Avaliação funcional da cinesina-7 CENP-E em espermatócitos utilizando inibição in vivo , imunofluorescência e citometria de fluxo

A meiose é um evento conservado evolutivamente em eucariotos, essencial para a gametogênese e reprodução sexuada. Nosso protocolo fornece um método eficaz para estudos de divisão meiótica e espermatogênese. Descrevemos uma série de protocolos para análise de espermatócitos.

Esta técnica pode ser aplicada para observação do fuso meiótico, cromossomos homólogos e organelas subcelulares em espermatócitos. Este método pode ser utilizado para a análise da divisão meiótica, geração de modelos animais de edição gênica e transfecção gênica em tecidos ou órgãos. Os experimentadores devem manter um ambiente estéril durante a cirurgia abdominal e prestar atenção à temperatura, ao tempo e às principais condições experimentais desse protocolo.

Quem demonstrará o procedimento será a Miss Meng-Fei Xu, pós-graduada do meu laboratório. Iniciar a construção do modelo de camundongo inibidor da proteína E do centrômero mediado por GSK923295 ou CENP-E amarrando os membros de camundongos anestesiados e fixando-os na bandeja de cera. Depois de desinfetar a área cirúrgica, use um bisturi estéril para fazer uma abertura de cinco milímetros na cavidade abdominal do camundongo seguido da colocação de pinças cirúrgicas estéreis na pele.

Em seguida, puxe o coxim de gordura epididimal com pinça dissecante estéril para localizar os testículos com a ajuda de pinças estéreis. Depois de fixar os testículos com pinças estéreis sob um estereoscópio, injete lentamente 10 microlitros de GSK923295 nos túbulos seminíferos em uma concentração final de 10 micromolares usando 10 microlitros de Riodo. Quando feito, empurre os testículos de volta para a cavidade abdominal e suture o local cirúrgico conforme descrito no manuscrito do texto.

Para a desidratação do gradiente dos testículos de camundongos coletados, incubar sequencialmente a amostra em vários meios, conforme descrito no manuscrito. Após a incubação seriada, coloque o tecido no fundo da caixa de incorporação e adicione a parafina derretida na caixa. Para a solidificação completa da parafina, resfriar as amostras a quatro graus Celsius por seis horas.

Posteriormente, fixe a amostra no suporte do ultramicrótomo mantendo o ângulo entre a amostra e a superfície da faca em 5 a 10 graus. Ajuste a espessura de corte para cinco micrômetros para preparar as seções de cinco micrômetros de espessura usando um ultramicrótomo. Após a preparação, espalhe a lâmina de amostra em banho-maria a 40 graus Celsius antes de secar as seções no secador de lâminas por 12 horas a 37 graus Celsius.

Após 12 horas, realizar incubação sequencial das lâminas conforme explicado anteriormente. Em seguida, enxaguar as lâminas em água destilada por cinco minutos, seguido de coloração com Solução de Hematoxilina de Mayer por seis minutos à temperatura ambiente. Em seguida, enxágue as lâminas coradas em água corrente por cinco minutos e incube com água destilada por dois minutos.

Incubar as lâminas em cloridrato de etanol a 1% por três segundos e, em seguida, enxaguar e água corrente por dois minutos. Manchar a amostra com eosina a 1% por 15 segundos, seguida de incubação seriada. Quando terminar, sele as lâminas usando 15 microlitros de goma neutra e uma lamínula de 24 por 50 milímetros.

Para imunofluorescência, colocar a lâmina na solução de recuperação de antígeno para ferver sob alta pressão em uma panela de pressão por quatro minutos para recuperação do antígeno. Em seguida, resfriar a lâmina naturalmente à temperatura ambiente antes de enxaguar duas vezes com água destilada por cinco minutos e com PBS por cinco minutos. Para permeabilizar as células, incubar a lâmina em 500 microlitros de Triton X-100 a 0,25% em PBS por 10 minutos e, em seguida, enxaguar as lâminas com PBS por cinco minutos três vezes.

Para bloqueio antigênico, incubar a amostra com 300 microlitros de albumina de soro bovino a 3% ou BSA por uma hora e com os anticorpos primários em BSA 3% em PBST por 16 horas a quatro graus Celsius. Após a incubação, coloque a lâmina em uma caixa umidificada para evitar que os tecidos sequem. Reaqueça as lâminas naturalmente à temperatura ambiente por 30 minutos.

Descarte o anticorpo primário e enxágue a lâmina em PBST por cinco minutos três vezes. Diluir anticorpos secundários com BSA a 3% e PBST. Em seguida, incubar a amostra com anticorpos secundários diluídos por uma a duas horas a 37 graus Celsius.

Após enxaguar a amostra em PBST por cinco minutos cinco vezes, corar os núcleos com 50 microlitros DAPI por cinco minutos à temperatura ambiente. Monte a tampa-deslizamento com o meio de montagem anti-desbotamento e sele a tampa com esmalte. Para a citometria de fluxo, colete testículos de camundongos em placas de Petri de seis centímetros e corte os testículos em pedaços de um milímetro cúbico usando tesoura cirúrgica.

Em seguida, digerir os testículos em um mililitro de colagenase a 1% em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro por 10 minutos a 37 graus Celsius. Para precipitar as células espermatogênicas, centrifugar a amostra a 1.000 G por cinco minutos e descartar o sobrenadante antes de adicionar um mililitro de solução de EDTA de tripsina a 0,25% na amostra por 20 minutos a 37 graus Celsius. Posteriormente, centrifugar a amostra a 1.000 G por cinco minutos.

Descarte o sobrenadante para incubar as células precipitadas com um mililitro de etanol 70% frio por mais de oito horas a quatro graus Celsius. Após centrifugação a 1.000 G por cinco minutos, coletar sedimentos celulares e corar as células espermatogênicas com 500 microlitros de iodeto de propídio ou solução corante de PI a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, filtre a amostra usando uma tela de malha 300 para eliminar restos celulares e colete as células em um tubo de fluxo para armazenar as células a quatro graus Celsius.

Detecte sinais de fluorescência e espalhamento de luz no comprimento de onda de excitação a 488 nanômetros usando um citômetro de fluxo. Analise o conteúdo de DNA na amostra e o espalhamento de luz usando o software ModFit MF LT 32. Após a injeção testicular de GSK923295, a onda espermatogênica foi alterada nos túbulos seminíferos devido à inibição do CENP-E.

Entretanto, a onda espermatogênica nos túbulos seminíferos foi regular e organizada no grupo controle. Observou-se que os diversos cromossomos homólogos não estavam alinhados na placa equatorial após a inibição do CENP-E. Além disso, a inibição do CENP-E levou ao aumento de espermatócitos de metáfase I nos túbulos seminíferos.

A análise de imunofluorescência demonstrou diminuição do número de células anti-synaptonemal complex protein three ou SYCP3 positivas por túbulo seminífero após inibição do CENP-E. Por outro lado, os pontos SYP3 por célula metafásica e os estiramentos SYP3 por célula não foram afetados nos GSK92395 grupos. As distâncias dos polos fusiformes nos espermatócitos da metáfase I foram aumentadas devido à inibição do CENP-E.

A análise representativa demonstra que a inibição do CENP-E resultou na diminuição das células haploides no grupo GSK 923295 quando comparado ao controle. As proporções de células diploides e aneuploidias não foram significativamente influenciadas após a inibição do CENP-E. Por outro lado, as proporções das células tetraploides aumentaram no grupo GSK923295 do que no grupo controle.

A análise por microscopia eletrônica de transmissão das células espermatogênicas mostrou a organização interrompida das células espermatogênicas no grupo GSK923295. O experimentador deve prestar atenção à posição de injeção, dose da droga, método de injeção e método de sutura durante a cirurgia abdominal e injeção testicular. Esta técnica, juntamente com a eletroporação in vivo focada nas proteínas-alvo e as ferramentas de edição gênica, pode ser usada no campo da divisão miótica e espermatogênese.