Cultivo de Linfócitos em Microgravidade Simulada utilizando Sistema de Cultura de Células Rotativas

Esta técnica permite-nos estudar os efeitos da microgravidade simulada nas células imunitárias para nos ajudar a compreender melhor como aspectos do ambiente espacial afetam a fisiologia humana a nível molecular. Esta técnica é economicamente viável e é relativamente fácil de configurar e manter em comparação com o envio de cultura de células para o espaço ou outros métodos de submeter a cultura de células à microgravidade simulada na Terra. Recomenda-se ir lentamente enquanto enche os vasos, a fim de evitar transbordamento e derramamento.

Após a remoção inicial da bolha, certifique-se de que os recipientes estão completamente cheios usando as seringas. Isso minimizará as chances de formação de grandes bolhas ao longo do tratamento. Comece retirando os recipientes de cultura das embalagens plásticas.

Rotule cada recipiente na borda de acordo com o tipo de célula ou linha que está sendo usada, se está no controle ou tratamento e qualquer outra informação relevante. Estabilize o recipiente e abra a porta de enchimento cuidadosamente sem tocar no pino da tampa da porta de enchimento ou no O-ring. Coloque a tampa em uma almofada de etanol com o pino ou O-ring virado para cima enquanto o recipiente está cheio.

Não retire as tampas das portas da seringa. Carregar o recipiente com 10 mL do meio completo apropriado para a cultura celular usando uma pipeta sorológica estéril e colocar cuidadosamente a tampa no orifício de enchimento. Certifique-se de que as tampas da porta da seringa e a porta de enchimento estão bem fechadas.

Em seguida, coloque os vasos preenchidos em uma incubadora enquanto realiza as etapas subsequentes para preparar os vasos para cultura celular. Recupere os vasos preparados da incubadora. Para um balão de controle, carregar um frasco de cultura de suspensão T25 com 10 mL de cultura celular do estoque preparado acima.

Adicionar 10 mL de cultura de células-estoque a um tubo cônico separado de 15 mL, que será usado para carregar as seringas. Desparafuse as tampas das portas da seringa para removê-las do navio e garantir que as torneiras de estoque estejam na posição aberta. Estabilize o recipiente e abra a porta de enchimento cuidadosamente sem tocar no pino da tampa da porta de enchimento ou no O-ring.

Coloque a tampa em uma almofada de etanol com o pino ou O-ring virado para cima enquanto o recipiente está sendo preenchido. Certifique-se de que as torneiras estão na posição aberta. O recipiente pode ser esvaziado despejando o meio do recipiente em um recipiente de resíduos usando uma pipeta sorológica.

Alternativamente, aspirar o meio usando um vidro estéril passando pela pipeta conectada a um sistema de vácuo. Ao usar uma pipeta ou o sistema de vácuo, certifique-se de não tocar na membrana de oxigenação, pois isso pode danificá-la e tornar o vaso inutilizável. Feche bem o tubo cônico de 50 mL que contém a cultura de células-estoque preparada e inverta-o suavemente algumas vezes para misturar o conteúdo completamente.

Retirar 10 mL de cultura celular do tubo de 50 mL com uma pipeta sorológica estéril fresca. Pegue o navio e incline-o, de modo que a porta de enchimento esteja em direção ao topo. Em seguida, distribua cuidadosamente o estoque de cultura de células no recipiente através do porto de enchimento.

Encha o navio até a ponta do porto de enchimento, enquanto inclina o navio de volta para baixo para evitar derramamentos. Tenha cuidado para não tocar a membrana de oxigenação com a pipeta, pois ela é muito frágil. Uma vez que o navio esteja carregado, coloque cuidadosamente a tampa da porta de enchimento de volta sem tocar no O-ring.

Retire a primeira seringa de 3 mL de sua embalagem e bombeie-a algumas vezes para soltá-la. Em seguida, conecte a seringa a uma das portas da seringa, garantindo que a seringa esteja totalmente pressionada. Fechar bem o tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de cultura de alíquota e invertê-lo suavemente algumas vezes para misturar o conteúdo completamente.

Da mesma forma, retire a segunda seringa de 3 mL de sua embalagem e bombeie-a algumas vezes. Em seguida, cuidadosamente semi-submersa esta seringa na cultura celular a partir do tubo cônico de 15 mL e fazer alguma cultura. Minimize as bolhas de ar distribuindo totalmente a seringa de volta para o tubo e extraindo 3 mL de cultura.

Fixe a seringa cheia à porta da seringa restante e higienize cuidadosamente as seringas e a porta de enchimento com uma almofada de etanol. Não obter etanol na membrana de oxigenação. Repita o processo para os vasos restantes.

Se houver uma cultura celular ligeiramente insuficiente no tubo cônico de 50 mL para o último vaso, recupere a quantidade restante do tubo cônico de 15 mL usado para carregar as seringas. Certifique-se de que as torneiras das portas da seringa estão fechadas para limitar a migração de células e bolhas das seringas para os recipientes. Vire o vaso de cabeça para baixo e bata-o de lado algumas vezes para coletar as bolhas iniciais.

Vire rapidamente o vaso de volta para cima e, em seguida, em um leve ângulo voltado para longe, de modo que as bolhas flutuem todas para o lado ascendente do vaso. Manobrar as bolhas sob a porta com a seringa vazia e vê-las começar a entrar na porta. Abra as duas torneiras da porta da seringa.

Bata suavemente no recipiente para incentivar as bolhas a flutuar até a seringa vazia. Sugue lentamente as bolhas maiores com a seringa vazia enquanto deprime cuidadosamente a seringa cheia para manter a pressão no vaso, para que a membrana de oxigenação não estoure. Repita esse processo algumas vezes para garantir que todas as bolhas sejam removidas.

Quando as bolhas tiverem sido efetivamente removidas, feche as torneiras da porta da seringa. Mantenha as seringas ligadas durante o tratamento para permitir a remoção subsequente da bolha, garantindo que o volume em ambas as seringas seja aproximadamente igual. Limpe cuidadosamente a superfície da base giratória e do cabo de fita com 70% de etanol.

Verifique se o cabo de fita está conectado à fonte de alimentação. Coloque a base giratória na incubadora e prenda o cabo de fita à base. Coloque a fonte de alimentação perto, mas fora da incubadora.

Conecte o recipiente de tratamento SMG alinhando as roscas do vaso ao pino giratório e girando suavemente o pino giratório na base no sentido anti-horário. Certifique-se de que o recipiente está preso de forma segura. Mantenha a incubadora com aproximadamente 100% de umidade enchendo a bandeja de água com água de autoclave RO.

Ajuste a velocidade de rotação da incubadora para corresponder à velocidade de sedimentação das células, de modo que as células não caiam através do meio. No primeiro dia de instalação do tratamento, verifique a formação de bolhas a cada poucas horas, conforme descrito no manuscrito do texto. Remova as bolhas pelo menos uma vez por dia até o final da duração do tratamento desejado.

Uma vez decorrido o tempo de tratamento planejado, pare a rotação e desmonte o aparelho. Remova o recipiente de tratamento segurando suavemente o recipiente parado enquanto gira o pino giratório do dispositivo no sentido horário. Coloque o frasco de controle, o recipiente de controle e o recipiente tratado em um armário de segurança biológica estéril.

Pegue cada recipiente, excluindo o balão de controle, e vire-o, de modo que ele fique virado para baixo. Em seguida, golpeie-o suavemente para colocar todas as células em suspensão. Em seguida, vire o vaso de lado com a porta de enchimento em direção ao fundo e golpeie-o novamente para guiar as células em direção à porta de enchimento para uma aspiração eficiente.

Manuseie cada embarcação individualmente. Desparafuse as seringas das duas portas e distribua-as nos resíduos de risco biológico. Abra as torneiras nas portas da seringa.

Remova cuidadosamente a tampa da porta de enchimento e retire o conteúdo usando uma pipeta sorológica estéril de 10 mL, inclinando o recipiente à medida que é esvaziado. Distribuir o conteúdo de todos os grupos de controle e tratamento em tubos cônicos de 15 mL rotulados individualmente. Feche cada tubo e inverta-os suavemente algumas vezes para garantir que estão devidamente misturados.

Use o método preferido para determinar a concentração e a viabilidade da cultura celular resultante para se preparar para ensaios experimentais subsequentes. A viabilidade inicial da linhagem NK-92 e as densidades de assentos foram comparadas com a viabilidade final e concentrações finais resultantes. Após um tratamento de 72 horas com SMG, dois casos de desfechos negativos e positivos foram comparados.

Para comparação, a faixa de concentração ótima da linhagem celular NK-92 utilizada foi entre 0,3 a 1,2 milhão de células por mililitro, com um tempo de duplicação de cerca de dois a três dias. A proliferação no grupo de tratamento com SMG foi aproximadamente igual entre os grupos controle e tratamento. Estes parâmetros foram essenciais para o sucesso experimental a jusante e as células resultantes dos dois grupos controle tiveram desempenho semelhante em ensaios experimentais a jusante.

É crucial monitorar e contabilizar a formação de bolhas ao longo do tratamento, especialmente na cultura de células que está sendo submetida à microgravidade simulada. A formação de grandes bolhas pode causar ruptura na dinâmica dos fluidos dentro do vaso, e isso essencialmente anulará a condição de microgravidade simulada.