Name: Imagem tridimensional de alta resolução da Vasculatura do Footpad em um Modelo de Gangrena Hindlimb Murine (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprenda a criar um modelo de gangrena do membro posterior em camundongos FVB usando eletrocoagulação femoral e inibidor de óxido nítrico. Este método permite imagem 3D de alta resolução da vasculatura do footpad para estudo de isquemia crítica.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios ao Z-J L e OC V dos Institutos Nacionais de Saúde [R01HL149452 e VITA (NHLBL-CSB-HV-2017-01-JS)]. Agradecemos também ao Centro de Microscopia e Imagem do Projeto Miami para Curar Paralisia na Faculdade de Medicina da Universidade de Miami por fornecer acesso ao software de análise e processamento de imagens.

Todos os experimentos em animais descritos no protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Miami (IACUC). Foram utilizados no estudo camundongos FVB, tanto do sexo masculino quanto do feminino, com idade entre 8 e 12 semanas.
1. Preparação da solução L-NAME
<ol><li>Em condições estéreis em uma capa de fluxo laminar, prepare uma solução de estoque L-NAME dissolvendo 1g de pó L-NAME (ver Tabela de Materiais) com 20 mL de água estéril para fazer uma solução de 50 mg/mL. Armazene a solução de estoque em alíquotas de 300-500 μL a -20 °C por até 3 meses.</li>
	<li>Para fazer uma solução L-NAME em funcionamento, descongele uma alíquota da solução de estoque L-NAME e dilua-se com PBS (1:4) em condições estéreis para obter uma concentração final de 10 mg/mL.</li>
	<li>Para preparar PBS (pH 7.4), dissolva 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 e 0,23 g de NaH2PO4 em 800 mL de água destilada. Ajuste o pH para 7,4 com HCl. Adicione água a um volume total de 1.000 mL e filtre através de um filtro superior de garrafa de 0,22 μm. NOTA: A injeção intraperitoneal (IP) de 4 μL/g de solução de trabalho L-NAME equivale à dose desejada de 40 mg/kg de L-NAME. A solução de trabalho L-NAME deve ser mantida no gelo durante o uso, e novas diluições devem ser feitas diariamente usando alíquotas recém-descongeladas de solução de estoque.</li>
</ol>2. Indução química e cirúrgica de gangrena de subida traseira
<ol><li>Obtenha camundongos FVB, com idade entre 8 e 12 semanas, seja de um criador ou criados in-facility (ver Tabela de Materiais). 2 h antes da cirurgia, administre uma dose IP de 40 mg/kg de L-NAME.</li>
	<li>Camundongos anestesiados com injeção IP de 100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina (ver Tabela de Materiais) diluídos em PBS. Confirme a sedação adequada pela ausência de reflexo do dedo do dedo do dedo e continue monitorando a taxa respiratória durante o procedimento.<ol>
<li>Remova o cabelo de berços bilaterais e virilhas usando tesouras e/ou um creme depilatório. Posicione o animal sob uma supina de microscópio cirúrgico; estender e gravar as extremidades no lugar. Esterilize o campo cirúrgico aplicando circunferencialmente a solução povidone-iodo ao local cirúrgico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sob ampliação de 10-20x, use uma tesoura ou um bisturi para fazer uma incisão de 1 cm ao longo da linha da virilha apenas inferior ao ligamento inguinal. Use fórceps finos e um aplicador de ponta de algodão estéril para dissecar sem rodeios a almofada de gordura inguinal lateralmente do ligamento inguinal e expor a bainha femoral subjacente para que a artéria femoral, veia e nervo sejam claramente identificados (Figura 1).</li>
	<li>Usando fórceps finos, fure a bainha femoral. Escove cuidadosamente o nervo femoral da artéria femoral. Identifique a decolagem do ramo circunflexo lateral da artéria femoral (LCFA) profundamente ao nervo femoral (Figura 1).<ol>
<li>Prossiga com a eletrocoagulação da artéria femoral e da veia apenas proximal à LCFA ativando o dispositivo cautery (ver Tabela de Materiais) e entrando em contato suavemente com os vasos com um movimento lateral-a-lado, garantindo que o nervo femoral esteja bem isolado e permaneça protegido contra lesões térmicas. Divida o segmento de vaso coagulado com uma tesoura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prossiga com a exposição da artéria femoral distal e da veia, mobilizando a almofada de gordura inguinal mediadamente. Identifique a artéria epigástrica superficial e a junção saphenopopliteal de forma mais distral.<ol>
<li>Furar a baia femoral entre esses dois locais e dissecar cuidadosamente o nervo femoral longe dos vasos femorais. Proceder com coagulação e transeção da artéria femoral e veia conforme descrito na etapa 2.4.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Irrigar o campo cirúrgico usando uma seringa cheia de PBS estérei. Obtenha hemostasia aplicando pressão suave com um aplicador de ponta de algodão por 3-5 min para quaisquer áreas de sangramento.<ol>
<li>Proceda com o fechamento da incisão usando sutura 5-0 absorvível de forma simples e contínua. Administre uma dose subcutânea de 1 mg/kg de buprenorfina de liberação sustentada (ver Tabela de Materiais) para alívio da dor pós-operatório.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confirme a perda da perfusão do footpad no bloco traseiro ligado pelo LDPI (ver Tabela de Materiais). Enquanto ainda anestesiado, coloque o animal em uma almofada de espuma escura em uma posição propensa sob a máquina LDPI e use laços de fita elétrica para fixar os pés no lugar.<ol>
<li>Prossiga com LDPI de pés bilaterais. Uma vez que a varredura esteja completa, desenhe um ROI em torno de cada footpad e obtenha os valores médios de fluxo.</li>
		<li>Calcule o índice de perfusão como a razão dos valores médios de fluxo do footpad ligado para o não ligado. Certifique-se de que o índice de perfusão seja inferior a 0,1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfira o animal de volta para uma gaiola limpa com uma almofada de aquecimento ou lâmpada aérea para manter a temperatura corporal do núcleo. Certifique-se de recuperação completa da anestesia antes de transferir os ratos de volta para a instalação animal.</li>
</ol>3. Administração pós-operatória de L-NAME e monitoramento de gangrena hindlimb
<ol><li>Nos dias pós-operatórios 1-3, administre uma dose IP adicional de 40 mg/kg de L-NAME para cada animal. Ao mesmo tempo, avalie cuidadosamente o pé do membro isquêmico.</li>
	<li>Quantifique o grau de isquemia de subida e gangrena usando o resultado de isquemia de subida de Faber9. Pontuações 1-5: número de pregos isquêmicos; pontuações 6-10: 1-5 dígitos isquêmicos; pontuações 11 e 12: atrofia parcial e completa do pé. Recorde faber pontuações nos dias pós-operatórios 1-3 e, em seguida, semanalmente.</li>
</ol>4. Preparação de DI E soluções de trabalho para perfusão animal
<ol><li>Para preparar a solução de estoque dii, dissolva 100 mg de cristais DiI (ver Tabela de Materiais) em 16,7 mL de 100% etanol. Cubra em papel alumínio e deixe em uma plataforma de balanço durante a noite no escuro à temperatura ambiente.</li>
	<li>Para preparar o diluente, dissolva 50 g de glicose em 1.000 mL de água destilada para produzir uma solução de glicose de 5%. Filtre através de um filtro superior de garrafa de 0,22 μm. Misture PBS e 5% de soluções de glicose em uma proporção de 1:4 para preparar uma solução diluída em funcionamento.</li>
</ol>5. Configuração do equipamento e perfusão diI
<ol><li>Faça a solução de trabalho DiI adicionando 200 μL de solução de estoque DiI a 10 mL da solução diluente de trabalho (preparada na etapa 4.2) imediatamente antes do uso. Aperte à mão para misturar bem.</li>
	<li>Conecte duas ou três torneiras de 3 vias e uma agulha borboleta de 25 G em série. Prepare 10 mL de seringas com 4 mL de PBS, 10 mL de solução DiI e 10 mL de formalina tamponada 10% neutra (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Conecte a seringa com formalina à porta de entrada proximal e injete a solução para liberar o ar da linha; virar a torneira para fechar o porto. Repita o mesmo procedimento sequencialmente, conectando as seringas com DiI e, em seguida, PBS aos portos de entrada média e distal, respectivamente, tomando o cuidado de lavar todas as bolhas de ar através do conjunto de torneiras. NOTA: Certifique-se de que não há bolhas de ar em qualquer parte do conjunto de torneiras ou tubos. Bolhas de ar podem ocluir pequenas artérias durante a perfusão, resultando em má distribuição intravascular do DII e resultados de imagem comprometidos.</li>
	<li>Uma vez que a configuração esteja completa, eutanize o animal por overdose de CO2 em uma câmara de indução.</li>
	<li>Coloque o animal a ser perfumado em uma posição supina em uma almofada absorvente e fixar axilas e extremidades inferiores com agulhas.</li>
	<li>Usando uma tesoura, faça uma incisão transversal para abrir a cavidade abdominal. Exponha e divida o diafragma esquerdo e direito para acessar a cavidade torácica.<ol>
<li>Corte a parede torácica em ambos os lados do esterno das costelas inferiores para a primeira ou segunda costelas, evitando as artérias torácicas internas (mamárias) mediadamente. Use um hemosta (ver Tabela de Materiais) para agarrar a extremidade inferior do esterno e refleti-la em direção à cabeça do animal para expor a cavidade torácica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifique o ventrículo esquerdo, que aparece em cores mais claras que o ventrículo direito. Segure suavemente o coração com fórceps sem cortes e insira a agulha borboleta no ventrículo esquerdo.<ol>
<li>Use uma tesoura ou uma agulha de 18 G para perfurar o átrio direito, permitindo que soluções de sangue e perfusão retornem ao coração para drenar. Estabilize a agulha com uma ou duas mãos, tomando cuidado para não perfurar inadvertidamente o ventrículo direito e perfure o pulmão em vez de circulação sistêmica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Abra a porta para a seringa com PBS e injete manualmente 2-4 mL a uma taxa de 1-2 mL/min por 1-2 min para retirar o sangue do sistema vascular. Garanta a perfusão bem sucedida observando o sangramento do átrio direito. Após a injeção, feche a porta da seringa PBS.</li>
	<li>Abra a porta para a seringa com DiI e injete 5-10 mL a uma taxa de 1-2 mL/min por 5 min. Monitore as orelhas, nariz e palmas que devem ficar ligeiramente rosados com a injeção de solução DiI. Após a injeção, feche a porta da seringa DiI e espere por 2 minutos para permitir a incorporação do corante antes da injeção de fixação.</li>
	<li>Abra a porta para a seringa com formalina e injete 5-10 mL a uma taxa de 1-2 mL/min por 5 min. Após a injeção, remova a agulha do ventrículo esquerdo e proceda à colheita dos tecidos de interesse.</li>
	<li>Usando uma tesoura pesada, desloque a tíbia no tornozelo, separando completamente os pés esquerdo e direito das pernas inferiores. Coloque os pés colhidos em uma placa de 6 ou 12 poços com 1-2 mL de solução de 10% formalina. Enrole a placa com papel alumínio e guarde a 4 °C durante a noite.</li>
</ol>6. Preparação de tecido de footpad para microscopia de varredura a laser confocal
<ol><li>No dia seguinte, substitua a solução fixativa em placa de 6 ou 12 poços por 1-2 mL de PBS por poço.</li>
	<li>Para esfolar o pé, primeiro, faça uma incisão longitudinal com um bisturi nos aspectos plantar e dorsal do pé. Em seguida, usando fórceps dentudos e um pequeno hemostato, remova cuidadosamente toda a pele do pé e dos dígitos, não danificando os tecidos moles subjacentes.</li>
	<li>Proceda à montagem e imagem dos tecidos, preferencialmente dentro de 1-2 dias de perfusão e colheita. Alternativamente, retorne os footpads para placas de 6 ou 12 poços com 1-2 mL de PBS; cobrir com papel alumínio e armazenar a 4 °C para manter a fluorescência por até 1 mês.</li>
	<li>Para montar tecidos, coloque individualmente os pés entre dois slides de microscópio de vidro com uma almofada de biópsia de espuma dobrada sobre si mesma (uma ou duas vezes dependendo da espessura do tecido) em cada extremidade (ver Tabela de Materiais). Use dois pequenos clipes de aglutinante para comprimir os slides de vidro juntos em cada extremidade (espessura final aproximadamente 1 mm). NOTA: Tecidos mais grossos exigirão tempos de varredura mais longos. O footpad esfolado pode ser comprimido entre lâminas de vidro um dia antes da imagem para reduzir a espessura do tecido.</li>
</ol>7. Microscopia de varredura a laser confocal
<ol><li>Prepare-se para a sessão de imagem: ligue o sistema de imagem e inicie o software de aquisição (ver Tabela de Materiais). Use um objetivo de baixa ampliação/baixa abertura numérica (por exemplo, x5/0,15) para capturar imagens, pois as lentes de ampliação mais baixas normalmente têm distâncias de trabalho mais longas necessárias para este experimento.</li>
	<li>Clique em Sim para a caixa de diálogo Ativar estágio. Ative o laser de 561 nm na guia Configuração. Na tela principal, ative um caminho visível do feixe clicando no botão Visível . Defina um detector para a faixa de 570-600 nm clicando na caixa de seleção ativa correspondente.</li>
	<li>Selecione o ícone de varredura de ladrilhos na guia Adquirir > Aquisição e defina a resolução desejada (512 x 512 ou 1024 x 1024).</li>
	<li>Posicione a amostra de tecido montado a seco (sem água ou pbs adicionado) compactada entre lâminas de vidro no estágio do microscópio e coloque o tecido em foco.</li>
	<li>Para definir os limites de digitalização, navegue até o canto superior esquerdo ou direito da amostra. Na guia Aquisição, no menu 'Digitalizar' clique no botão Marcar posição . Navegue até o canto oposto (inferior direito ou esquerdo, respectivamente) e clique no botão Marcar posição mais uma vez.</li>
	<li>Para definir a profundidade da pilha Z, clique no botão Viver no canto inferior esquerdo da tela e navegue até o centro da amostra. Use o botão do eixo z para rolar até a parte inferior da amostra.</li>
	<li>Na guia Aquisição, no menu Z-Stack, clique no botão Iniciar . Role até o topo da amostra e clique no botão Finalizar . Clique em Tamanho de passo Z e defina para o valor desejado (por exemplo, 50 μm).</li>
	<li>No canto inferior direito da tela, clique em Iniciar para iniciar a aquisição de imagens.</li>
</ol>8. Análise quantitativa e reconstrução 3D da vascularização do footpad
<ol><li>Baixe e instale a versão mais recente de Fiji (ImageJ) bem como o plugin Vessel Analysis20. Abra arquivos de imagem de microscopia em Fiji, que combinarão sérieS-Z individuais em pilhas Z que podem ser visualizadas no eixo z usando o controle deslizante na parte inferior da imagem.</li>
	<li>Selecione a imagem composta de pilha Z e, em seguida, sob o menu Imagem, escolha Stacks > Z Project para criar uma projeção bidimensional. Em seguida, converta a projeção Z em binário em processo > binário > Make Binary.</li>
	<li>Execute o plugin de densidade vascular sob plugins > densidade vascular. Quando solicitado, use o cursor para rastrear um ROI ao redor do perímetro do footpad e dígitos. Tome nota da densidade do vaso que é relatada, que é expressa em percentagem do ROI (fração da área vascular).</li>
	<li>Para criar reconstruções 3D em Fiji, selecione Stacks > Projeto 3D e defina o eixo de rotação, ângulo e velocidade desejados sob a imagem do menu. Alternativamente, selecione O Visualizador de Volumes no menu Plugins para visualizar imagens como fatias ou manipular a reconstrução nos eixos desejados.</li>
	<li>Para obter mais serviços 3D envolvidos, use software alternativo de análise de imagens e processamento (ver Tabela de Materiais). Converta arquivos para o formato do software desejado e costure as varreduras individuais de ladrilhos usando a funcionalidade de costura de ladrilhos.</li>
	<li>Depois de costurar as varreduras individuais de ladrilhos, abra o arquivo composto e prossiga com a renderização da superfície de volume. Clique em Adicionar nova superfície para abrir o Assistente de Criação de Superfície e use as setas para alternar através de menus, notadamente definindo o ROI e a intensidade do limiar. Uma vez satisfeito com a renderização da superfície, utilize a funcionalidade de animação para criar vídeos da imagem processada.</li>
</ol>

<ol><li>Virani, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics-2020+update%3A+A+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association.</a> Circulation. 141 (9), 139(2020).</li>
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Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Embora a isquemia de cetameira do rato seja o modelo pré-clínico mais utilizado para estudar a neovascularização em PAD e CLTI, há uma variação significativa na gravidade e recuperação da isquemia, dependendo da cepa específica do rato utilizada e do local, número e método de ruptura arterial. A combinação de ligadura da artéria femoral e administração IP de L-NAME pode induzir de forma confiável gangrena hindlimb em camundongos FVB11. O mesmo tratamento resulta em isquemia hindlimb sem perda de t...

A doença arterial periférica (PAD), caracterizada pela redução do fluxo sanguíneo para as extremidades devido à aterosclerose, afeta 6,5 milhões de pessoas nos Estados Unidos e 200 milhões de pessoas em todo o mundo1. Pacientes com PAD experimentam função reduzida dos membros e qualidade de vida, e aqueles com CLTI, a forma mais grave de PAD, estão em risco aumentado de amputação e morte com uma taxa de mortalidade de 5 anos próxima de 50%2. Na prática clínica, são considerados pacientes com índices de tornozelo-braquial (ABI) <0,9, sendo aqueles com ABI <0,4 associados à dor de repouso ou perda de tecido como tendo CLTI3. Os sintomas variam entre pacientes com IIS semelhantes dependendo da atividade diária, tolerância muscular à isquemia, variações anatômicas e diferenças no desenvolvimento colateral4. A gangrena de dígitos e membros é a manifestação mais grave de todas as doenças oclusivas vasculares que resultam em CLTI. É uma forma de necrose seca que mumifica os tecidos moles. Além do PAD aterosclerótico, também pode ser observado em pacientes com diabetes, vasculitídeos como a doença de Buerger e o fenômeno de Raynaud, ou calcifilaxia no cenário da doença renal em estágio terminal5,6.
Vários modelos pré-clínicos foram desenvolvidos para estudar a patogênese do PAD/CLTI e testar a eficácia de tratamentos potenciais, sendo o mais comum a isquemia de pêblico posterior do camundongo. Induzir isquemia de retrocessão em camundongos é tipicamente realizada pela obstrução do fluxo sanguíneo das artérias ilíacas ou femorais, seja por ligadura de sutura, eletrocoagulação ou outros meios de constrição do vaso desejado7. Essas técnicas reduzem drasticamente a perfusão ao retrocesso e estimulam a neovascularização nos músculos da coxa e da panturrilha. No entanto, existem diferenças essenciais de sensibilidade à sensibilidade isquêmica ao insulto isquêmico parcialmente devido a diferenças anatômicas na distribuição colateral8,9. Por exemplo, os camundongos C57BL/6 são relativamente resistentes à isquemia hindlimb, demonstrando função reduzida do membro, mas geralmente não há evidência de gangrena no footpad. Por outro lado, os camundongos BALB/c têm uma capacidade inerentemente ruim de se recuperar da isquemia e normalmente desenvolvem auto-amputação do pé ou perna inferior após a ligadura da artéria femoral sozinho. Esta resposta severa à isquemia estreita a janela terapêutica e pode impedir a avaliação longitudinal da reperfusão e função dos membros. Curiosamente, as diferenças genéticas em um único locus de traço quantitativo localizado no cromossomo murine 7 foram implicadas nessas suscetibilidades diferenciais de camundongos C57BL/6 e BALB/c à necrose tecidual e reperfusão de membros10.
Em comparação com as cepas C57BL/6 e BALB/c, os camundongos FVB demonstram uma resposta intermediária, mas inconsistente, apenas à ligadura da artéria femoral. Alguns animais desenvolvem gangrena de footpad na forma de unhas isquêmicas pretas ou dígitos mumificados, mas outros sem qualquer sinal de isquemia11. Administração concomitante de Cloridrato de Éster de Élíste de Metila Nω-Nitro-L-arginina (L-NAME), um inibidor de sintetizador de óxido nítrico (NOS)12, previne mecanismos vasodilatários compensatórios e aumenta ainda mais o estresse oxidativo no tecido hindlimb. Em combinação com ligação ou coagulação da artéria femoral, esta abordagem produz consistentemente perda de tecido de footpad em camundongos FVB que se assemelha às alterações atroficas de CLTI, mas raramente progride para auto-amputação de membros11. O estresse oxidativo é uma das marcas do PAD/CLTI e é propagado por disfunção endotelial e biodisponibilidade diminuída de óxido nítrico (NO)13,14. NO é uma molécula pluripotente que geralmente exerce efeitos benéficos sobre o fluxo sanguíneo arterial e capilar, a adesão e agregação de plaquetas, e recrutamento e ativação de leucócitos13. Níveis reduzidos de NOS também têm sido mostrados para ativar a enzima conversora de angiotensina, que induz o estresse oxidativo e acelera a progressão da aterosclerose15.
Uma vez estabelecido um modelo de isquemia de escalada posterior, também são necessários monitorar a reperfusão subsequente do membro e o efeito terapêutico de quaisquer tratamentos potenciais. No modelo de gangrena murina proposto, o grau de perda de tecido pode ser quantificado primeiro usando a pontuação de Faber para avaliar o aparecimento bruto do pé (0: normal, 1-5: perda de pregos onde a pontuação representa o número de pregos afetados, 6-10: atrofia de dígitos onde a pontuação representa o número de dígitos afetados, 11-12: atrofia parcial e completa do pé, respectivamente)9. As medições quantitativas da perfusão de limbo hind são então tipicamente feitas usando LDPI, que se baseia em interações do Doppler entre luz laser e glóbulos vermelhos para indicar perfusão em nível de pixel em uma região de interesse (ROI)16. Embora esta técnica seja quantitativa, não invasiva e ideal para medições repetidas, ela não fornece detalhes anatômicos granulares da vasculatura hindlimb16. Outras modalidades de imagem, como tomografia microcomputante (micro-TC), angiografia de ressonância magnética (MRA) e microangiografia de raios-X, se mostram dispendidas, exigindo instrumentação sofisticada ou tecnicamente desafiadora16. Em 2008, Li et al. descreveram uma técnica para rotular vasos sanguíneos dentro da retina com o corante lipofílico de carbocianina DiI17. O DII incorpora em células endoteliais e, por difusão direta, mancha estruturas de membrana vascular, como brotos angiogênicos e processos pseudopodais17,18. Devido à sua entrega direta em células endoteliais e à natureza altamente fluorescente do corante, este procedimento fornece rotulagem intensa e duradoura dos vasos sanguíneos. Em 2012, Boden et al. adaptaram a técnica de perfusão dii ao modelo de isquemia de hindlimb murina através de imagens de montagem integral dos músculos adutores da coxa colhidas após a ligadura da artéria femoral19.
O método atual fornece uma maneira relativamente barata e tecnicamente viável para avaliar a neovascularização em resposta à isquemia de liminar e terapêuticas baseadas em genes ou células. Em outra adaptação, este protocolo descreve a aplicação da perfusão diI à imagem da vasculatura do bloco de pés em alta resolução e 3D em um modelo murino de gangrena hindlimb.

<table><tbody><tr><td>Clipes de fichário (pequenos)</td>Loja <td></td><td></td>de <td>material de escritório</td></tr><tr><td>Buprenorfina (libertação sustentada)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agulha borboleta (25 G com Luer-Lok)</td><td>VWR</td><td>10148-584</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varrimento a laser</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>DiI (1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-perclorato de tetrametilindocarbocianina)</td><td>Invitrogen</td><td>D282</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de eletrocautério</td><td>Gemini Cautery System</td><td>5917</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (100%)</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td></td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ) software</td><td>NIH</td><td></td><td>Versão usada 2.1.0. Download gratuito, sem necessidade de licença.</td></tr><tr><td>Almofadas de biópsia de espuma</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-221</td><td></td></tr><tr><td>Formalina (tamponada neutra, 10%)</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos FVB</td><td>Jackson Laboratory</td><td>001800</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HCl (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13-1700</td><td></td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Usado versão 9.6.0.</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Pivetal</td><td>NDC 46066-755-04</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-NAME (cloridrato de éster metílico de N&omega;-Nitro-L-arginina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5751</td><td></td></tr><tr><td>Gerador de imagens de perfusão Laser Doppler</td><td>MoorLDI</td><td>moorLDI2-HIR</td><td>Software moorLDI V5 usado.</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio (25 x 75 x 1 mm)</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8263</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas (27 G)</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Cotonete de iodopovidona (10%)</td><td>Medline</td><td>MDS093901ZZ</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos cirúrgicos</td><td>Roboz Surgical</td><td></td><td>Recomenda-se pinça fina, chave de agulha, tesoura de mola e hemostático.</td></tr><tr><td>Sutura (5-0 absorvível)</td><td>Seringas G275017B0P</td><td></td><td></td>DemeTECH</tr><tr><td>(10 mL)</td><td>BD</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>Torneiras de três vias</td><td>Cole-Parmer</td><td>19406-49</td><td></td></tr><tr><td>Plugin</td><td></td><td></td> de análise vascular <td>Download grátis, sem necessidade de licença. Ver referência: Elfarnawany (2015).</td></tr><tr><td>xilazina</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagem tridimensional de alta resolução da vasculatura do footpad em um modelo de gangrena hindlimb murine

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

A doença arterial periférica (PAD) é uma causa significativa de morbidade resultante da exposição crônica a fatores de risco ateroscleróticos. Pacientes que sofrem de sua forma mais grave, isquemia crônica ameaçadora de membros (CLTI), enfrentam prejuízos substanciais para a vida diária, incluindo dor crônica, distância de caminhada limitada sem dor e feridas não ogêsicas. Modelos pré-clínicos foram desenvolvidos em vários animais para estudar PAD, mas a isquemia de pândico do rato continua sendo a mais utilizada. Pode haver variação significativa na resposta ao insulto isquêmico nesses modelos, dependendo da cepa do mouse usada e do site, número e meios de interrupção arterial. Este protocolo descreve um método único que combina artéria femoral e eletrocoagulação venosa com a administração de um inibidor de óxido nítrico (NOS) para induzir de forma confiável gangrena de footpad em camundongos Friend Virus B (FVB) que se assemelha à perda de tecido de CLTI. Enquanto os meios tradicionais de avaliação da reperfusão, como a imagem de perfusão de doppler laser (LDPI) ainda são recomendados, a perfusão intracardiac do corante lipofílico 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) é usada para rotular a vasculatura. A microscopia de varredura a laser confocal subsequente permite a reconstrução de redes vasculares de alto nível (3D) de alta resolução tridimensional (3D) que complementa os meios tradicionais de avaliar a reperfusão em modelos de isquemia hindlimb.

Este protocolo detalha um meio confiável de induzir isquemia e perda de tecido no footpad murine usando uma combinação de artéria femoral e coagulação venosa com a administração L-NAME, um inibidor de sinthase de óxido nítrico, em camundongos FVB suscetíveis. A Figura 1 detalha a anatomia da vasculatura de limítrofe murina e indica os locais da artéria femoral e coagulação venosa (X amarelo), apenas proximal à artéria femoral circunflexo lateral (LCFA) e proximal à junção saphenopopliteal. A...

O presente protocolo descreve um modelo único e clinicamente relevante de doença arterial periférica que combina artéria femoral e eletrocoagulação venosa com a administração de um inibidor de sinthase de óxido nítrico para induzir gangrena de copulxina em camundongos FVB. A perfusão II intracardiac é então usada para imagens tridimensionais de alta resolução da vasculatura do footpad.

Imagem tridimensional de alta resolução da Vasculatura do Footpad em um Modelo de Gangrena Hindlimb Murine

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

Este protocolo apresenta como criar um modelo de gangrena de pastilha de pé de rato usando administração de inibidor de massa e coagulação da artéria femoral. A perfusão diI permite, então, a visualização de alta resolução da vasculatura do bloco de pé. Este modelo é clinicamente relevante e pode ser usado para testes de drogas pré-clínicas e para estudar isquemia de membros.A visualização de alta resolução da vasculatura oferece um meio tecnicamente fácil de avaliar a neovascularização. Este modelo de gangrena de almofada de pé tem aplicações importantes em pesquisas pré-clínicas de doença arterial periférica e isquemia crítica de membros. A perfusão dii é uma ferramenta útil para estudar a neovascularização em modelos animais.Demonstrando o procedimento estarão Antoine Ribieras, residente cirúrgico, e Yulexi Ortiz, um pesquisador associado do meu laboratório. Primeiro, faça a solução de trabalho diI adicionando 200 microliters de solução de estoque DiI a 10 mililitros da solução diluente de trabalho imediatamente antes do uso. Aperte à mão para misturar bem.Conecte duas ou três paradas de três vias e uma agulha borboleta calibre 25 em série. Prepare 10 seringas mililitros com quatro mililitros de PBS, 10 mililitros de solução DiI e 10 mililitros de formalina tamponada 10% neutra. Conecte a seringa com formalina à porta de entrada proximal e injete a solução para liberar o ar da linha.Em seguida, vire a torneira para fechar o porto. Repita o mesmo procedimento, conectando as seringas com DiI e, em seguida, PBS aos portos de entrada média e dítal, respectivamente. Pós-eutanásia, coloque o animal em uma posição supina em uma almofada absorvente e proteja axilas e extremidades inferiores com agulhas.Usando uma tesoura, faça uma incisão transversal para abrir a cavidade abdominal, depois exponha e divida o diafragma esquerdo e direito para acessar a cavidade torácica. Corte a parede do peito em ambos os lados do esterno das costelas inferiores para a primeira ou segunda costelas. Use um hemostat para pegar a extremidade inferior do esterno e refleti-lo em direção à cabeça do animal para expor a cavidade torácica.Identifique o ventrículo esquerdo, que aparece de cor mais clara que o direito. Segure suavemente o coração com fórceps sem cortes e insira a agulha borboleta no ventrículo esquerdo. Use uma tesoura ou uma agulha calibre 18 para perfurar o átrio direito, permitindo que soluções de sangue e perfusão retornem ao coração para drenar.Abra a porta da seringa com PBS e injete manualmente de dois a quatro mililitros a uma taxa de um a dois mililitros por minuto durante um a dois minutos para retirar o sangue do sistema vascular. Garanta a perfusão bem sucedida observando o sangramento do átrio direito. Após a injeção, feche a porta da seringa PBS.Abra a porta da seringa com DiI e injete de cinco a dez mililitros a uma taxa de um a dois mililitros por minuto durante cinco minutos. Após a injeção, feche a porta da seringa DII e espere por dois minutos para permitir a incorporação do corante antes da injeção de fixação. Abra a porta da seringa com formalina e injete de cinco a dez mililitros a uma taxa de um a dois mililitros por minuto durante cinco minutos.Após a injeção, remova a agulha do ventrículo esquerdo. Usando uma tesoura pesada, desloque a tíbia no tornozelo, separando completamente os pés esquerdo e direito das pernas inferiores. Coloque os pés colhidos em uma placa de 12 poços com um a dois mililitros de solução de 10%.Enrole a placa com papel alumínio e armazene a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, substitua a solução fixativa em uma placa de 12 poços por um a dois mililitros de PBS por poço. Faça uma incisão longitudinal com um bisturi na parte plantar e dorsal do pé.Em seguida, usando fórceps dentados e um pequeno hemostato, remova cuidadosamente toda a pele do pé e dos dígitos, não danificando os tecidos moles subjacentes. Para montar tecidos, coloque individualmente os pés entre dois slides de microscópio de vidro com uma almofada de biópsia de espuma dobrada sobre si mesma em cada extremidade. Use dois pequenos clipes de aglutinante para comprimir os slides de vidro juntos em cada extremidade.Alternativamente, devolva a almofada para uma placa de 12 poços com um a dois mililitros de PBS. Depois de cobri-lo com papel alumínio, armazene-o a quatro graus Celsius para manter a fluorescência por até um mês. Ligue o sistema de imagem, inicie o software de aquisição e use uma baixa ampliação ou baixo objetivo de abertura numérica para capturar imagens.Clique em sim para ativar a caixa de diálogo do estágio. Ative o laser de 561 nanômetros na guia de configuração. Na tela principal, ative um caminho visível do feixe clicando no botão visível.Defina um detector para a faixa de 570 a 600 nanômetros clicando na caixa de seleção ativa correspondente. Selecione o ícone de digitalização de ladrilhos na guia de aquisição e defina a resolução desejada. Posicione a amostra de tecido montado seco compactada entre lâminas de vidro no estágio do microscópio e coloque o tecido em foco.Navegue até um canto da amostra. No menu de varredura de ladrilhos, clique no botão de posição de marcação. Navegue até o canto oposto e clique no botão de posição de marca novamente definindo os limites de varredura.Para definir a profundidade da pilha Z, clique no botão ao vivo. Navegue até o centro da amostra e use o botão do eixo z para rolar até a parte inferior da amostra. Na guia de aquisição no menu Z-stack, clique no botão iniciar.Role até o topo da amostra e clique no botão final. Clique no tamanho do passo Z e defina para o valor desejado. Em seguida, clique em iniciar a aquisição de imagens.A figura mostra a variação da perda de tecido que pode ser esperada a partir deste modelo uma semana após a cirurgia com escores FABER registrados no canto inferior direito de cada imagem. Imagens de microscopia de reconstrução revelam anatomia vascular normal em almofada de pé de controle não ligada em comparação com a perfusão severamente diminuída à almofada do pé de retrocesso ligado cinco dias após a cirurgia. 20 dias após a cirurgia, a perfusão ao pé melhorou significativamente, embora não na extensão do controle não ligado.O vídeo mostra que a renderização de superfície foi então criada usando a funcionalidade de animação. Lave todas as bolhas de ar da montagem de perfusão. Se os pulmões se expandirem e ficarem rosados durante a perfusão, a agulha penetrou no ventrículo direito e deve ser retraída ligeiramente.Os tecidos dos membros podem ser usados para imunossuagem para avaliar necrose muscular, regeneração tecidual, densidade dos vasos e recrutamento de células progenitoras, e outras células de reparação de tecidos. A técnica de perfusão dii neste modelo de gangrena murina tem sido usada em estudos de terapias genéticas e celulares. A pesquisa visa melhorar a perfusão em membros de pacientes com isquemia de membros críticos.

high-resolution-three-dimensional-imaging-footpad-vasculature-murine

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

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