifugação e sistemas de PCR em tempo real com detecção por SYBR Green.
- Necessita padronização de controles endógenos e amostras de referência entre equipes para análise comparativa de CT.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o protocolo a diferentes linhagens de camundongos ou volumes de amostra.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de coleta cuidadosa de sangue para evitar hemólise e tempos adequados de incubação durante a extração.
