Análise de microscopia de vídeo de alta velocidade para diagnóstico de primeira linha da dyskinesia ciliar primária
19 de janeiro de 2022
A análise de microscopia de vídeo de alta velocidade é uma análise relativamente fácil de executar, rápida, econômica e, em mãos experientes, uma ferramenta consideravelmente confiável para diagnósticos de primeira linha de dyskinesia ciliar primária, que deve estar disponível em todos os centros envolvidos em diagnósticos e no tratamento de doenças pulmonares graves.
A análise de microscopia de vídeo de alta velocidade é uma ferramenta confiável para o diagnóstico de primeira linha da discaquiesia ciliar primária. Esta técnica é relativamente fácil de executar, rápida, econômica, e em mãos experientes outra ferramenta muito confiável. E é aplicável para pacientes de todas as faixas etárias.
A microscopia de vídeo também revela função ciliária secundária. Como, por exemplo, devido a infecções bacterianas ou virais. Mas tem sido usado principalmente para diagnosticar a diskinesia ciliar primária.
Os cientistas usam esse método também para visualizar processos intracelulares ou funções biológicas em células vivas. Tina Peromaa, nossa técnica de laboratório.
Antes de coletar as células epiteliais respiratórias, peça ao paciente para assoar completamente o nariz. Quando o paciente estiver pronto, mantenha a cabeça do paciente fixada com uma mão e use uma escova interdental de 0,6 milímetros de tamanho na outra mão para escovar o turbinado inferior da narina para coletar tiras celulares epiteliais suficientes. Solte as tiras celulares colhidas em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo o DMEM nutrido celular.
Depois de fechar a tampa do tubo de microcentrifuuge segure o tubo contra a fonte de luz e agite o tubo para descobrir tiras de células colhidas e conglomerados. Mais tarde, coloque os tubos de microcentrifuuge com as tampas devidamente fechadas em uma caixa de poliestireno. Antes de fechar a caixa, certifique-se de que os tubos estejam fixados dentro da caixa.
Em seguida, adicione uma embalagem fria à caixa, evitando congelar o espécime. Depois de remover os tubos de micro centrífugas contendo as amostras da caixa de poliestireno, coloque um tubo sob uma capa da unidade de aquecimento do microscópio para aquecer até 37 graus celsius para a análise de microscopia de vídeo de alta velocidade ou HSVMA. Em seguida, inicie a câmera e o software da unidade de vídeo no computador.
Use uma pipeta para colher uma pequena amostra e coloque duas gotas da amostra em uma cuvette. Cubra a cuvette com uma tampa antes de colocá-la sob o microscópio. Use uma lente de imersão em óleo com uma ampliação de 100x e coloque uma gota de óleo de imersão na superfície da óptica.
Ao se aproximar da parte inferior do prato com a lente do microscópio, procure os aglomerados celulares sem glóbulos vermelhos e com baixo teor de muco. Depois de encontrar uma região representativa de interesse, ou ROI, concentre-se em um grupo de cilia batendo com os maiores movimentos de cílios e grave uma sequência de vídeo. Grave as células com batidas cilia lado sábio e de cima.
A análise representativa mostra movimentos cilia normais vistos de lado sábio e de cima. A amostra de uma discnesia ciliar primária, ou paciente pcd, com uma mutação no gene DNAH11 demonstrou o padrão clássico rígido minimamente móvel da batida ciliar. Quando visto de lado e acima.
Em outro paciente pcd com a mesma mutação, observou-se um padrão hipercinético, mas ineficiente diferente da cília de espancamento. Um padrão patológico de batida ciliar e frequência de batida ciliar também foram observados em um paciente com infecções recorrentes nas vias aéreas superiores. Se o procedimento de escovação for realizado rigorosamente, a análise do HSVMA não poderá ser realizada, pois as células epiteliais ciliadas foram cobertas com um revestimento de glóbulos vermelhos.
O passo mais importante no procedimento é obter células respiratórias suficientes das escovas e manter esse material bem preservado para a análise de vídeo. O material restante pode ser usado para realizar microscopia eletrônica ou microscopia imunoflourescense para detectar possíveis defeitos estruturais em cílios ou para revelar defeitos e a síntese de proteínas ciliares.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
A análise por microscopia de vídeo de alta velocidade é uma ferramenta confiável e de custo eficaz para o diagnóstico da disquinesia ciliar primária. É fácil de realizar e aplicável em todas as faixas etárias, tornando-se essencial para centros que tratam doenças pulmonares graves.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Medicina Respiratória
- Técnicas Diagnósticas
Contexto
- A displasia ciliar primária é uma condição que afeta a função ciliar.
- A microscopia de vídeo de alta velocidade pode revelar tanto a função ciliar primária quanto a secundária.
- Essa técnica é particularmente útil para o diagnóstico de problemas respiratórios relacionados à disfunção ciliar.
- É importante que os clínicos tenham acesso a ferramentas diagnósticas confiáveis.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a eficácia da microscopia de vídeo de alta velocidade no diagnóstico da disquinesia ciliar primária.
- Avaliar a aplicabilidade desta técnica em diferentes grupos etários de pacientes.
- Destacar a importância desta ferramenta diagnóstica em ambientes clínicos.
Métodos Utilizados
- Análise por microscopia de vídeo de alta velocidade.
- Avaliação do movimento e da função ciliar.
- Comparação dos resultados entre diversas demografias de pacientes.
- Avaliação da função ciliar secundária em relação a infecções.
Resultados Principais
- A microscopia de vídeo de alta velocidade é eficaz para o diagnóstico da discinesia ciliar primária.
- A técnica é confiável quando realizada por pessoal experiente.
- Fornece informações sobre a função ciliar secundária.
- Aplicável a pacientes de todas as idades, aumentando sua utilidade na prática clínica.
Conclusões
- A microscopia de vídeo de alta velocidade deve ser uma ferramenta diagnóstica padrão na medicina respiratória.
- A sua facilidade de uso e confiabilidade tornam-na adequada para diagnósticos de primeira linha.
- A disponibilidade generalizada pode melhorar os resultados para pacientes com doenças pulmonares graves.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A análise por microscopia de vídeo de alta velocidade (HSVMA) oferece um método rápido e com custo-benefício para o diagnóstico inicial da displasia ciliar primária (PCD), um distúrbio genético raro que afeta a limpeza mucociliar. Ao permitir a visualização direta dos padrões de batimento ciliar em células epiteliais respiratórias vivas, a HSVMA auxilia na detecção precoce e reduz a dependência de técnicas mais exigentes em recursos, como a microscopia eletrônica de transmissão. Essa capacidade aumenta a produtividade diagnóstica em centros de pneumologia e de doenças raras, facilitando intervenções oportunas e reduzindo complicações pulmonares de longo prazo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a avaliação funcional da motilidade ciliar em células derivadas de pacientes, apoiando a validação de alvos na pesquisa de ciliopatias.
- Valor Operacional: Oferece uma leitura reprodutível para avaliar intervenções genéticas ou farmacológicas na função ciliar.
- Valor Preditivo: Distingue entre defeitos estruturais e funcionais, aumentando a confiança nas hipóteses mecanicistas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera dados quantitativos sobre a frequência e o formato da batida ciliar para padronização de ensaios.
- Valor Operacional: Apoia o desenvolvimento de protocolos padronizados para imagem de células vivas em modelos de doenças respiratórias.
- Escalabilidade: Permite análise de alto conteúdo da dinâmica ciliar em múltiplas amostras de pacientes ou variantes genéticas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta achados in vitro com fenótipos clínicos ao correlacionar os resultados da HSVMA com a gravidade da doença.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Identifica a recuperação funcional em modelos pré-clínicos por meio da restauração do batimento normal dos cílios.
- Alinhamento de Biomarcadores: Fornece leituras funcionais que complementam biomarcadores estruturais ou moleculares na DPC.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O HSVMA insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a avaliação pré-clínica, oferecendo um ensaio funcional para o desenvolvimento de terapêuticas ciliares.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses sobre genes envolvidos na montagem e motilidade ciliar, como o DNAH11.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas em tempo real adequadas para triagem de compostos em modelos de ciliopatias.
- Análises: Permite a comparação estatística de parâmetros do batimento ciliar entre diferentes condições, apoiando decisões baseadas em dados.
- Pesquisa Translacional: Conecta fenótipos celulares a desfechos clínicos, auxiliando na transição de pré-clínico para clínico.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliação da função ciliar em diversos modelos de doenças respiratórias.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao fornecer visualização direta da dinâmica ciliar em contextos celulares nativos.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de protocolos definidos de amostragem, preservação e aquisição de imagens.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avanço ou interrupção na validação de alvos ao confirmar a relevância funcional de alterações genéticas.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos de ciliopatias com base em evidências de recuperação funcional.
Considerações de Implementação
- Exige experiência na coleta de células, operação de microscopia e análise de vídeo para interpretação precisa.
- Depende de sistemas de microscopia de vídeo de alta velocidade com ótica de imersão a óleo e controle ambiental.
- Requer procedimentos padronizados para manipulação de amostras, a fim de prevenir contaminação ou degradação.
- A adaptação entre sistemas modelo pode exigir otimização das condições de cultivo e parâmetros de imagem.
- Limitado pela necessidade de amostras epiteliais viáveis e sem contaminação; a presença de glóbulos vermelhos ou muco pode obstruir a análise.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Collection and Transport of Respiratory Epithelial Cells
2:20
High-Speed Video Microscopy Analysis (HSVMA)
3:43
Results: Analysis of Ciliary Motion in Healthy Individual and Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) Patients
4:49
Conclusion
