Name: Mantendo culturas laboratoriais de Gryllus bimaculatus, um modelo ortopéde versátil para agricultura de insetos e fisiologia de invertebrados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprenda métodos padronizados de criação laboratorial de Gryllus bimaculatus para pesquisa em agricultura de insetos e fisiologia de invertebrados. Este protocolo garante resultados consistentes em estudos de organismos modelo.

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O financiamento para este projeto foi possível através de subvenções internas da Universidade de Wisconsin-Madison. Sinceros agradecimentos a Kevin Bachhuber da Bachhuber Consulting Inc. pelo acesso ao seu guia inédito para a criação comercial de críquete e a Michael Bartlett Smith por sua ajuda no refino e solução de problemas desses métodos.

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Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

A simplicidade dessa abordagem para a criação de críquete pode beneficiar uma série de áreas de pesquisa e representa um modelo genérico para a criação de críquete bem-sucedida, facilmente adaptável a uma variedade de necessidades experimentais. Comparado a vários outros estudos de G. bimaculatus, o tamanho adulto do corpo individual é menor e a maturação é mais lenta14, o que atribuímos à temperatura de criação abaixo do ideal imposta a nós por circunstância. Os métodos descritos acima f...

Como tipificado pelo inseto icônico, a mosca-das-frutas Drosophila melanogaster, o uso de insetos como organismos modelo de laboratório fornece vantagens distintas para estudos em genética, toxicologia e fisiologia1. O pequeno tamanho dos insetos reduz o espaço necessário para as culturas e a quantidade de ração e materiais consumíveis necessários. Muitos insetos se reproduzem rapidamente tornando-os exclusivamente adequados à criação de linhas genéticas especializadas e estudos que requerem a avaliação de múltiplas gerações sucessivas.
Muitos estudos se concentram em insetos holometabolosos como a Drosophila, que exibem metamorfose completa e pupação. No entanto, outros modelos estão disponíveis, incluindo Gryllus bimaculatus (De Geer), o críquete de campo de dois avistados. G. bimaculatus é um inseto paurometabolous que sofre entre 7 e 11 instars ninfas antes de atingir a maturidade sexual2. Este grilo exibe uma ampla gama de comportamentos relacionados à seleção sexual, incluindo estridulação, exibições territoriais e guarda-mate3. Grilos imaturos são diferentes das larvas de espécies de insetos holometabolos, pois eles, semelhantes a muitos jovens paurometabolos, são capazes de regenerar membros perdidos e danificados durante a ecdysis4. Além disso, o genoma totalmente sequenciado de G. bimaculatus foi publicado em 20215. Essas características tornam esses grilos atraentes como alvo para pesquisas básicas.
Grilos de campo com dois avistados são amplamente criados para comida humana e ração animal. A escala dessas operações é muitas vezes muito maior do que para pesquisas laboratoriais 6,7. Apesar da diferença de escala, os desafios enfrentados pelos pesquisadores se sobrepõem muito aos encontrados pelos agricultores comerciais de críquete. Essas considerações convergem no contexto de pesquisas baseadas em laboratório com o objetivo de melhorar a produção de insetos comestíveis. À medida que a indústria de insetos comestíveis continua a evoluir e crescer, otimizar os insumos alimentares e uma miríade de outros aspectos da produção é um objetivo primário8. Estudos de laboratório que demonstram melhorias medidas na eficiência de criação, sobrevivência ou tempo de geração nesses grilos têm o potencial de ajudar a aumentar a rentabilidade das operações de agricultura de críquete a longo prazo.
Protocolos padronizados de criação permitem uma comparação mais estreita entre estudos que investigam a otimização da criação. Até o momento, foram publicados poucos protocolos aprofundados para a criação de G. bimaculatus em laboratório. Um protocolo ideal refletiria as condições encontradas nas operações de críquete do mundo real, mantendo as condições estritamente controladas necessárias para medir com precisão as mudanças no desempenho de crescimento decorrentes de tratamentos experimentais e destacando estratégias de mitigação de riscos. Os métodos descritos neste artigo foram desenvolvidos com base em protocolos, técnicas e aparelhos publicados usados para criar uma variedade de espécies de críquete em uma ampla gama de escalas de produção laboratorial e comercial 2,9,10,11,12. Esses métodos também são informados por várias fontes não revisadas por pares, incluindo boletins técnicos inéditos e comunicação pessoal com agricultores comerciais de críquete na América do Norte. Este protocolo foi desenvolvido com a intenção de facilitar o estabelecimento de culturas laboratoriais de G. bimaculatus especificamente para uso em ensaios relacionados à agricultura de insetos.

<table><tbody><tr><td>Caixote de 31 qt (29,3 L) com tampa de pressão</td><td>HOMZ</td><td>3430CLBL</td><td>Usado para abrigar reprodutores</td></tr><tr><td>de 3 andares/12 bandejas Suporte de Luz de Crescimento</td><td>Fischer Scientific</td><td>NC1938548</td><td></td></tr><tr><td>50-gal (189.27L) com tampa</td><td>Sterilite</td><td>#14796603</td><td>Usado como contenção secundária ao manusear grilos</td></tr><tr><td>Cilindro graduado de polipropileno de 50 mL</td><td>Fischer Scientific</td><td>S95171</td><td></td></tr><tr><td>Caixote de 7,5 qt (7,1 L) com tampa de pressão</td><td>HOMZ</td><td>3410CLBL</td><td>Usado para abrigar estoque expirado</td></tr><tr><td>Accuris 500 g x 0,01 g Balance</td><td>Fabricado pela Accuris, uma subsidiária da Benchmark Scientific</td><td>W3300-500</td><td>Comprado da Dot Scientific através do serviço de compra do sistema da Universidade de Wisconsin "ShopUW+"</td></tr><tr><td>Ace Premier 1 Inch Flat Chip Brush</td><td>Ace Hardware&nbsp;</td><td>#1803261</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art SP Scienceware garrafa de lavagem de água deionizada</td><td>Fischer Scientific</td><td>03-421-160&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tela de janela de alumínio brilhante&nbsp;</td>Copos de Porção de Plástico Descartáveis <td>Descartáveis Phifer</td><td>UNSPSC# 11162108</td><td>Tamanho de Malha 18 x 16"</td></tr><tr><td>5.5 oz com tampas</td><td>Wal-Mart</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Água</td><td></td><td></td><td></td>Deionizada</tr><tr><td>Diablo 4-4/8" x 13 TPI Lâmina de Serra Tico-Tico Bi-Metal de Acabamento Ultra Fino</td><td>Home Depot</td><td>#313114935</td><td></td></tr><tr><td>Egg Filler Flats-Paper, 12 x 12"</td><td>Uline</td><td>S-5189</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri da Fisherbrand com Tampa Transparente 100 x 15mm</td><td>Fischer Scientific</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri da Fisherbrand com Tampa Transparente 60 x 15mm</td><td>Fischer Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Georgia-Pacific Envision Toalhas de Papel Marrom</td><td>Home Depot</td><td>#205675843</td><td></td></tr><tr><td>Infinity Tough Guy bastões de cola quente de alto desempenho</td><td>Infinity Bond</td><td>Infinity IM-Tough-Guy-12</td><td></td></tr><tr><td>Mazuri Cricket Diet</td><td>Land O' Lakes International</td><td>SKU#&nbsp; 3002219-105</td><td></td></tr><tr><td>Stanley TimeIt Twin 2-outlet Grounded Mechanical 24 Hour Timer</td><td>Wal-Mart</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Solo de Recuperação Vermont Organics 11 lb Bloco de Coir</td><td>Home Depot</td><td>#300679904</td><td></td></tr></tbody></table>

mantendo culturas laboratoriais de gryllus bimaculatus, um modelo ortopéde versátil para agricultura de insetos e fisiologia de invertebrados

Maintaining Laboratory Cultures of Gryllus bimaculatus, a Versatile Orthopteran Model for Insect Agriculture and Invertebrate Physiology

Gryllus bimaculatus (De Geer) é um grilo de grande porte distribuído por toda a África e eurásia do sul, onde é frequentemente colhido como alimento humano. Fora de sua faixa nativa, cultivar G. bimaculatus é viável devido à sua plasticidade dietética, ciclo reprodutivo rápido, falta de necessidade de diapausa, tolerância para criação de alta densidade e robustez contra patógenos. Assim, G. bimaculatus pode ser um modelo versátil para estudos de fisiologia de insetos, comportamento, embriologia ou genética.
Parâmetros culturais, como densidade de estocagem, refugia dentro da gaiola, fotoperíodo, temperatura, umidade relativa e dieta, todos impactam o crescimento, o comportamento e a expressão genética do críquete e devem ser padronizados. Na crescente literatura sobre insetos agrícolas para consumo humano, esses grilos são frequentemente empregados para avaliar as misturas de ração de candidatos derivadas de resíduos de culturas, subprodutos de processamento de alimentos e outros fluxos de resíduos de baixo custo.
Para apoiar experimentos em andamento avaliando o desempenho de crescimento do G. bimaculatus e a qualidade nutricional em resposta aos substratos de ração variável, foi desenvolvido um conjunto abrangente de protocolos padrão para reprodução, manutenção, manuseio, medição e eutanásia em laboratório. Uma ração de críquete padrão da indústria provou ser nutricionalmente adequada e funcionalmente apropriada para a manutenção a longo prazo de estoques de reprodução de críquete, bem como para uso como uma ração de controle experimental. Criando esses grilos a uma densidade de 0,005 grilos/cm3 em gaiolas de polietileno de 29,3 L com cobertura de tela a uma temperatura média de 27 °C em um fotoperiodo de 12 luz (L)/12 escuro (D), com coir de coco umedecido servindo tanto como fonte de hidratação quanto meio de oviposição tem sustentado com sucesso grilos saudáveis ao longo de um período de 2 anos. Seguindo esses métodos, os grilos em um experimento controlado produziram uma massa média de 0,724 g 0,190 g na colheita, com 89% de sobrevivência e 68,2% de maturação sexual entre meia (22 dias) e colheita (65 dias).

Dados que demonstram a criação bem-sucedida do críquete desde a eclosão até os 65 dias de idade foram coletados durante um teste de alimentação em setembro de 2021. Os grilos foram cultivados a partir de ovos seguindo as etapas 1.1.1-2.6.1 desses protocolos, e seis gaiolas de réplica foram abastecidas com 24 grilos aleatórios de 22 dias de idade (terceira instar) seguindo o passo 2.7 acima. Grilos foram então criados em condições de sala ambiente; no entanto, devido a uma unidade de manuseio do ar defeituosa, a temperatu...

Este artigo descreve métodos básicos para padronizar fatores importantes como densidade, disponibilidade de ração, fonte de hidratação e controles ambientais para a criação a longo prazo de culturas laboratoriais do grilo comestível, Gryllus bimaculatus.

Mantendo culturas laboratoriais de Gryllus bimaculatus, um modelo ortopéde versátil para agricultura de insetos e fisiologia de invertebrados

Gryllus bimaculatus (De Geer)&#160;is a large-bodied cricket distributed throughout Africa and Southern Eurasia where it is often wild-harvested as human ...

Essas técnicas retratam métodos práticos e comprovados para a criação de Gryllus bimaculatus, uma mini espécie de pecuária-chave cultivada para ração animal e alimentos humanos e organismo modelo alternativo cada vez mais importante. Estes métodos laboratoriais para a cultura de Gryllus bimaculatus são derivados de técnicas comuns em toda a indústria agrícola de críquete norte-americana e representam um fac-símile em escala laboratorial de operações agrícolas de críquete. Para começar, rechee um recipiente limpo em um equilíbrio, e pese uma massa de coir de coco seco aproximadamente do tamanho de um punho humano.Em seguida, coloque coir em um recipiente vedado e limpo, que pode acomodar a expansão até seis vezes o volume original. Com as mãos limpas, separe suavemente pedaços de coir da peça removida do bloco maior. Em seguida, usando um cilindro graduado de 250 mililitros, meça o volume correto de água deionizada para alcançar uma proporção de cinco para um por massa de cinco partes de água para uma parte de coir seco, e adicione a água deionizada medida lentamente, hidratando uniformemente todas as partículas de coir.Depois, macerate manualmente aglomerados para garantir a hidratação uniforme, e re-tare o recipiente em que o coir foi anteriormente pesado. Pese 75 gramas de coir molhado, e transfira-o para uma placa de Petri de 100 milímetros por 15 milímetros usando uma colher de plástico limpa para garantir que o coir esteja uniformemente espalhado ao redor do fundo da placa e que não haja aglomerados. Em seguida, rotule o lado da placa de Petri com fita de laboratório com uma colônia de natal rotulada e data do evento de coleta de ovos.Meça mais 45 mililitros de água deionizada em um cilindro graduado, e adicione água uniformemente sobre a superfície do coir embalado na placa de Petri para garantir a hidratação uniforme. Uma vez que a placa de Petri tenha sido embalada, sele o coir molhado restante em um vaso hermético para armazenamento a menos 20 graus Celsius. Coloque o substrato de oviposição hidratada em gaiolas contendo os estoques parentais desejados de grilos o mais longe possível da alimentação, e documente a data e a hora.Em seguida, coloque um recipiente de lixo pequeno e autoclavável na superfície de trabalho. Em seguida, coloque uma gaiola de plástico limpa, vazia e 29,3 litros no banco ao lado do recipiente de lixo. Coloque outra gaiola de 29,3 litros contendo os estoques de críquete dos pais e substrato de oviposition no lado oposto do recipiente de lixo da gaiola vazia.Após 24 horas, remova o substrato de oviposition da gaiola de críquete dos pais, e localize-o sobre o vaso de resíduos autoclavável. Inspecione o topo do substrato de oviposição para qualquer partícula de frass ou ração que os grilos possam ter chutado para a superfície do coir. Em seguida, remova os contaminantes de coir no vaso de resíduos com uma Scoopula limpa ou colher de plástico, e coloque a colher de plástico no recipiente de resíduos.Em seguida, coloque o substrato de oviposição limpo na gaiola limpa de 29,3 litros. Depois, coloque a gaiola em uma incubadora fixada a 27 graus Celsius a 60% de umidade relativa em um fotopertouto de luz escuro de 12 horas. Devolva a gaiola contendo o estoque de reprodução para o local original e limpe todos os itens da superfície de trabalho.Em seguida, coloque o recipiente de resíduos em um freezer in-facility dedicado ao armazenamento de itens potencialmente contaminados com ovos de críquete. Em seguida, higienize a superfície de trabalho com solução de alvejante de 10%, e deixe-a sentar por 60 segundos. Limpe a superfície de trabalho seca com uma toalha de papel limpa.Depois de abrir o congelador, descarte a toalha de papel no recipiente de resíduos. Selecione dois apartamentos de caixa de ovos comerciais não usados de 30,8 centímetros por 30,8 centímetros. E com uma faca de utilidade ou tesouras fortes, corte-as em seis tiras separadas de 10,1 centímetros de largura de tamanho igual.Em seguida, escove as bordas cortadas com as mãos para remover partículas pendentes de papelão. Em seguida, coloque os seis pedaços individuais de 10,1 centímetros por 30,8 centímetros de caixa verticalmente na parte inferior da gaiola, com o eixo mais longo da caixa abrangendo o eixo horizontal mais estreito de uma gaiola de 29,3 litros. Coloque um sétimo pedaço de caixa plana no topo das seis peças eretas.Depois de selecionar três pedaços de papel toalha áspera e marrom de aproximadamente 25 centímetros por 25 centímetros, dobre cada um ao meio. Em seguida, coloque dois de tal forma que eles cobrem a parte superior do lado proximal da estrutura da caixa, e coloque um sobre a pilha de caixa no lado distal. No 11º dia, mova o substrato de oviposition para o canto direito proximal da gaiola.Quando uma escotilha é observada, misture as toalhas de papel colocadas sobre o topo das caixas, até que sejam molhadas, mas não derramando ativamente água. Em seguida, limpe completamente ambos os lados de uma tampa petri de 100 milímetros com 70% de etanol, e deixe-o secar. Em seguida, colher 50 gramas da ração em um liquidificador de 60 watts, de uma única porção, e moinho a 10.000 rpm por um minuto.Depois de medir um grama da ração, agite-o na tampa da placa de Petri na gaiola. Usando a extremidade limpa de uma colher ou Scoopula, espalhe o ração o mais uniformemente possível sobre a parte inferior do prato. Depois, substitua a alimentação a cada dois dias.Descarte a ração antiga no recipiente de resíduos autoclaváveis. Monitor para o crescimento do molde na alimentação. E se a ração começar a parecer branca ou esverdeado, descarte a placa de Petri e se alimente imediatamente.Aos 14 dias após a oviposição, use um pincel de 2,54 centímetros para remover grilos agarrados ao substrato de coir natal, escovando todos os grilos da superfície coir e laterais da placa de Petri na gaiola. Em seguida, coloque o substrato de oviposição removido no recipiente de resíduos autoclaváveis e armazene-o no congelador até que se autoclave. Em seguida, substitua o substrato natal por um prato de coir fresco para hidratação.Usando uma garrafa de lavagem de água deionizada, adicione água até que a superfície do coir brilhe, mas não esteja agrupando. Grilos foram estocados de uma população com massa média de 21 miligramas. No final do experimento, a massa média de todos os grilos juvenis e adultos combinados foi de 0,724 gramas.Aos 65 dias de idade, quando o experimento terminou, 30 homens adultos estavam presentes, e a massa média foi de 0,721 gramas, enquanto para as 58 fêmeas adultas, a massa média foi de 0,841 gramas. A sobrevivência entre meia e colheita foi de 89% e foi medida semanalmente por contagem total de todos os grilos individuais em todas as gaiolas. No dia 65, aproximadamente 68% de todos os grilos tinham alcançado a estrela adulta.Evite a formação de gotículas de água no fundo do gabinete ao regar ou neblina. Colocar papel toalha sobre a refugia permite um gradiente de umidade e absorve gotículas de água da neblina. Este procedimento serve como um modelo para pesquisadores em muitos campos de ciências da vida para criar Gryllus bimaculatus como um organismo modelo.Até o momento, foram publicados poucos protocolos formais para a criação de Gryllus bimaculatus ou qualquer outro organismo modelo paurometabolous. Codificar e padronizar métodos de criação de insetos usados na agricultura de insetos permitirá melhor a comparação dos resultados entre grupos de pesquisa.

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O objetivo geral desses procedimentos é para estabelecer, manter e atualizar uma população em cativeiro de Eristalis tenax em um ambiente de pesquisa.

Criação e manutenção de longo prazo de Eristalis tenax Hoverflies para estudos de investigação

O pulgão Aphis nerii coloniza altamente defendido das plantas pertencente à família (Apocyanaceae) e oferece inúmeras oportunidades para estudar interações inseto-planta. Aqui, apresentamos uma série de protocolos para a manutenção da planta e pulgão, culturas e a geração e análise molecular e - omic dados pela . nerii.

Manutenção de culturas biológicas e medição de expressão gênica em Aphis nerii: um sistema Non-modelo de interações inseto-planta

Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para um modelo de administração oral usando Galleria mellonella larvas e como caracterizar induzido inatas respostas imunes. Usando este protocolo, será capazes de usar a alimentação forçada método mellonella g. pesquisadores sem experiência prática.

Um modelo de administração Oral Galleria mellonella para respostas imunes Study Commensal-Induced inata

Aqui nós apresentamos um protocolo para injetar ovos do grilo, uma técnica que sirva como um método fundamental em muitas experiências no grilo, incluindo, mas não limitado a, a interferência do RNA e a manipulação genomic.

Injetando ovos de Gryllus bimaculatus

Este protocolo é usado no estabelecimento e manutenção de baratas americanas gnotobióticas(Periplaneta americana)por superfície esterilizando as caixas de ovos (oothecae) antes da eclosão. Estes insetos gnotobióticos contêm seus endosímbiontos blattabacterium transmitidos verticalmente, mas têm tripas axenicas.

Estabelecimento e Manutenção de Baratas Gnotobióticas Americanas (Periplaneta americana)

Para obter um inseto axenic, sua superfície de ovo é esterilizada, e a larva eclodida é posteriormente criada usando folhas axenic. Este método fornece uma maneira eficiente de preparação de insetos machados sem administrar antibióticos ou desenvolver uma dieta artificial, que também pode ser aplicada a outros insetos comedores de folhas.

Preparando e criando insetos axeônicos com mudas cultivadas de tecido para estudos de interação microbiota hospedeiro-intestinal do besouro-folha

Este artigo descreve a manutenção laboratorial (incluindo acasalamento e alimentação) da mosca díptera inferior Bradysia (Sciara) coprophila.

Manutenção laboratorial da Bradisia (Sciara) coprophila da mosca dos dípteros inferiores: um novo / antigo organismo modelo emergente

Aprenda métodos padronizados de criação laboratorial de Gryllus bimaculatus para pesquisa em agricultura de insetos e fisiologia de invertebrados. Este protocolo garante resultados consistentes em estudos de organismos modelo.

Mantendo culturas laboratoriais de Gryllus bimaculatus, um modelo ortopéde versátil para agricultura de insetos e fisiologia de invertebrados (Vídeo) | JoVE Journal

Mantendo culturas laboratoriais de Gryllus bimaculatus, um modelo ortopéde versátil para agricultura de insetos e fisiologia de invertebrados

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