Isolamento Rápido de Nematoides Selvagens por Baermann Funnel

Caenorhabditis nematodes são animais de verdade, que vivem na natureza. A coleta de nematoides selvagens nos permite estudar genes e genomas em seu contexto natural revelando funções, que podem ser obscurecidas pelas condições artificiais do laboratório. Esta técnica, extrai vermes, de substratos orgânicos ricos em bactérias no campo, e cria culturas limpas em placas de Petri, capturando um instantâneo de cada população, no momento em que foi coletada.

Essas populações são adequadas para questões de ecologia, genética populacional ou metagenia. Culturas de cepas selvagens também são valiosas para estudos genéticos quantitativos. Esta técnica é simples, e fácil de executar, mesmo para um novato em pesquisa de campo.

No entanto, uma viagem de coleta bem sucedida requer uma preparação pensada de materiais, antes de viajar. Identifique um substrato rico em bactérias no campo, como frutas podres, flores, fungos, caules de plantas herbáceas, solo ou lixo de folhas. Coloque um pequeno volume do substrato, em um saco plástico rotulado.

Se o material podre é raro no lado do campo de interesse, coloque algumas frutas como isca. Deixe-o para balançar, depois recupere-o, e todos os vermes que a colonizaram. Registo da amostra ID, latitude, longitude, data e descrição do substrato.

Regisso registro de outras medidas ambientais locais, relevantes para o experimento, como temperatura ambiente e substrato, condição de substrato, tempo de coleta e presença de macrovertbrados associados ao substrato. Use uma tesoura para cortar um segmento de três centímetros, de tubos de borracha de cada funil. Coloque a tubulação sobre a extremidade de um funil de plástico.

Deslize um grampo de tubo sobre o tubo de borracha, e aperte-o fechado. Para fazer um suporte de funil, corte buracos circulares, no centro de uma bandeja de mosca de papelão desdobrada. Inverta o papelão, dobre os lados uma vez e grave-os juntos.

Isso criará pernas que elevam os buracos acima do banco. Certifique-se de que os grampos de tubulação estão na posição fechada e coloque funis nos orifícios. Despeje água estéril em cada funil, enchendo-a cerca de três centímetros abaixo da borda.

Toque no funil, para liberar quaisquer bolhas de ar presas na tubulação. Dobre uma limpeza sem fiapos ao meio, para fazer um quadrado, e coloque-o sobre o funil. Em seguida, pressione a limpeza para baixo, para submergir na água.

Desprete manualmente quaisquer peças grandes e sólidas do substrato natural. Coloque delicadamente parte da amostra na limpeza do funil. Certifique-se de não perfurar a limpeza, ou deixe qualquer amostra salientes acima da borda.

Dobre cuidadosamente os cantos da limpeza, sobre a amostra, para evitar que a água se ater à borda do funil. Rotule o funil com o ID da amostra, correspondente às notas de coleta de campo. Escolha qualquer inseto ativo, ou outros animais, que possam viajar e contaminar amostras cruzadas.

Adicione mais água a cada funil, para submergir toda a amostra. Enquanto incubam à temperatura ambiente durante a noite, nematoides ativos se movem através do tecido, e afundam até o fundo do funil. Escreva a iD amostra de um funil, na parte inferior de uma placa de verme NGM de seis centímetros, sentada com uma mancha de bactérias OP50 E.coli.

Retire a tampa da placa, remova o funil, contendo a amostra do suporte do funil, e segure-a ereto, acima da placa de verme aberta, com uma mão. Solte a pressão sobre o grampo de tubulação com a outra mão, e permita que uma ou duas gotas de água.caiam da tubulação, na placa de verme ao lado do gramado bacteriano. Assim que a água cair do funil, aperte-a rapidamente novamente, para evitar inundar a placa NGM.

Para limpar, jogue fora o conteúdo dos funis, e lave-os com água quente, para posterior reutilização. Observe os nematoides isolados sob o microscópio estéreo. Além dos nematoides, ocasionalmente haverá pequenos, kits Oligo annelids, Tardigrades, rotifers e pequenos crustáceos.

Para estabelecer hermafrodita ISO, ou linhas femininas ISO, transfira cada hermafrodita L4 ou fêmea adulta acasalada, para uma placa NGM separada de 3,5 centímetros, sentada com OP50. Esterilize a picareta do verme, antes e depois de cada transferência. Por fim, enrole cuidadosamente as placas para viajar, com um filme de parafina.

Na ilha do Barro Colorado, no Panamá, em 2018, 131 substratos foram processados por esse método. 99% dos quais renderam nematoides. 34% renderam nematodes de Caenorhabditis.

Na Zona de Exclusão de Chernobyl, ucrânia, em 2019, 170 substratos foram processados por esse método. 56% dos quais produziram nematoides, nenhum dos quais eram Caenorhabditis. Este método funciona porque os nematoides nadam através da limpeza.

mas o substrato e outros animais ficam por cima. Muitos aspectos de um protocolo podem ser modificados, para fazer uso de quaisquer recursos disponíveis no campo. Amostras coletadas usando esse método permitem aos pesquisadores abordar uma ampla gama de questões de biologia populacional em culturas estabelecidas para estudos laboratoriais subsequentes.