Name: Isolamento Rápido de Nematoides Selvagens por Baermann Funnel (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Aprenda a isolar nematoides selvagens de substratos naturais usando o método de funil de Baermann. Esta técnica simples permite estudar genes e genomas de Caenorhabditis em seu contexto ecológico natural.

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Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH R35GM141906 e R21ES031364 e Damon Runyon Fellowship DRG-2371-19.

1. Preparação de placas de GNM semeadas no campo
<ol><li>Antes da viagem, pese 23,005 g de Nematode Growth Medium (NGM) (ver Tabela de Materiais) em pó e pré-embalar em um saco plástico vedado. Faça um saco para cada litro de mídia desejada. NOTA: A pré-embalagem antes da viagem contorna a necessidade de um equilíbrio funcional no campo.</li>
	<li>Antes de viajar, prepare 1 mL de 1M MgSO4, 1 mL de 1M CaCl2 e 25 mL de tampão fosfato de potássio de 1M para cada litro de mídia desejada. Para fazer 1 L de tampão fosfato de potássio, dissolva 108,3 g de KH2PO4 e 35,6 g de K2HPO4 na água, conforme descrito no WormBook20.</li>
	<li>Antes da viagem, faça uma cultura noturna de OP50 (ver Tabela de Materiais) cultivada em LB a 37 °C, como descrito no WormBook20. Aliquot a cultura em tubos cônicos de 50 mL e enrole os topos com filme de parafina para evitar vazamentos.</li>
	<li>No campo, dissolva o conteúdo do pacote NGM em 973 mL de água dupla destilada (ddH20) ou a água mais pura e estéril disponível em um frasco ou garrafa de 1 L.</li>
	<li>Coloque o frasco de mídia ou garrafa, com uma tampa de folha solta ou alumínio, em um banho de água quente fervente em um prato quente ou fogão. Mexa ocasionalmente até que todo o pó seja dissolvido e esteja claro (isso leva ~30 min). NOTA: Se uma placa magnética estiver disponível, uma barra de mexida é uma excelente opção para limitar a quantidade de agitação manual.</li>
	<li>Retire a mídia do banho de água e esfrie para ~58 °C com agitação ocasional ou com uma barra de mexida. Uma vez que a mídia seja resfriada a 58° C, use pipetas sorológicas ou padrão para adicionar 25 mL de tampão fosfato de potássio de 1M, 1 mL de 1M MgSO4 e 1 mL de 1M CaCl2, misturando-se bem entre cada passo.</li>
	<li>No ambiente mais estéril disponível, pipeta ou despeje a mídia em placas do tamanho desejado e deixe esfriar e solidificar durante a noite. Despeje uma placa de 60 mm (~10 mL) para cada amostra de substrato. Despeje uma placa de 35 mm (~3,5 mL) para cada linha isofemale; o número de pequenas placas necessárias é difícil de prever com antecedência.</li>
	<li>Pipeta 50 μL de cultura OP50 em cada placa e permitir que ela seque e cresça durante a noite antes do uso.</li>
</ol>2. Coleção dos substratos nematoides
<ol><li>Identifique um substrato rico em bactérias no campo. Alguns exemplos incluem frutas podres, flores, fungos e caules de plantas herbáceas. O solo e o lixo das folhas também são adequados, embora raramente contenham Caenorhabditis.</li>
	<li>Com uma mão enluvada, coloque uma amostra deste substrato (1-15 cm3) em um saco plástico vedável (ver Tabela de Materiais) rotulado com um ID de amostra único (Figura 1A).</li>
	<li>Registo o ID amostral, latitude, longitude, data, descrição do substrato, e quaisquer outras medidas ambientais locais relevantes para o experimento, incluindo temperatura ambiente e substrato, tempo de coleta, condição de substrato, presença de macroinvertebrados associados a substratos, e assim por diante. Um aplicativo para smartphone está disponível para agilizar esse processo21.</li>
</ol>3. Preparação de uma matriz de funis Baermann
<ol><li>Para cada funil, use uma tesoura para cortar um segmento de tubos de borracha (ver Tabela de Materiais) ~3 cm de comprimento.</li>
	<li>Coloque o segmento de tubulação sobre a extremidade de um funil plástico (ver Tabela de Materiais). Isso pode levar algum esforço, pois o ajuste é muito apertado.</li>
	<li>Deslize um grampo de tubo sobre o tubo de borracha e aperte-o fechado.</li>
	<li>Para fazer um suporte de funil, use um bisturi para cortar orifícios circulares de 35 mm de diâmetro na parte inferior de uma bandeja de papelão fly-vial (ver Tabela de Materiais) que não foi dobrada a partir de sua orientação de transporte plano. Uma bandeja padrão pode acomodar 12 desses orifícios em uma matriz 3 x 4.</li>
	<li>Inverta o papelão, dobre as laterais uma vez (não duas vezes, como seria fazer uma bandeja de frasco de mosca), e tape os lados juntos para elevar a bandeja de papelão invertida (Figura 2).</li>
	<li>Coloque funis nos orifícios, primeiro certificando-se de que os grampos de tubulação estão na posição fechada.</li>
</ol><img alt="Configuração de secagem por gotejamento de papelão para copos de plástico invertidos em laboratório; processo de secagem, uso do equipamento." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Bandejas de frasco de papelão reaproveitado, dobradas e cortadas para suportar 12 funis Baermann cada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
4. Transferência de amostras para os funis
<ol><li>Despeje água (tão estéril quanto disponível) em cada funil, preenchendo-a cerca de 3 cm abaixo da borda. Se as bolhas de ar estiverem presas na tubulação, toque no funil para soltá-las.</li>
	<li>Com as mãos enluvadas, coloque um lenço sem fiapos ou especificamente um Kimwipe (dobrado ao meio para fazer um quadrado) sobre o funil, e pressione para baixo no centro para que ele fique submerso na água.</li>
	<li>Quebrar manualmente grandes pedaços sólidos de substratos naturais (frutas, flores, solo, lixo de folhas, etc.) em fragmentos menores para minimizar a distância que os vermes devem viajar para cair do substrato. NOTA: Lixo de folha e amostras desajeitadamente moldadas podem ser pré-processadas em um processador de alimentos ou liquidificador.</li>
	<li>Coloque suavemente uma amostra do substrato natural (1-15 cm3) sobre o lenço sem tecido/fiapos em um funil sem perfurar o tecido e sem a amostra saliente acima da borda.</li>
	<li>Rotule o funil, ou o papelão ao lado do funil, com o ID da amostra correspondente às notas de coleta de campo.</li>
	<li>Dobre os cantos do lenço sem tecido/fiapos sobre a amostra (Figura 1B). Tenha cuidado para manter a amostra contida no lenço sem tecido/fiapos para que nenhum solo ou detrito possa passar para o fundo do funil. NOTA: Este passo é para evitar que os cantos draping sobre a borda do funil, onde eles iriam pavio a água do funil sobre os lados.</li>
	<li>Com as mãos, uma espátula, ou uma ponta de pipeta, escolha quaisquer insetos ativos, milípedes ou outros animais que possam viajar do funil ao funil, contaminando amostras cruzadas. Enrole a limpeza sem tecido/fiapos inteiramente ao redor da amostra ou coloque um segundo tecido no topo da amostra para evitar a contaminação cruzada.</li>
	<li>Adicione mais água aos funis para que toda a amostra fique submersa (Figura 3).</li>
</ol><img alt="Experimente amostras de chá com técnicas de infusão, análise do tempo de maceração e configuração de degustação." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Funis Baermann montados. Cada amostra é embrulhada em lenço sem tecido/fiapos e submersa sob a água no funil, que está preso. Durante um período de ~12 h, os nematoides migrarão através do tecido e para o fundo do funil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
5. Extração de nematoides dos funis
<ol><li>Aguarde ~12 h ou durante a noite. Durante este tempo, os vermes ativos se contorcerão para fora do substrato, através da limpeza sem tecido/fiato e até a parte inferior do funil preso. NOTA: Esperar muito mais do que 12h corre o risco de mortalidade por hipoxia ou infecção patogênica, o que também pode ser um risco em durações mais curtas para amostras que estão particularmente cheias de vermes e bactérias.</li>
	<li>Escreva o ID amostra de um funil na parte inferior de uma placa de verme NGM de 60 mm semeada com uma mancha de bactérias OP50 E. coli . Retire a tampa da placa.</li>
	<li>Remova o funil que contém essa amostra do suporte do funil. Usando uma mão para segurar o funil ereta acima da placa de verme aberta, use a outra mão para liberar pressão sobre o grampo de tubulação, permitindo que uma gota de água caia da tubulação sobre a placa de verme (Figura 1C). Assim que a água cair do funil, aperte-a rapidamente novamente para evitar inundar a placa NGM. NOTA: Para selecionar vermes atraídos pelo OP50, incluindo espécies de Caenorhabditis , solte a gota longe do gramado bacteriano. Quando a água mergulha na placa ou evapora, os nematoides de Caenorhabditis rastejarão para o gramado bacteriano.</li>
	<li>Limpeza: Jogue fora o conteúdo dos funis. Lave os funis com água quente para posterior reutilização.</li>
</ol>6. Estabelecer as culturas
<ol><li>Observe os nematoides isolados sob o estereóscópio em uma ampliação de 5x-50x. As placas devem incluir nematoides, e em frequências muito mais baixas, pequenos annelids oligochaete, tardigrades, rotifers e pequenos crustáceos (Figura 4). NOTA: Se o funil tiver sido configurado corretamente, nenhum ácaro, insetos ou material visível não vivo terá feito isso através do funil.</li>
</ol><img alt="Imagem microscópica de nematóides mostrando densidade populacional; útil para análise de estudos biológicos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Conteúdo da primeira gotícula liberada de um funil Baermann em uma placa NGM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="2"><li>Para estabelecer linhas isoherma afrodite ou isofemale, use uma picareta de vermes para transferir cada hermafrodita L4 ou fêmea adulta acasalada (reconhecível pelo seu tamanho maior do corpo e falta da cauda masculina distinta22) para uma placa NGM separada de 35 mm semeada com OP50 (Figura 1D). Use um isqueiro para esterilizar a picareta de vermes antes e depois de transferir vermes.</li>
	<li>Use filme de parafina para embrulhar cuidadosamente as placas para viajar.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não declaram conflitos de interesse.

O princípio central deste método é que os nematoides passarão pelo tecido submerso na água, enquanto seus contaminantes de substrato e invertebrados maiores não passarão. As etapas críticas do protocolo são (1) a coleta de um substrato apropriado, (2) submergir o substrato, envolto em um material filtrante, em água, (3) coletando vermes que passaram pelo filtro e afundaram até o fundo da água, e (4) isolando vermes individuais para criar linhas isofemale ou isohermafrodita. Todas as outras partes do método são favoráveis à modificação conforme necessário de acordo com os recursos disponíveis, a natureza dos substratos ou as metas de trabalho de campo. Algumas modificações que valem a pena considerar são as seguintes.
Isca dos vermes plantando frutas Se não houver um amplo suprimento de material podre rico em bactérias para ser encontrado no local do campo, pode-se querer trazer uma amostra, como um pedaço de maçã ou tomate, para deixar apodrecer. Fixe a isca bem com algumas estacas para que animais maiores não os removam e assim ele possa ser facilmente encontrado mais tarde para coleta. Evite a luz solar direta, onde a isca pode secar antes de apodrecer.
Construindo aparelhos de funil a partir de qualquer material disponível Qualquer estrutura com orifícios grandes o suficiente para acomodar o grampo de tubulação e estável o suficiente para suportar um funil pesado funcionará. Para um único funil, um copo de bebida é um suporte adequado. Qualquer tipo de tecido – tecido facial, papel higiênico ou toalhas de papel – pode ser usado.
Colocar menos material em funis, ou ajustar o tempo de espera, para prevenir hipóxia ou infecção Se a amostra tiver uma concentração muito alta de vermes ou bactérias, nematoides podem começar a morrer de hipóxia ou infecção antes que a incubação de 12 h esteja completa. Se isso for uma preocupação, o pesquisador pode verificar funis mais cedo ou preparar um funil adicional com uma subamostra muito pequena do substrato altamente povoado.
Ajustando a preparação da placa NGM às necessidades e restrições experimentais As placas de NGM podem ser preparadas com qualquer mídia e fonte de alimento apropriada para o experimento. O protocolo de campo descrito acima foi projetado para minimizar o peso da bagagem. Dependendo das limitações da bagagem e do tempo de trabalho de campo, trazer placas de GNM já derramadas – preparadas em laboratório ou compradas comercialmente – pode ser preferível ao invés de derramar placas no campo.
Realizando os isolamentos do funil no laboratório O protocolo descreve a realização do procedimento completo em condições de campo para capturar a população de nematoides como ocorre na natureza. Para alguns objetivos de pesquisa, pode ser suficiente para isolar nematoides mais tarde, depois de viajar de volta ao laboratório com amostras em sacos lacrados. Mesmo assim, o método do funil Baermann fornece uma amostra mais limpa e completa dos nematoides sobreviventes do que outros métodos de isolamento. No entanto, amostras em sacos lacrados podem experimentar seleção durante a viagem, pois estão expostas a potenciais extremos de temperatura e hipóxia. Isso pode ser minimizado realizando isolamentos o mais rápido possível após a coleta da amostra.
Um método alternativo comum ao funil Baermann envolve colocar o substrato diretamente em uma placa de NGM e esperar que os vermes se arrastem para fora, o que é altamente trabalhoso ou resulta na coleta incompleta da população. Também produz placas contaminadas com ácaros e larvas de insetos. O método do funil Baermann é uma estratégia de baixa tecnologia e baixa mão-de-obra para separar rapidamente toda a população de vermes ativos de seu substrato.
O método do funil baermann não é universalmente aplicável para coletar todos os tipos de nematoides selvagens. Alguns nematoides que habitam plantas levam muito mais de 12h para emergir de seu substrato e estarão ausentes de uma gotícula liberada muito cedo, enquanto alguns parasitas de insetos rastejarão até o topo do funil em vez da parte inferior, também fugindo da coleta14. Alternativas ao funil Baermann ou exigem equipamentos mais especializados ou mais mão-de-obra para recuperar os vermes. No entanto, eles ainda podem ser preferidos se as ressalvas acima forem um problema para o experimento. Opções alternativas, revisadas por van Bezooijen14, incluem o método de pulverização de funil, que fornece uma névoa constante de água aos funis, adicionando oxigênio e permitindo o transbordamento de bactérias em suspensão. Isso permite um período de extração mais prolongado de nematoides das plantas. O método de flutuação centrífugas do liquidificador recupera nematoides lentos, inativos ou para cima, separando-os por sua gravidade específica, o elutriador de oostenbrink aplica uma corrente para separar sedimentos de nematoides suspensos, e o Método cobb usa uma série de peneiras para isolar nematoides pelo seu tamanho, forma e taxa de sedimentação14. Para coletar rabditids, porém, o funil Baermann produz efetivamente amostras limpas rapidamente e com o mínimo esforço.

Valiosas percepções biológicas estão surgindo à medida que pesquisadores que estudam C. elegans no laboratório expandem seu foco para C. elegans e nematoides de rabditid relacionados na natureza. Estudos de nematoides selvagens colocam genes e genomas em seu contexto natural, revelando funções potencialmente obscurecidas por condições laboratoriais1,2,3,4,5. Esses estudos geram insights sobre o pré-requisito para a própria evolução, variação genética6,7,8,9,10. A variação genética natural capturada por amostras selvagens também fornece incursões na base genética de muitos traços complexos11,12,13.
Ao projetar estudos que requerem o isolamento de populações naturais de nematoides, particularmente na realização de trabalhos de campo remotos, considerações práticas vêm à tona. Este protocolo visa isolar limpamente populações inteiras de nematoides ativos que podem ser cultivadas em OP50 a partir de iscas ou substratos selvagens. O método é adequado para extrair nematoides de rhabditid e diplogasterid de vida livre, incluindo Caenorhabditis, Oscheius e Pristionchus.
Existem muitas técnicas para isolar nematoides de seus substratos14,15. A abordagem mais básica é colocar o substrato diretamente em uma placa nematoides-média, colhendo animais enquanto rastejam para fora8,15. Este método requer grandes quantidades de tempo e trabalho se o objetivo é isolar todos os nematoides de uma amostra. Técnicas mais sofisticadas aproveitam o peso, tamanho, mobilidade ou alguma combinação destes14. Cada método tem suas vantagens e desvantagens em termos de configuração e throughput. Eles também diferem em seus vieses amostrais e podem selecionar para certos nematoides se os animais da amostra variam ao longo do eixo do princípio de separação do método.
O método do funil baermann foi descrito pela primeira vez em 1917 pelo médico holandês G. K. T. F. Baermann, que inventou o dispositivo em Java enquanto estudava nematoides que habitam o solo, incluindo a minhoca parasita16. O funil baermann funciona com base no princípio da mobilidade. O substrato é colocado em um funil forrado com um pano ou filtro de papel (um "Kimwipe" é usado para este estudo, chamado de "limpeza sem fiapos" no protocolo atual) e fechado na parte inferior. O funil é então preenchido com água, submergindo a amostra enquanto o filtro a separa da tomada selada. Nematoides ativos na amostra liberam-se na água e nadam através do filtro, eventualmente se estabelecendo na parte inferior do funil. A saída do funil é aberta, e uma gota de nematoides é expelida em uma placa (Figura 1).
<img alt="Processo de decomposição, extração do funil de Berlese, diagrama de isolamento de insetos, configuração do estudo entomológico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Resumo da técnica do funil Baermann. (A) Coletar uma amostra rica em bactérias de um local de interesse. (B) Submergir a amostra em um funil Baermann e esperar que os vermes se contorcessem e afundassem. (C) Liberando uma única gota do funil. (D) Mover hermafroditas solteiras ou fêmeas acasaladas para separar placas. Ilustração criada por Ramin Rahni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O funil Baermann não funcionará para todos os tipos de nematoide (ver seção discussão para alternativas específicas) e é mais adequado àqueles que são formas ativas na faixa de tamanho de Caenorhabditis ou menor14. No entanto, se um estudo pode usar o funil Baermann, há muitas vantagens. O método é prático no campo, exigindo configuração limitada, tempo prático e custo. O pesquisador fica com uma amostra limpa sem a obstrução do substrato na placa, o que facilita a colheita. O uso de um filtro também evita a contaminação da placa por larvas de insetos ou ácaros, que mastigam placas ou presas em nematoides na amostra. Mais importante, o funil Baermann extrai eficientemente quase toda a população do substrato14, o que pode ser necessário dependendo do desenho do estudo. Por exemplo, pesquisadores interessados em contar o estágio ou distribuição sexual de populações selvagens, encontrar genótipos de crescimento lento ou raro, ou amostrar nematoides não atraídos pelo OP50 podem se beneficiar desse método. Isso é apropriado para pesquisadores que estudam questões ecológicas17, genética populacional18 ou metagenética19 , pois o esquema amostral tira um instantâneo da população no momento da amostragem.
O presente manuscrito descreve um protocolo completo para isolar populações de nematoides usando o funil baermann e estabelecer linhas isofemale e isohermafrodita no campo, utilizando equipamentos escolhidos para fácil transporte. Para pesquisadores que realizam trabalhos de campo perto de seus laboratórios, muitas dessas etapas podem ser omitidas ou simplificadas.

<table><tbody><tr><td>Frasco de vidro</td><td>de 1 L NA</td><td>NA</td><td>NA Etapa 1 - recipiente para fazer mídia de placa</td></tr> 1 <tr><td>mL de pontas de pipeta</td><td>qualquer</td><td>NA</td><td>Etapa 1 - dispensar aditivos de mídia sem-fim e placas de sementes</td></tr><tr><td>1 mL pipetador</td><td>qualquer</td><td>NA</td><td>Etapa 1 - dispensar aditivos de mídia sem-fim e placas de sementes</td></tr><tr><td>Placas sem-fim de 35 mm</td><td>Tritech</td><td>T3500</td><td>Etapa 1 - placas sem-fim</td></tr><tr><td>Tubo de borracha de 4 mm de diâmetro interno</td><td>Fisher</td><td>14178A</td><td>Etapa 3 - parte do funil</td></tr><tr><td>Placas sem-fim de 60 mm</td><td>Greiner</td><td>628161</td><td>Etapa 1 - placas sem-fim</td></tr><tr><td>65 mm Funil</td><td></td><td>Fisher 22170156</td><td>Etapa 3 - parte do funil</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Etapa 1 - placa sem-fim média</td></tr><tr><td>Panela</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Etapa 1 - banho-maria para derreter o ágar-ágar para despejar pratos</td></tr><tr><td>E. coli cepa OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td>Etapa 1 - comida para minhocas</td></tr><tr><td>Microscópio de campo</td><td>OMAX</td><td>G223CS</td><td>Etapa 6 - para visualização de vermes no campo</td></tr><tr><td>Bandeja de armazenamento de frascos para moscas</td><td>Azer Scientific</td><td>ES-260T</td><td>Etapa 3 - para construir uma plataforma para conter 12 funis</td></tr><tr><td>Placa quente ou fogão</td><td>NA NA</td><td></td><td>Etapa 1 - para aquecer o banho-maria</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>KimberlyClark</td><td>34120</td><td>Passo 4 - filtro para os funis</td></tr><tr><td>LB meio</td><td>Gibco</td><td>10855021</td><td>Passo 1 - para o cultivo OP50</td></tr><tr><td>Isqueiro</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Passo 6 - esterilizar o picador de minhoca</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td>Passo 1 - meio de placa sem-fim</td></tr><tr><td>NGM-lite ágar</td><td>USBiological</td><td>N1000</td><td>Passo 1 - meio</td></tr> <tr><td>de placa sem-fimFilme de embrulho Parafilm M</td><td>Fisher</td><td>13-374-10</td><td>Etapa 6 - embalar placas sem-fim para viagens</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico</td><td>Fisher</td><td>BP363-500</td><td>Etapa 1 - placa sem-fim média</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Fisher</td><td>P285-3</td><td>Etapa 1 - bisturi médio com placa sem-fim</td></tr><tr><td></td><td>NA</td><td>NA</td><td>Etapa 3 - fazer furos para os funis</td></tr><tr><td>tesoura</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Etapa 3 - corte o tubo de borracha</td></tr><tr><td>Fita</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Etapa 3 - prenda o suporte do funil</td></tr><tr><td>Braçadeiras de tubulação</td><td>Fisher</td><td>5869</td><td>Etapa 3 - parte do funil</td></tr><tr><td>Picareta sem-fim</td><td>NA</td><td></td><td>NA Etapa 6 - para isolar minhocas individuais</td></tr><tr><td>Sacos de armazenamento estilo ziplock</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Etapa 2 - para ensacar uma amostra de substrato</td></tr></tbody></table>

isolamento rápido de nematoides selvagens por baermann funnel

Rapid Isolation of Wild Nematodes by Baermann Funnel

Além de serem organismos modelos experimentais robustos, os caenorhabditis elegans e seus parentes também são animais reais que vivem na natureza. Estudos de nematoides selvagens em seus ambientes naturais são valiosos para entender muitos aspectos da biologia, incluindo os regimes seletivos em que personagens genômicos e fenotípicos distintos evoluem, a base genética para variação de traços complexos e a diversidade genética natural fundamental para todas as populações animais. Este manuscrito descreve um método simples e eficiente para extrair nematoides de seus substratos naturais, incluindo frutas podres, flores, fungos, lixo de folhas e solo. O método do funil baermann, uma técnica clássica de nematologia, isola seletivamente nematoides ativos de seus substratos. Por recuperar quase todos os vermes ativos da amostra, a técnica do funil baermann permite a recuperação de genótipos raros e de crescimento lento que coexistem com genótipos abundantes e de rápido crescimento, que podem ser perdidos em métodos de extração que envolvem várias gerações de reprodução. A técnica também é adequada para abordar questões metagenéticas, populacionais e ecológicas. Captura toda a população em uma amostra simultaneamente, permitindo uma visão imparcial da distribuição natural de idades, sexos e genótipos. O protocolo permite a implantação em escala no campo, convertendo rapidamente substratos em placas de vermes, e os autores validaram-no através do trabalho de campo em vários continentes.

Este protocolo foi usado para isolar nematoides de frutas, flores, fungos, solo e caules na Ilha Do Barro Colorado, Panamá, na estação de campo do Instituto smithsoniano de pesquisa tropical em agosto de 2018. Dos 131 substratos processados por um único investigador ao longo de quatro dias, 130 substratos (99,2%) renderam nematoides. Quarenta e quatro dos substratos (33,6%) produziram nematoides caenorhabdite (Figura 5). Análises posteriores das culturas estabelecidas a partir desses quarenta e quatro substratos, por PCR e testes de acasalamento23, revelaram a presença de seis espécies diferentes de Caenorhabditis – C. becei, C. tropicalis, C. briggsae, C. sp. 24, C. sp. sp. 57 e C. panamensis.
Este protocolo foi usado novamente para isolar nematoides de vários substratos na Zona de Exclusão de Chernobyl, ucrânia, durante quatro dias em agosto de 2019. Vermes vivos foram recuperados de 62 das 63 amostras de solo, 1 em cada 17 amostras de invertebrados, 31 de 75 amostras de frutas, 1 em cada 12 amostras de isca (ver seção Discussão) e nenhum verme foi recuperado de amostras de cogumelos, canas de rio ou fezes de lobo (uma amostra coletada de cada). O sequenciamento subsequente do DNA ribossômico 18S15 identificou esses nematoides como Oscheius, Panagrolaimus, Acrobeloides, Mesorhabditis, Panagrellus, Pristionchus e Pelodera, mas nenhuma Caenorhabditis foi identificada (Figura 5).
<img alt="Gráfico de barras de amostras de nematóides e Caenorhabditis no Panamá, Ucrânia, por localização e porcentagem coletada." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: Taxas de sucesso de duas viagens de coleta. Panamá em 2018 (esquerda) e Ucrânia em 2019 (direita). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve um método para extrair eficientemente nematoides vivos de substratos naturais no campo.

Isolamento Rápido de Nematoides Selvagens por Baermann Funnel

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild ...

Caenorhabditis nematodes são animais de verdade, que vivem na natureza. A coleta de nematoides selvagens nos permite estudar genes e genomas em seu contexto natural revelando funções, que podem ser obscurecidas pelas condições artificiais do laboratório. Esta técnica, extrai vermes, de substratos orgânicos ricos em bactérias no campo, e cria culturas limpas em placas de Petri, capturando um instantâneo de cada população, no momento em que foi coletada.Essas populações são adequadas para questões de ecologia, genética populacional ou metagenia. Culturas de cepas selvagens também são valiosas para estudos genéticos quantitativos. Esta técnica é simples, e fácil de executar, mesmo para um novato em pesquisa de campo.No entanto, uma viagem de coleta bem sucedida requer uma preparação pensada de materiais, antes de viajar. Identifique um substrato rico em bactérias no campo, como frutas podres, flores, fungos, caules de plantas herbáceas, solo ou lixo de folhas. Coloque um pequeno volume do substrato, em um saco plástico rotulado.Se o material podre é raro no lado do campo de interesse, coloque algumas frutas como isca. Deixe-o para balançar, depois recupere-o, e todos os vermes que a colonizaram. Registo da amostra ID, latitude, longitude, data e descrição do substrato.Regisso registro de outras medidas ambientais locais, relevantes para o experimento, como temperatura ambiente e substrato, condição de substrato, tempo de coleta e presença de macrovertbrados associados ao substrato. Use uma tesoura para cortar um segmento de três centímetros, de tubos de borracha de cada funil. Coloque a tubulação sobre a extremidade de um funil de plástico.Deslize um grampo de tubo sobre o tubo de borracha, e aperte-o fechado. Para fazer um suporte de funil, corte buracos circulares, no centro de uma bandeja de mosca de papelão desdobrada. Inverta o papelão, dobre os lados uma vez e grave-os juntos.Isso criará pernas que elevam os buracos acima do banco. Certifique-se de que os grampos de tubulação estão na posição fechada e coloque funis nos orifícios. Despeje água estéril em cada funil, enchendo-a cerca de três centímetros abaixo da borda.Toque no funil, para liberar quaisquer bolhas de ar presas na tubulação. Dobre uma limpeza sem fiapos ao meio, para fazer um quadrado, e coloque-o sobre o funil. Em seguida, pressione a limpeza para baixo, para submergir na água.Desprete manualmente quaisquer peças grandes e sólidas do substrato natural. Coloque delicadamente parte da amostra na limpeza do funil. Certifique-se de não perfurar a limpeza, ou deixe qualquer amostra salientes acima da borda.Dobre cuidadosamente os cantos da limpeza, sobre a amostra, para evitar que a água se ater à borda do funil. Rotule o funil com o ID da amostra, correspondente às notas de coleta de campo. Escolha qualquer inseto ativo, ou outros animais, que possam viajar e contaminar amostras cruzadas.Adicione mais água a cada funil, para submergir toda a amostra. Enquanto incubam à temperatura ambiente durante a noite, nematoides ativos se movem através do tecido, e afundam até o fundo do funil. Escreva a iD amostra de um funil, na parte inferior de uma placa de verme NGM de seis centímetros, sentada com uma mancha de bactérias OP50 E.coli.Retire a tampa da placa, remova o funil, contendo a amostra do suporte do funil, e segure-a ereto, acima da placa de verme aberta, com uma mão. Solte a pressão sobre o grampo de tubulação com a outra mão, e permita que uma ou duas gotas de água.caiam da tubulação, na placa de verme ao lado do gramado bacteriano. Assim que a água cair do funil, aperte-a rapidamente novamente, para evitar inundar a placa NGM.Para limpar, jogue fora o conteúdo dos funis, e lave-os com água quente, para posterior reutilização. Observe os nematoides isolados sob o microscópio estéreo. Além dos nematoides, ocasionalmente haverá pequenos, kits Oligo annelids, Tardigrades, rotifers e pequenos crustáceos.Para estabelecer hermafrodita ISO, ou linhas femininas ISO, transfira cada hermafrodita L4 ou fêmea adulta acasalada, para uma placa NGM separada de 3,5 centímetros, sentada com OP50. Esterilize a picareta do verme, antes e depois de cada transferência. Por fim, enrole cuidadosamente as placas para viajar, com um filme de parafina.Na ilha do Barro Colorado, no Panamá, em 2018, 131 substratos foram processados por esse método. 99% dos quais renderam nematoides. 34% renderam nematodes de Caenorhabditis.Na Zona de Exclusão de Chernobyl, ucrânia, em 2019, 170 substratos foram processados por esse método. 56% dos quais produziram nematoides, nenhum dos quais eram Caenorhabditis. Este método funciona porque os nematoides nadam através da limpeza.mas o substrato e outros animais ficam por cima. Muitos aspectos de um protocolo podem ser modificados, para fazer uso de quaisquer recursos disponíveis no campo. Amostras coletadas usando esse método permitem aos pesquisadores abordar uma ampla gama de questões de biologia populacional em culturas estabelecidas para estudos laboratoriais subsequentes.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Visualizando bactérias em nematóides por microscopia de fluorescência

Fonte: Morgan, E., et al. Limpeza Seletiva de Nematoides Selvagens Caenorhabditis para Enriquecer Bactérias do Microbioma Intestinal. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra um protocolo para isolar bactérias intestinais de interesse de vermes selvagens Caenorhabditis . Os vermes são primeiro privados de fome e lavados para eliminar bactérias residuais de alimentação de sua superfície e lúmen intestinal, preservando os microrganismos alvo. Após a limpeza da superfície e múltiplas etapas de...

Limpeza Seletiva de Vermes Caenorhabditis para Enriquecimento da Microbiota Intestinal

Os animais selvagens são comumente parasitados por uma ampla gama de helmintos. Os quatro principais tipos de helmintos são "lombrigas" (nematóides), "vermes de cabeça espinhosa" (acantocéfalos), "vermes" (trematódeos) e "tênias" (cestóides). Aqui descrevemos como os helmintos são coletados de um animal vertebrado e como eles são preservados e taxonomicamente identificados.

Coleta e identificação de helmintos da vida selvagem

Nematóides entomopatogênicos são vermes que vivem no solo que parasitam uma grande variedade de insetos. Demonstramos métodos de amostragem utilizados para o isolamento destes nematóides do solo utilizando duas técnicas: a iscagem inseto ea armadilha Branco modificado, para a recuperação de nematóides de amostras de solo e cadáveres de insetos infectados, respectivamente.

Amostragem do solo e isolamento de nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

O objetivo desta apresentação é demonstrar in vivo e in vitro técnicas para a criação de nematóides entomopatogênicos. Métodos in vivo consideram a criação destes nematóides com um inseto hospedeiro, enquanto que os métodos in vitro utilizam rico ágar.

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Heligmosomoides polygyrus é um nematóide murino com poderosos recursos de imunomoduladores que se assemelham aos da infecção por helmintos humano altamente prevalente. Aqui, descrevemos um protocolo para a manutenção a longo prazo da H. ciclo de vida polygyrus.

Cultivo de<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Um imunomodulador Nematode Parasite e seus produtos secretados

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Observação e quantificação do comportamento de acasalamento no nemátodo do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus

Os nematoides de Caenorhabditis selvagens estão associados a muitos micróbios, muitas vezes no lúmen intestinal ou infectando o intestino. Este protocolo detalha um método para enriquecer micróbios não culturais colonizando o intestino, aproveitando a resistência da cutícula dauer.

Limpeza Seletiva de Nematodes de Caenorhabdite Selvagem para Enriquecer para Bactérias do Microbioma Intestinal

O kit de ferramentas genômicas funcionais para os nematoides parasitéticos Strongyloides stercoralis e Strongyloides ratti inclui transgênese, mutagênese mediada por CRISPR/Cas9 e RNAi. Este protocolo demonstrará como usar a microinjeção intragonadal para introduzir componentes transgenes e CRISPR em S. stercoralis e S. ratti.

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Este protocolo pode ser usado para realizar levantamentos ecológicos em larga escala de nematodes caenorhabditis autodes . A principal vantagem desse método é a eficiente organização e análise de dados ecológicos e moleculares associados aos nematoides coletados da natureza.

Uma abordagem altamente escalável para realizar pesquisas ecológicas de nematodes de caenorhabditis

Caenorhabditis elegans é uma das principais espécies modelo em biologia, mas quase todas as pesquisas são realizadas na ausência de seus micróbios naturalmente associados. Os métodos descritos aqui ajudarão a melhorar nossa compreensão da diversidade de micróbios associados como base para futuras pesquisas funcionais de C. elegans.

Isolamento e Caracterização da Microbiota Natural do Nematoide Modelo Caenorhabditis elegans

Aprenda a isolar nematoides selvagens de substratos naturais usando o método de funil de Baermann. Esta técnica simples permite estudar genes e genomas de Caenorhabditis em seu contexto ecológico natural.

Isolamento Rápido de Nematoides Selvagens por Baermann Funnel

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