Name: Purificação dos canais potenciais do receptor transitório Endogenous Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprenda a purificar canais TRP de Drosophila usando purificação por afinidade com beads de níquel. Este método permite estudar propriedades eletrofisiológicas e estruturais desses canais essenciais para processos sensoriais.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (No. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ2020200109140414636) e Fundação de Ciência Natural da Província de Guangdong, China (nº 2021A1515010796) a W. L. Agradecemos a LetPub (www.letpub.com) por sua assistência linguística durante a elaboração deste manuscrito.

1. Purificação de fragmentos TRP com etiqueta GST e norpa com sua marca
<ol><li>Purificar fragmento TRP 1261-1275 com marca GST<ol>
<li>Transforme as células pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 plasmid10 em células Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) usando o método de transformação de choque térmico CaCl2 21. Inocular uma única colônia em 10 mL de Luria Bertani (LB) média e crescer durante a noite a 37 °C. Em seguida, amplie os 10 mL de cultura de semeadura em 1 L de meio LB a 37 °C.</li>
		<li>Após a densidade óptica (OD600) das células atingir 0,5, resfriar as células a 16 °C e adicionar 0,1 mM isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; concentração final) para induzir a superexpressão da proteína alvo e incubar a 16 °C para 18 h.</li>
		<li>Após a superexpressão, pelota 1 L de células cultivadas por centrifugação a 3.993 × g por 20 min e resuspend em 40 mL de tampão salino tampão tampão de fosfato (PBS).</li>
		<li>Carregue as células resuspended em um homogeneizador de alta pressão pré-resfriado a 4 °C. Aumente lentamente a pressão do homogeneizador para 800 bar. Abra a torneira de entrada e deixe as células resuspendedas passarem circularmente por uma válvula com fendas muito estreitas. NOTA: As células são homogeneizadas pelas forças de alto corte causadas por uma grande queda de pressão e cavitação.</li>
		<li>Carregue 5 mL de contas de glutationa em uma coluna de fluxo gravitacional e lave as contas com 50 mL de tampão PBS para um total de três vezes.</li>
		<li>Centrifugar o lise celular do homogeneizador de alta pressão a 48.384 x g. Adicione o sobrenante do liseato celular centrifugado (40 mL) às contas de glutationa equilibradas na coluna de fluxo de gravidade e incubar por 30 min a 4 °C. Resuspend as contas de glutationa a cada 10 minutos.</li>
		<li>Após 30 minutos de incubação, abra a torneira da saída da coluna para separar as contas e a fração de fluxo. Descarte a fração de fluxo. Enxágüe as contas restantes de glutationa duas vezes com 50 mL de tampão PBS.</li>
		<li>Adicione 15 mL de tampão de eluição às contas de glutationa e incubar por 30 min. Resuspend as contas a cada 10 minutos.</li>
		<li>Após 30 minutos de incubação, elute o fragmento TRP 1261-1275 marcado pelo GST em um tubo cônico de 50 mL e carga em uma coluna de exclusão de tamanho (grau de preparação), que é equilibrado usando 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) tampão.</li>
		<li>Mantenha a taxa de fluxo de elução da coluna de exclusão de tamanho para 3 mL/min. Coletar as proteínas elucidas à taxa de 5 mL/tubo.</li>
		<li>Identifique o pico da proteína alvo na coluna de exclusão de tamanho analisando os sinais de absorção UV a 280 nm e verifique pela análise do gel SDS-PAGE (parâmetros de eletroforese: 150 V para o gel de empilhamento; 200 V para o gel de resolução). Manche o gel com R250 azul Coomassie.</li>
		<li>Concentre o fragmento de TRP 1261-1275 com etiqueta GST purificada da coluna de exclusão de tamanho para 1 mL usando uma coluna de rotação de ultrafiltração de 15 mL centrifuada a 3.000 x g a 4 °C em uma centrífuga refrigerada de mesa.</li>
		<li>Determine a concentração de proteína concentrada usando a Lei Beer-Lambert. Meça a absorção UV do fragmento TRP 1261-1275 marcado pelo GST a 280 nm usando um espectotômetro.</li>
		<li>Obtenha o coeficiente de extinção em 280 nm importando as sequências proteicas para o programa Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Tipicamente, 1 cultura L de TRP com marca GST 1261-1275 produz 1 mL de 600 μM de proteína (6 x 10-7 mol). Consulte a Tabela 1 para os materiais necessários.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificação do fragmento NORPA 863-1095 com sua marca<ol>
<li>Transforme as células pETM.3C NORPA 863-1095 plasmid20 em células E. coli BL21 (DE3) usando o método de transformação de choque térmico CaCl2 21. Inocular uma única colônia em 10 mL de meio LB e crescer durante a noite a 37 °C. Em seguida, amplie a cultura de semeadura de 10 mL em 1 L de meio LB a 37 °C.</li>
		<li>Após o OD600 das células atingir 0,5, esfrie as células a 16 °C e adicione 0,1 mM IPTG (concentração final) para induzir a superexpressão da proteína alvo e incubar a 16 °C por 18 h.</li>
		<li>Após a superexpressão, pelota 1 L de células cultivadas por centrifugação a 3.993 x g por 20 min e resuspend em 40 mL de tampão de ligação. Em seguida,lise as células resuspended em um homogeneizador de alta pressão a 4 °C como descrito na etapa 1.1.4.</li>
		<li>Carregue 5 mL de ni-contas em uma coluna de fluxo de gravidade e lave três vezes com 50 mL de tampão de ligação.</li>
		<li>Centrifugar o lise celular do homogeneizador de alta pressão a 48.384 x g. Adicione o sobrenante da célula centrifugada lysate às contas ni equilibradas na coluna de fluxo de gravidade e incubar por 30 min a 4 °C. Resuspend as contas Ni a cada 10 minutos.</li>
		<li>Após 30 minutos de incubação, abra a torneira da saída da coluna para separar as contas e a fração de fluxo. Descarte a fração de fluxo e lave as contas ni restantes duas vezes com 50 mL de tampão de lavagem.</li>
		<li>Adicione 15 mL de tampão de eluição às contas ni e incubar por 30 minutos. Resuspend as contas Ni a cada 10 minutos.</li>
		<li>Após 30 minutos de incubação, colete o fragmento NORPA 863-1095 com etiqueta de Seu elucido em um tubo cônico de 50 mL e carregue em uma coluna de exclusão de tamanho (grau de preparação), que é equilibrada usando 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).</li>
		<li>Mantenha a taxa de fluxo de elução da coluna de exclusão de tamanho para 3 mL/min. Coletar a proteína elucida à taxa de 5 mL/tubo.</li>
		<li>Identifique o pico da proteína alvo na coluna de exclusão de tamanho analisando os sinais de absorção UV a 280 nm e verifique pela análise do gel SDS-PAGE (parâmetros de eletroforese: 150 V para o gel de empilhamento; 200 V para o gel de resolução). Manche o gel usando R250 azul Coomassie.</li>
		<li>Concentre o fragmento NORPA 863-1095 com sua marca purificada da coluna de exclusão de tamanho para 1 mL usando uma coluna de rotação de ultrafiltração de 15 mL centrifugada a 3.000 x g a 4 °C em uma centrífuga refrigerada de mesa.</li>
		<li>Determine a concentração de proteína concentrada usando a Lei Beer-Lambert. Meça a absorção UV do fragmento NORPA 863-1095 com marcação UV a 280 nm usando um espectrômetro.</li>
		<li>Obtenha o coeficiente de extinção em 280 nm importando as sequências proteicas para o programa Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Tipicamente, 1 L cultura de seu fragmento NORPA 863-1095 produz 1 mL de 600 μM de proteína (6 x 10-7 mol). Consulte a Tabela 2 para os materiais necessários.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação de cabeças de Drosophila
<ol><li>Coletar moscas adultas em tubos de centrifugação cônica de 50 mL utilizando o método de anestesia DE CO2 2 22,23; congele imediatamente o nitrogênio líquido por 10 minutos e armazene em um congelador de -80°C.</li>
	<li>Depois de coletar um número suficiente de moscas, agite vigorosamente os tubos cônicos congelados de 50 mL à mão para separar as pernas, cabeças, asas e corpos das moscas. Transfira a mistura para três peneiras de aço inoxidável pré-resfriadas (tamanho de malha 20/30/40, respectivamente) e agite as peneiras.</li>
	<li>Em seguida, uma vez que as cabeças não podem passar pela peneira de 40 malhas, use um pincel para varrer as cabeças de mosca da peneira de 40 malhas, transfira-as para tubos cônicos de 50 mL e armazene-as a −80 °C.</li>
	<li>Colete continuamente as moscas e suas cabeças e armazene-as em um congelador de -80 °C até atingir a quantidade necessária para experimentação (0,5 g). Normalmente, para coletar 0,5 g de cabeças, são necessários 35 mL de moscas em um tubo cônico de 50 mL. Consulte a Tabela 3 para obter os materiais necessários.</li>
</ol>3. Purificação do canal Drosophila TRP
<ol><li>Pesar um total de 0,5 g de cabeças e homogeneizar completamente em nitrogênio líquido usando um pilão de argamassa pré-resfriado. Dissolva as cabeças homogeneizadas em 10x v/w tampão de lise (5 mL), incubar em um agitador a 4 °C por 20 min e, em seguida, centrífuga a 20.817 x g por 20 min a 4 °C.</li>
	<li>Colete o supernante spin-down ("20817 g S", Figura 4) e centrifuse-o ainda mais a 100.000 x g por 60 min a 4 °C. Use o supernatante spin-down ("100.000 g S", Figura 4) para o seguinte ensaio de recuo.</li>
	<li>Adicione 1 mL de ni-contas na coluna de fluxo de gravidade e lave as contas com 10 mL de H2O destilado duplo (ddH2O) a 4 °C para um total de três vezes. Equilibre as contas com 10 volumes de coluna de tampão de lise três vezes a 4 °C.</li>
	<li>Adicione 500 μL de 600 μM purificado Sua proteína NORPA 863-1095 (3 x 10-7 mol) na coluna Ni e incubar por 30 min a 4 °C. Resuspend as contas a cada 10 minutos.</li>
	<li>Abra a torneira de saída da coluna para separar as contas e a fração de fluxo. Pegue a fração de fluxo para análise SDS-PAGE (NORPA F, Figura 4). Nesta seção, as proteínas iscas são imobilizadas nas contas ni.</li>
	<li>Lave as contas ni com 10 volumes de coluna de tampão de lise (10 mL) a 4 °C e mantenha a fração de lavagem para análise SDS-PAGE (Wash 1, Figura 4A). Repita as etapas acima e mantenha a amostra para análise SDS-PAGE (Wash 2, Figura 4A). Nesta seção, as proteínas de isca excessivas nas contas-de-ni são removidas.</li>
	<li>Adicione o supernatante da cabeça de Drosophila homogeneizado após centrifugação de 100.000 x g na coluna Ni a 4 °C, onde o fragmento NORPA 863-1095 marcado foi imobilizado.</li>
	<li>Incubar o supernante com as contas ni a 4 °C por 30 min. Resuspend as contas a cada 10 minutos. Em seguida, abra a torneira de saída da coluna para separar as contas e a fração de fluxo.</li>
	<li>Colete o supernatante para análise SDS-PAGE (Dro head lysis F, Figure 4A). Nesta seção, os complexos proteicos INAD (INAD/TRP/ePKC) na cabeça homogeneizados são capturados pelos fragmentos norpa 863-1095 imobilizados nas contas-de-ni.</li>
	<li>Lave as contas ni com 10 volumes de coluna de tampão de lise (10 mL) a 4 °C e mantenha o sobrenatante da precipitação gravitacional para análise SDS-PAGE (Wash 3, Figure 4A). Repita as etapas acima e colete o supernatante para análise SDS-PAGE (Wash 4, Figura 4A). Nesta seção, as proteínas não ligadas nas contas ni são removidas.</li>
	<li>Adicione 500 μL de 600 μM de proteína TRP 1261-1275 com etiqueta GST (3 x 10-7 mol) nas contas ni e incubar por 20 min a 4 °C. Resuspend as contas a cada 10 minutos.</li>
	<li>Colete a fração elucida da coluna de gravidade (TRP E1, Figura 4B), que contém o canal erógeno Drosophila TRP. Repita as etapas acima e colete a fração de eluição (TRP E2, Figura 4B). Nesta etapa, utilizando os fragmentos TRP 1261-1275 marcados pelo GST como concorrente, os canais TRP são elucidos dos complexos proteicos INAD capturados (INAD/TRP/ePKC) nas contas Ni.</li>
	<li>Lave as contas ni com 10 volumes de coluna de tampão de ligação (10 mL; Tabela 1) a 4 °C e coletar a fração de lavagem para análise SDS-PAGE (Wash 5, Figura 4B).</li>
	<li>Adicione 500 μL de tampão de eluição (Tabela 1) nas contas ni e incubar por 20 min a 4 °C. Recolher a fração de elução da coluna de fluxo gravitacional (NORPA E1, Figura 4B). Repita as etapas acima e colete a fração de eluição (NORPA E2, Figura 4B).</li>
	<li>Utilizando o tampão de elução, elute o fragmento NORPA 863-1095 marcado por Sua marca acompanhado dos complexos proteicos INAD/ePKC. Em seguida, resuspende as contas Ni em 500 μL de buffer de ligação.</li>
	<li>Leve as ni-contas resuspended para executar o SDS-PAGE (manchado por R250 azul Coomassie) para analisar a eficiência da elução e avaliar se o buffer elute funciona (contas, Figura 4B). Consulte a Tabela 4 para obter os materiais necessários.</li>
</ol>4. Purificação da coluna de exclusão de tamanho do canal Drosophila TRP
<ol><li>Instale uma coluna de exclusão de tamanho (grau analítico) no sistema de purificação de proteínas. Equilibre a coluna com o tampão da coluna (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,75 mM DDM), que é filtrado por um filtro de 0,45 μm.</li>
	<li>Concentre a fração TRP E1 e E2 a partir da etapa 3.14 usando uma coluna de rotação de ultrafiltração de 4 mL, centrifugada a 3.000 x g a 4 °C em uma centrífuga refrigerada.</li>
	<li>Enxágüe o laço amostral com o tampão da coluna e carregue a amostra no laço amostral. Injete a amostra na coluna de exclusão de tamanho e elute as proteínas com uma taxa de fluxo adequada (0,5 mL/min).</li>
	<li>Identifique o pico da proteína alvo por absorção a 280 nm e execute um gel SDS-PAGE para detectar o canal 1RP endógeno e endógeno purificado (Figura 5). Consulte a Tabela 5 para obter os materiais necessários.</li>
</ol>

<ol><li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).</li>
<li>Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyunsaturated+fatty+acids+activate+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL.</a> Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).</li>
<li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+binds+to+Drosophila+TRP+with+an+unexpected+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode.</a> Structure. 29 (4), 330-344 (2021).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intracellular+Ca2%2B+chelation+on+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+A%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).</li>
<li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li>
<li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide-mediated+phototransduction+in+Drosophila+photoreceptors%3A+the+role+of+Ca2%2B+and+trp%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp.</a> Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).</li>
<li>Delgado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+opening+of+the+TRP+channel+in+isolated+membrane+patches+excised+from+photosensitive+microvilli+from+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors.</a> Neuroscience. 396, 66-72 (2019).</li>
<li>Lev, S., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activity+of+the+TRP-like+channel+depends+on+its+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">The activity of the TRP-like channel depends on its expression system.</a> Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).</li>
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<li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+INAD+scaffold+is+a+dynamic%2C+redox-regulated+modulator+of+signaling+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye.</a> Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).</li>
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<li>Ye, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+INAD+PDZ+tandem-mediated+plc%CE%B2+binding+in+Drosophila+photo+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+heat+shock+step+on+bacterial+transformation+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency.</a> Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+laboratory+handbook.+Second+Edition%22">Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition</a>. 80 (2), The Quarterly Review of Biology. (2005).</li>
<li>Nicolas, G., Sillans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+and+latent+effects+of+carbon+dioxide+on+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).</li>
<li>Arachea, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+selection+for+enhanced+extraction+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins.</a> Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

INAD, que contém cinco domínios PDZ, é o principal organizador das máquinas de fototransdução Drosophila. Estudos anteriores mostraram que o INAD PDZ3 se liga à cauda terminal C do canal TRP com especificidade requintada (KD = 0,3 μM)18. Inad PDZ45 tandem interage com o fragmento NORPA 863-1095 com uma afinidade de ligação extremamente alta (KD = 30 nM). Esses achados fornecem uma base bioquímica sólida para projetar a purificação de afinidade mais a estratégia de co...

Fototransdução é um processo onde fótons absorvidos são convertidos em códigos elétricos de neurônios. Ele retransmite exclusivamente opsinas e a seguinte cascata de sinalização acoplada à proteína G em ambos os vertebrados e invertebrados. Em Drosophila, usando seus cinco domínios PDZ, a inativação de proteína de andaime-não-pós-potencial D (INAD) organiza um complexo de sinalização supramolecular, que consiste em um canal de receptores transitórios (TRP), phospholipase Cβ/No receptor potencial A (PLCβ/NORPA) e proteína específica dos olhos quinase C (ePKC)1. A formação deste complexo de sinalização supramolecular garante a localização subcelular correta, alta eficiência e especificidade das máquinas de fototransdução de Drosophila. Neste complexo, canais TRP sensíveis à luz atuam como efeitos a jusante da NORPA e mediam o fluxo de cálcio e a despolarização dos fotorreceptores. Estudos anteriores mostraram que a abertura do canal Drosophila TRP é mediada por prótons, interrupção do ambiente lipídedo local ou força mecânica 2,3,4. O canal Drosophila TRP também interage com a calmodulina5 e é modulado pelo cálcio pelo feedback positivo e negativo 6,7,8.
Até agora, estudos de eletrofisiologia sobre o mecanismo de gating dos canais Drosophila TRP e TRP-like (TRPL) foram baseados em patches de membrana excisada, gravações de células inteiras de fotorreceptores drosophila dissociados e canais hetero-expressos em células S2, SF9 ou HEK 2,9,10,11,12,13, mas não em canais purificados. As informações estruturais do canal TRP Drosophila de comprimento completo também permanecem incertas. Para estudar as propriedades eletrofisiológicas da proteína purificada em um ambiente de membrana reconstituída e obter informações estruturais do canal TRP Drosophila de comprimento completo, obter canais de TRP purificados é o primeiro passo necessário, semelhante às metodologias utilizadas nos estudos do canal TRP mamífera 14,15,16,17.
Recentemente, com base no mecanismo de montagem do complexo proteico INAD 18,19,20, uma estratégia de purificação de afinidade mais competição foi desenvolvida pela primeira vez para purificar o canal TRP a partir de homogeneizados da cabeça de Drosophila por contas streptavidin 5. Considerando a baixa capacidade e o custo caro das contas streptavidin, um protocolo de purificação melhorado é introduzido aqui que usa proteína isca sua marcada e contas ni-beads de baixo custo correspondentes com capacidade muito maior. O método proposto ajudará a estudar o mecanismo de gating do canal TRP a partir de ângulos estruturais e a medir as propriedades eletrofisiológicas do canal TRP com proteínas purificadas.

<table><tbody><tr><td>Cepas bacterianas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Células competentes</td><td>Novagen</td><td>69450</td><td>Superexpressão de</td></tr> <tr><td>proteínasModelos experimentais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D.melanogaster: W1118 cepa</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>BDSC:3605</td><td>Drosophila preparação de cabeça</td></tr><tr><td><forte > Material< / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>20/30/40 malha peneiras de aço inoxidável</td><td>Jiufeng empresa de malha de metal</td><td>GB / T6003.1</td><td>Drosophila preparação de cabeça</td></tr><tr><td>30% Acrilamida-N, N &prime; -Metilenobisacrilamida (29: 1)</td> <td>Lablead</td><td>A3291</td><td>SDS-PAGE preparação de gel</td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td> Preparação de gel <td>Invitrogen</td><td>HC2005</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Inibidor de protease de coquetel</td><td>Roche</td><td>05892953001</td><td>Inibidor de protease</td></tr><tr><td>Coomassie azul brilhante R-250</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100472-0025</td><td>Coloração em gel SDS-PAGE</td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A620058-0100</td><td>Preparação</td></tr> <tr><td>de tampão de coluna de exclusão de tamanhoSal dissódico do ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500838-0500</td><td>Preparação do tampão da coluna de exclusão de tamanho</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610235-0005</td><td>Preparação do tampão SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Glutationa Sepharose 4 grânulos de fluxo rápido</td><td>Cytiva</td><td>17513202</td><td>Cromatografia de afinidade</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500529-0001</td><td>Tampão de eluição preparação para coluna de Ni</td></tr><tr><td>Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600168-0025</td><td>Indução de superexpressão de proteína</td></tr><tr><td>LB Caldo em pó</td><td>Sangon Biotech</td><td>A507002-0250</td><td>E.coli. cultura de células</td></tr><tr><td>L-glutationa reduzida (GSH)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G4251-100G</td><td>Preparação de tampão de eluição para grânulos de glutationa</td></tr><tr><td>Ni-Sepharose excel grânulos Cytiva</td><td></td><td>17371202</td><td>Cromatografia de afinidade</td></tr><tr><td>N-Dodecil beta-D-maltosídeo (DDM)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610424-001</td><td>Detergente para purificação de proteínas</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T9281-100ML</td><td>SDS-PAGE preparação de gel</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607008-0500</td><td>Tampão de homogeneização para célula E.coli.</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Lablead</td><td>P0754-25G</td><td>Inibidor de protease</td></tr><tr><td>Marcador de proteína pré-fabricada</td><td>Thermo Scientific</td><td>26619/26616</td><td>Escada de proteína prestada</td></tr><tr><td>Coluna de exclusão de tamanho (grau de preparação)</td><td>Cytiva</td><td>28989336</td><td>HiLoad 26/60 Coluna Superdex 200 PG</td></tr><tr><td>Coluna de exclusão de tamanho (grau analítico)</td><td>Cytiva</td><td>29091596</td><td>Superose 6 Aumento 10/300 GL coluna</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501218-0001</td><td>Preparação do tampão de purificação de proteínas</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500228-0001</td><td>SDS-PAGE preparação de gel/tampão</td></tr><tr><td>Base Tris Sigma-aldrich</td><td></td><td>T1503-10KG</td><td>Preparação do tampão de purificação de proteínas</td></tr><tr><td>Ultrafiltração spin coluna</td><td>Millipore</td><td>UFC901096/801096</td><td>Concentração</td></tr> de <tr><td>proteínasEquipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balança Analítica</td><td>DENVER</td><td>APX-60</td><td>Metage de Drosophila head</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada de alta velocidade de mesa para tubos de centrifugação cônicos de 15mL e 50mL</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Concentração de proteínas</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada de alta velocidade de mesa Tubos de centrifugação de 1,5mL</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Centrifugação de lisado de cabeça Drosophila após homogeneização</td></tr><tr><td>Coluna de fluxo de gravidade vazia (Diâmetro Interno=1,0cm)</td><td>Bio-Rad</td><td>738-0015</td><td>Purificação de proteínas TRP</td></tr><tr><td>Coluna de fluxo de gravidade vazia (Diâmetro Interno=2,5cm)</td><td>Bio-Rad</td><td>738-0017</td><td>Purificação de iscas e proteínas concorrentes de E.coli.</td></tr><tr><td>Gel Sistema de Documentação</td><td>Bio-Rad</td><td>Universal Hood II Gel Doc XR Sistema</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada de alta velocidade</td><td>Beckman coulter</td><td>Avanti J-26 XP</td><td>Centrifugação de células E.coli. celular/lisado celular</td></tr><tr><td>Homogeneizador de alta pressão</td><td>UNION-BIOTECH</td><td>UH-05</td><td>Homogeneização de células E.coli.</td></tr><tr><td>Tanque de nitrogênio líquido</td><td>Taylor-Wharton</td><td>CX-100</td><td>Drosophila head preparação</td></tr><tr><td>Sistema de purificação de proteínas Cytiva</td><td>AKTA purificador</td><td>de</td><td>proteínas</td></tr><tr><td>Refrigerador (-80&deg; C)</td> <td>Thermo</td><td>900GP</td><<td>em>Drosophila head preparação</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>MAPADA</td><td>UV-1200</td><td>OD600 medição de células E.coli.</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000c</td><td>Determinação da concentração de proteína</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman coulter</td><td>Optima XPN-100 Ultracentrífuga</td><td>Ultracentrifugação</td></tr></tbody></table>

purificação dos canais potenciais do receptor transitório endogenous drosophila

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

A fototransdução de drosophila é uma das vias de sinalização mais rápidas conhecidas por proteína G. Para garantir a especificidade e eficiência dessa cascata, o canal de cáção de cálcio (Ca2+)permeável, o potencial de receptor transitório (TRP), liga-se firmemente à proteína do andaime, inativação-não-pós-potencial D (INAD), e forma um grande complexo proteico de sinalização com proteína específica dos olhos quinase C (ePKC) e phospholipase Cβ/No receptor potencial A (PLC/NORPA). No entanto, as propriedades bioquímicas do canal Drosophila TRP permanecem incertas. Com base no mecanismo de montagem do complexo proteico INAD, foi desenvolvida uma purificação de afinidade modificada mais estratégia de concorrência para purificar o canal endorfário. Primeiro, o fragmento de histidina purificada (His)-tagged NORPA 863-1095 foi vinculado a ni-contas e usado como isca para puxar para baixo o complexo proteico inad endógeno de Dphila cabeça homogeneiza. Em seguida, o fragmento TRP 1261-1275 com a marca excessiva purificada foi adicionado às contas ni para competir com o canal TRP. Finalmente, o canal TRP no supernante foi separado do peptídeo TRP 1261-1275 excessivo por cromatografia de exclusão de tamanho. Este método permite estudar o mecanismo de gating do canal Drosophila TRP a partir de ângulos bioquímicos e estruturais. As propriedades de eletrofisiologia dos canais TRP de Drosophila purificados também podem ser medidas no futuro.

Neste artigo, demonstra-se um método de purificação de proteínas para purificar o canal Drosophila TRP endógeno (Figura 1).
Em primeiro lugar, a expressão e purificação da proteína recombinante são aplicadas para obter a isca e proteínas concorrentes. Em seguida, um fragmento TRP 1261-1275 marcado pelo GST é expresso em células E. coli BL21 (DE3) em média LB e purificado usando contas de glutationa e uma coluna de exclusão de tamanho (<strong cla...

Com base no mecanismo de montagem do complexo proteico INAD, neste protocolo, foi desenvolvida uma purificação de afinidade modificada mais estratégia de concorrência para purificar o canal endogenso Drosophila TRP.

Purificação dos canais potenciais do receptor transitório Endogenous Drosophila

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

Neste protocolo, demonstramos o processo de purificação para obter canais TRP purificados e completos, que é o primeiro passo necessário para estudar propriedades eletrofisiológicas, e obter informações estruturais do canal TRP Drosophila de comprimento completo. Com base no mecanismo de amostragem do complexo proteico INAD e usando contas de níquel de baixo custo com capacidade muito maior, a quantidade suficiente de canais TRP pode ser purificada a partir de cabeças de mosca. Demonstrando o procedimento será Yuyang Liu, um técnico do nosso laboratório.Para começar, transforme o pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 plasmid em células E.coli BL21, usando o método de transformação do choque térmico do cloreto de cálcio. Inocular uma única colônia em 10 mililitros de luria Bertani médio, e crescer durante a noite a 37 graus Celsius. Adicione os 10 mililitros de cultura de semeadura em um litro de luria Bertani média e incubar a 37 graus Celsius.Após a densidade óptica das células atingir 0,5, esfrie as células a 16 graus Celsius, e adicione 0,1 milimolar isopropílico-beta-D-1-thiogalactopyranoside. Após a superexpressão, pelota um litro de células cultivadas por centrifugação, e resuspend em 40 mililitros de soro fisiológico tamponado com fosfato. Carregue as células resuspended em um homogeneizador de alta pressão, pré-resfriado a quatro graus Celsius.Aumente lentamente a pressão do homogeneizador para 800 bar. Abra a guia de entrada e deixe as células resuspensadas passarem circularmente por uma válvula com fendas estreitas. Carregue cinco mililitros de contas de glutationa em uma coluna de fluxo de gravidade, e lave as contas com 50 mililitros de tampão salino tampão salino tampão tampão tampão salino tamponado com fosfato, por um total de três vezes.Centrifugar a célula do homogeneizador de alta pressão a 48,384 vezes G.Adicione cerca de 40 mililitros do supernatante do lise celular centrifugado às contas de glutationa equilibradas na coluna de fluxo gravitacional, e incubar por 30 minutos a 4 graus Celsius. Resuspend as contas de glutationa a cada 10 minutos. Após 30 minutos de incubação, abra a guia de saída da coluna para separar as contas e a fração de fluxo.Descarte a fração de fluxo e enxágue as contas restantes de glutationa duas vezes, com 50 mililitros de tampão salino tampão salino tampão tampão-sal protegido por fosfato. Adicione 15 mililitros de tampão de elução às contas de glutationa e resuspenque as contas a cada 10 minutos. Elute o fragmento TRP 1261-1275 com etiqueta GST em um tubo cônico de 50 mL, e carregue-o em uma coluna de exclusão de tamanho.Colete cinco mililitros das proteínas elucidadas por tubo, e concentre os fragmentos purificados em um mililitro por centrifugação em uma coluna de rotação de ultrafiltração em uma centrífuga refrigerada. Para purificar o fragmento NORPA 863-1095 marcado, siga o procedimento previamente demonstrado usando contas de níquel. Colete moscas adultas em tubos de centrífuga cônica de 50 mililitros e congele-as em nitrogênio líquido por 10 minutos.Agite vigorosamente os tubos congelados à mão e transfira a mistura para três peneiras de aço inoxidável pré-resfriadas. Agite as peneiras e varrer as cabeças de mosca da peneira de 40 malhas usando um pincel. Transfira-os para cinco tubos cônicos mililitros e armazene-os a menos 80 graus Celsius.Homogeneize 0,5 gramas de cabeças em nitrogênio líquido usando uma argamassa pré-resfriada e pilão. Dissolva as cabeças homogeneizadas em cinco mililitros de tampão de lise 10X, seguido de centrifugação a 20,817 vezes G a quatro graus Celsius por 20 minutos. O supernante de rotação é ainda mais centrifutado 100.000 vezes G a quatro graus Celsius por 60 minutos.Adicione um mililitro de contas de níquel na coluna de fluxo de gravidade, e lave as contas três vezes com 10 mililitros de água dupla destilada a quatro graus Celsius. Equilibre as contas com 10 volumes de coluna de tampão de lise, três vezes a quatro graus Celsius. Adicione 500 microlitadores de 600 micromolar purificados sua proteína NORPA 863-1095 na coluna de níquel, e incubar a coluna.Resuspend as contas a cada 10 minutos. Abra a torneira da saída da coluna para separar as contas e a fração de fluxo e lave as contas de níquel com 10 mililitros de tampão de lise fria. Em seguida, adicione o supernatante frio da cabeça de Drosophila homogeneizar na coluna de níquel.Após a incubação, lave as contas com 10 mililitros de tampão de lise e adicione 500 microliters de 600 micromolars de TRP 1261-1275 com etiquetas GST nas contas. Recolhe a fração elucida da coluna de gravidade. Lave as contas de níquel com 10 mililitros de tampão de ligação.Em seguida, adicione o tampão de eluição e colete a fração de elução da coluna de fluxo de gravidade. Concentre as frações eluidas da purificação do canal Drosophila TRP, usando uma coluna de giro de ultrafiltração de quatro mililitros. Injete a amostra na coluna de exclusão de tamanho e eute as proteínas com uma taxa de fluxo razoável.O fragmento TRP 1261-1275 com marca GST foi expresso em células E.coli e purificado usando contas de glutationa e uma coluna de exclusão de tamanho. Da mesma forma, o fragmento NORPA 863-1095 marcado foi expresso e purificado usando contas de níquel e coluna de exclusão de tamanho. O canal TRP elucido é separado do peptídeo TRP 1261-1275 com etiqueta GST, por cromatografia de exclusão de tamanho.Como subproduto, os complexos inad, ePKC, NORPA 863-1095 são obtidos após a competição de peptídeos TRP 1261-1275. A coisa mais importante a se lembrar ao tentar este protocolo, é homogeneizar as cabeças de mosca em nitrogênio líquido e resolver o homogeneato no buffer contendo um detergente chamado DDM. Após este procedimento, também podemos purificar todo o complexo proteico INAD que pode ser usado para estudar seus mecanismos de montagem e regulação.Uma possível aplicação futura deste método será estudar as informações estruturais do canal Endogenous Drosophila TRP usando técnicas Cryo-EM. Além disso, a medição das propriedades eletrofisiológicas dos canais de TRP endógenos e endógenos purificados em membrana lipídica bicamada artificial também é viável.

purification-endogenous-drosophila-transient-receptor-potential

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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