Visualizando o tráfico dependente de citoesqueleto de organelas contendo lipídios em embriões Drosophila

No início do embrião de Drosophila, muitas organelas sofrem movimento em grande escala. Nosso protocolo descreve como monitorar esse movimento usando corantes fluorescentes desenvolvidos para a cultura celular. Em comparação com as proteínas fluorescentes, as sondas fluorescentes disponíveis comercialmente são mais brilhantes e abrangem uma gama maior do espectro.

Eles permitem colabeling multiplex e podem ser usados em qualquer fundo genético. É preciso prática, tentativa e erro para saber quanto tempo para dessecar embriões, para que eles explodam durante a injeção ou sequem e parem de se desenvolver. Para começar, comece a preparar as agulhas de injeção colocando o capilar em um suporte capilar no puxador de agulha e prendendo-o usando porcas de asa.

Alinhe o centro do capilar com o elemento de aquecimento. De acordo com as instruções do fabricante, escolha as configurações apropriadas no puxador de agulha. Usando um microscópio de dissecação, realize o teste de controle de qualidade.

Pressione as agulhas na massa horizontalmente com as pontas da agulha suspensas no ar. Cubra as agulhas com a tampa e guarde até usar. Usando pontas de carregamento de agulhas anexadas a uma micropipette, desenhe um microliter da solução de injeção na ponta sem prender bolhas de ar.

Usando luvas, segure a agulha em uma mão com a ponta apontando para longe e insira a ponta de carregamento nela. Dispense o líquido perto da ponta da agulha, retire a pipeta e segure a agulha verticalmente até que o líquido flua até a ponta. Cubra o recipiente com papel alumínio sem danificar as pontas da agulha para evitar o branqueamento dos corantes.

Usando uma pipeta de transferência, ou uma micropipetter, coloque uma pequena gota de cola de heptano no centro de um deslizamento de tampa retangular, e permita que ela evapore. Para remover o acorde mecanicamente, cubra a placa de embrião apropriadamente envelhecida com uma fina camada de óleo de halocarboneto 27 para tornar a casca de ovo transparente. Veja a placa sob um microscópio de dissecção com iluminação trans para confirmar o estágio do embrião e selecione os embriões em estágios de decote.

Usando pinças finas, pegue um embrião do estágio desejado agarrando os apêndices dorsais e transfira-o para o slide de vidro preparado coberto com fita dupla face. Coloque o embrião na fita e minimize a transferência de óleo. Enrole o embrião suavemente através da superfície da fita, cutucando com a lateral da ponta da pinça sem cutucá-lo diretamente.

Continue rolando o embrião até que o acorde adere à fita e rachaduras. Após as rachaduras do acorde, continue rolando o embrião para separá-lo do acorde, que permanece preso à fita. Role o embrião de volta para o acorde, que é menos adesivo do que a fita.

Esfregue suavemente o embrião com a pinça até que se conecte à pinça para transferência. Em seguida, transfira o embrião para o deslizamento de cobertura e traga-o em contato com a cola para manter o embrião no lugar, separando-o da pinça. Ajuste a orientação do embrião no deslizamento da tampa.

Deixe os embriões desobsecarem por cinco a 12 minutos colocando a tampa escorregando com embriões na câmara de proficação e selando-a. Retire o deslizamento de cobertura da câmara e coloque uma gota de óleo de halocarboneto 700, cobrindo os embriões para evitar uma dessecação adicional. Examine-os sob o escopo de dissecação e prossiga para microinjeção se os embriões foram dessecados corretamente.

Coloque o objetivo 4X no caminho da luz e usando o botão de foco no microscópio, ajuste os embriões em foco. Mova os embriões horizontalmente para o centro do campo de visão usando os controles de palco. Mantenha os embriões na borda do campo de visão e guarde a panela em preparação para baixar a agulha.

Hospedando-se com o mesmo plano focal, abaixe a ponta da agulha e certifique-se de que ela seja visível no campo de visão junto com os embriões. Verifique se a agulha está funcionando distribuindo parte da solução de injeção em óleo de halocarboneto 700. Se for bem sucedida, uma bolha de solução aparecerá no óleo perto da ponta da agulha.

Usando os controles de estágio, mova o embrião em direção à ponta da agulha até que a ponta perfure suavemente o embrião e entre nele. Simultaneamente, inicie o fluxo da solução de injeção até que um ponto livre transitório apareça no local da ponta da agulha, indicando transferência de solução bem sucedida para o embrião. Fixar o deslizamento da tampa no microscópio confocal usando o porta-slides.

Tenha cuidado, pois o deslizamento da tampa é frágil. Inspecione os embriões usando a função de epifluorescência no microscópio confocal com um objetivo de 40X e certifique-se de que o fluoro 4 no embrião seja visível antes de prosseguir. Para imagens ao vivo, durante os estágios siníntiis, defina o tamanho da imagem de 512 por 512 pixels, média de linha de três e uma taxa de quadros de 0,1 quadros por segundo.

Depois que o corante BODIPY 493 503 foi injetado, ele foi localizado no local onde a ponta da agulha foi inserida e, em seguida, difundida adjacente ao local da injeção. Após 24 minutos, o corante passou do ponto médio do embrião. A motilidade organela foi monitorada injetando o embrião com BODIPY 493 503 e LysoTracker Red.

A análise da velocimetria da imagem das partículas revelou que o conteúdo embrionário convergiu para a região central do embrião, onde o citoplasma está fluindo para o interior do embrião. A rotulagem do ER, utilizando o ER-Tracker Green, fornece uma resolução vívida do envelope nuclear, permitindo a visualização dos principais estágios do ciclo celular. O embrião foi injetado com MitoView 633 no estágio de blastoderm e retratado quatro horas depois.

A imagem mostra uma célula neuroectodérmica de um embrião na extensão da banda de germes. Um embrião celularizador foi injetado com uma mistura de BODIPY 493 503 e SiR Tubulin, o que mostra que as gotículas lipídicas se movem bidirecionalmente ao longo de microtúbulos. O embrião deve ser parcialmente dessecado para que o líquido possa ser injetado.

A dessacação muito pequena fará com que o embrião vaze quando injetado, muita dessacação matará o embrião. Vídeos de organelas em movimento podem ser caracterizados através de diversas técnicas de análise de imagens. O rastreamento de partículas revela o comportamento de organelas individuais, a velocimetria de imagem de partículas revela o fluxo a granel.