Indução da Inflamação Intestinal por Transferência Adotiva de Células CD4+ T Transgênicas CBir1 T para camundongos imunodeficientes
16 de dezembro de 2021
Neste protocolo, é descrito um modelo de colite de transferência de células T específica de microbiota intestinal. As células T CD4+ são isoladas de camundongos transgênicos CBir1 TCR. Estes são específicos para um antígeno de microbiota intestinal imunodominante CBir1 flagellin, que é transferido para camundongos Rag1-/- receptores, levando à inflamação intestinal.
A doença inflamatória intestinal, ou DII, impõe uma considerável carga sanitária e financeira aos indivíduos e à sociedade. Este modelo de colite é útil para estudar os mecanismos do IBD e avaliar os tratamentos para o DII. Este modelo de colite de transferência adotiva específica cbir flagellin T do imunodominante fornece insights sobre como o antígeno de bactérias intestinais induz respostas de células T para induzir colite.
Depois de eutanásia do camundongo, faça uma incisão abdominal de aproximadamente um centímetro e puxe a pele para longe do tecido muscular abdominal. Em seguida, faça uma incisão de aproximadamente três centímetros no tecido muscular abdominal. Em seguida, remova o baço com tesouras estéreis e fórceps.
Coloque o baço em um prato de cultura contendo cinco mililitros de tampão de lavagem pré-resfriado. Triture o baço com a superfície áspera de duas lâminas de vidro estéreis. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 50 mililitros passando-a através de um filtro de célula de 100 micrômetros.
Enxágüe os slides de vidro e o prato de cultura com cinco mililitros de tampão de lavagem pré-resfriado, e transfira o tampão de lavagem para o tubo. Centrifugar a suspensão celular, descartar o supernascer e resuspengar as células com cinco mililitros de tampão de cloreto de amônio Tris pré-armado por baço. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.
Adicione 10 mililitros de tampão de lavagem pré-resfriado ao tubo. Em seguida, centrifugar a suspensão celular, descartar o supernaspecido e resuspensar as células com 10 mililitros de tampão de isolamento pré-resfriado. Para contar as células, misture 10 microliters cada uma de suspensão celular e azul Trypan completamente, e carregue 10 microliters em um slide.
Em seguida, insira o slide no contador automático de células para obter o número de célula viável. Centrifugar a suspensão restante da célula e descartar todos os supernascentes. Vórtice, as partículas magnéticas CD4 anti-rato, adicionam diretamente 50 microliters das partículas por 10 milhões de células, e se misturam com pelotas de células completamente.
Incubar a mistura por 30 minutos a quatro graus Celsius. Transfira a suspensão da partícula celular para um tubo de coleta estéril. Adicione 3,5 mililitros de tampão de isolamento pré-resfriado no tubo.
Coloque o tubo no ímã de separação celular por oito minutos em temperatura ambiente. Em seguida, aspire cuidadosamente o supernaspe com uma pipeta de transferência de três mililitros. Remova o tubo do ímã de separação celular.
Em seguida, resuspenco as células com 3,5 mililitros de tampão de isolamento pré-resfriado e coloque o tubo no ímã por quatro minutos em temperatura ambiente. Aspire cuidadosamente o supernatante com uma pipeta de três mililitros. Finalmente, resuspende as células em um mililitro de buffer FACS pré-resfriado.
Para transferir as células para os camundongos receptores, resuspenir as células T4-positivas do Cbir1 TCR para 5 milhões de células por mililitro em 1x PBS. Aqueça os ratos sob uma lâmpada de calor e contenha os ratos usando um conterrante de rato. Injete por via intravenosa 200 microlitadores da suspensão celular na veia traseira dos camundongos.
Depois de eutanásia do camundongo, faça uma incisão de pele média ventral de aproximadamente um centímetro. Puxe a pele para longe do tecido muscular abdominal. Então, faça uma incisão de três centímetros no tecido muscular abdominal.
Em seguida, identifique o coecum e remova todo o cólon com tesouras estéreis e fórceps. Molhe o cólon com PBS pré-resfriado em um prato de cultura. Incise o cólon longitudinalmente, e enxágue-o com PBS pré-resfriado.
Corte 1/3 do cólon longitudinalmente. Coloque a tira do cólon em uma toalha de papel com o lado lumenal voltado para cima. Faça a rolagem suíça usando um palito de dente.
Coloque o cólon suíço em um, e coloque o em formalina 10% tamponada por 24 horas. Desidratar e incorporar o cólon com um processador automatizado. Em seguida, corte seções de tecido de cinco micrômetros em um microtoma.
Monte o tecido em lâminas e realize a hematoxilina e a coloração de eosina. Os ratos de rag começaram a perder peso em torno de três semanas de transferência pós-célula, e seu peso atingiu cerca de 80 a 85% de seu peso original seis semanas de transferência pós-célula. Os camundongos receptores mostraram curta duração do cólon seis semanas após a transferência de células.
Os camundongos receptores demonstraram mais infiltração celular na lamina propria intestinal quatro semanas após a transferência celular. Eles mostraram perda de células de cálice e hiperplasia de células epiteliais intestinais cinco semanas após a transferência de células, bem como erosão mucosa e infiltração celular inflamatória na submucosa do cólon seis semanas pós-transferência celular. Os escores histopatológicos aumentaram substancialmente de quatro para seis semanas.
Simultaneamente, não houve inflamação em ratos de rag knockout recebendo PBS sozinho. Com este procedimento, os níveis de citocinas coloniais poderiam ser determinados por ELISA e qPCR.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um modelo de colite por transferência adotiva de células T específicas para antígenos da microbiota intestinal. Células T CD4+ de camundongos transgênicos para o TCR CBir1 são transferidas para camundongos Rag1-/-, induzindo inflamação intestinal.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Imunologia
- Gastroenterologia
Antecedentes
- A doença inflamatória intestinal (DII) representa desafios significativos para a saúde.
- Este modelo auxilia na compreensão dos mecanismos da DII.
- Ele avalia tratamentos potenciais para a DII.
- São fornecidas informações sobre as respostas das células T às bactérias intestinais.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um modelo para o estudo da DII.
- Explorar as respostas de linfócitos T a antígenos da microbiota intestinal.
- Avaliar intervenções terapêuticas para a DII.
Métodos Utilizados
- Isolamento de células T CD4+ de camundongos transgênicos.
- Transferência adotiva de células T para camundongos receptores.
- Indução de inflamação intestinal.
- Procedimentos cirúrgicos para análise de tecidos.
Resultados Principais
- Indução bem-sucedida de colite em camundongos receptores.
- Caracterização das respostas de linfócitos T a antígenos da microbiota.
- Informações sobre o papel das bactérias intestinais na DII.
- Potencial para avaliação de estratégias terapêuticas.
Conclusões
- O modelo fornece uma plataforma para pesquisas sobre DII.
- Ele aprimora a compreensão das respostas imunológicas a antígenos intestinais.
- Estudos futuros podem utilizar este modelo para avaliação de tratamentos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo de transferência de linfócitos T específicos ao antígeno permite a investigação mecanicista de respostas imunes induzidas pela microbiota intestinal na doença inflamatória intestinal, apoiando a validação de alvos e a redução de riscos na fase pré-clínica. Ao recapitular fenótipos de linfócitos T relevantes para o ser humano e a progressão histopatológica, fornece um sistema preditivo para avaliar terapêuticas imunomoduladoras. O modelo sustenta fluxos de trabalho de descoberta precoce voltados para a clarificação de vias e confiança no alvo na patogênese da DII.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar a flagelina CBir1 como antígeno da microbiota intestinal terapeuticamente relevante na patogênese da DII.
- Valor Operacional: Oferece um sistema definido, específico para antígenos, para isolar e validar mecanismos mediados por linfócitos T na inflamação intestinal.
- Valor Estratégico: Reforça a confiança no alvo ao associar antígenos microbianos específicos a respostas patogênicas de linfócitos T in vivo.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera parâmetros histopatológicos e celulares quantificáveis para avaliar os efeitos de compostos na inflamação colônica.
- Valor Operacional: Estabelece um fenótipo reprodutível de colite com perda de peso mensurável, encurtamento do cólon e infiltração imune para padronização de ensaios.
- Valor Estratégico: Permite a triagem de imunomoduladores utilizando desfechos clinicamente relevantes, como erosão da mucosa e perfis de citocinas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Reflete características histopatológicas-chave da DII humana, incluindo perda de células caliciformes, hiperplasia epitelial e inflamação submucosa.
- Valor Operacional: Permite o monitoramento longitudinal da gravidade da doença por meio do acompanhamento de peso, comprimento do cólon e pontuação histológica, para alinhamento farmacocinético/farmacodinâmico.
- Valor Estratégico: Facilita decisões de avanço ajustadas ao risco, modelando uma colite crônica mediada por linfócitos T, relevante para a fisiopatologia da doença de Crohn.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O modelo integra-se a fluxos de trabalho de descoberta a pré-clínicos ao fornecer uma conexão mecanicista da ativação de linfócitos T específicos ao antígeno até a patologia em nível tecidual, permitindo testes de hipóteses e otimização de compostos promissores na DII.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre antígenos da microbiota intestinal e a especificidade do receptor de células T no desenvolvimento da inflamação intestinal.
- Triagem: Fornece saídas padronizadas e quantitativas, incluindo escores de histopatologia e níveis de citocinas, para avaliação de compostos.
- Análises: Permite a medição dos níveis de citocinas no cólon por meio de ELISA e qPCR para correlacionar a ativação imunológica com a resposta terapêutica.
- Pesquisa Translacional: Conecta fenótipos de células T em camundongos a mecanismos relevantes da DII humana por meio de patologia imunológica específica para antígenos.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma reutilizável para testes iterativos de candidatos imunomoduladores direcionados a vias de células T impulsionadas por antígenos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da indução de colite mediada por linfócitos T específicos ao antígeno.
- Valor Operacional: Protocolos padronizados de indução e avaliação garantem reprodutibilidade entre laboratórios e estudos.
- Valor Estratégico: Reduz o risco biológico ao validar alvos em um modelo fisiologicamente relevante de inflamação induzida por antígeno.
- Impacto no Portfólio: Orienta decisões de avançar/não avançar ao associar a modulação do alvo a desfechos histopatológicos e clinicamente semelhantes.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em isolamento de linfócitos T, separação magnética e técnicas de transferência adotiva.
- Depende do acesso a camundongos transgênicos para o TCR CBir1 e receptores deficientes em Rag1 para fidelidade do modelo.
- Necessita de pontuação padronizada de histologia e processamento de tecidos para avaliação consistente da inflamação.
- Envolve procedimentos cirúrgicos e de perfusão que exigem técnica asséptica e precisão anatômica.
- Limita-se a estudos mecanicistas de respostas antígeno-específicas; não modela sozinho a complexidade do microbioma ou disfunção de barreira.
