Name: Isolamento e Perfil das Células Endoteliais Mesentóricas Primárias Humanas no Nível Transcriptome (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprenda a isolar células endoteliais de artérias mesentéricas humanas para perfil transcriptômico em nível de célula única e espacial. Este método permite estudar interações celulares e alterações vasculares em diabetes e obesidade.

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Este trabalho foi apoiado pelas subvenções do NIH R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (para Z.B.C.); DP1DK126138 e DP1HD087990 (para S.Z.); uma bolsa da Fundação Ella Fitzgerald e um Projeto da Família Wanek (para Z.B.C.); e uma concessão de rede de sementes Atlas de Células Humanas (para Z.B.C. e S.Z.). A pesquisa relatada nesta publicação incluiu trabalhos realizados no Núcleo de Genômica Integrativa da Cidade da Esperança apoiado pelo Instituto Nacional de Câncer dos Institutos Nacionais de Saúde sob o prêmio número P30CA033572. Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Ismail Al-Abdullah e ao Dr. Meirigeng Qi da equipe de transplante de ilhotas da Cidade da Esperança pelo isolamento dos tecidos humanos, Dr. Dongqiang Yuan na Cidade da Esperança por sua ajuda com a análise de scRNA-seq, e o Dr. Marc Halushka na Divisão de Patologia Cardiovascular da Johns Hopkins University School of Medicine por suas informações valiosas sobre histologia vascular.

Estudos de tecido humano foram realizados em espécimes desidentídos obtidos do Centro de Recursos Celulares ilhotas do sul da Califórnia na Cidade da Esperança. Os consentimentos de pesquisa para o uso de tecidos humanos pós-morte foram obtidos dos parentes mais próximos dos doadores, e a aprovação ética para este estudo foi concedida pelo Conselho de Revisão Institucional da Cidade da Esperança (IRB nº 01046).
1. Dissociação física (tempo estimado: 1-2 h)
<ol><li>Coloque uma artéria fresca em um prato de 10 cm e lave com o soro fisiológico tamponado de fosfato de Dulbecco (D-PBS).</li>
	<li>Com fórceps estéreis e tesouras de dissecção, remova a gordura e os tecidos conjuntivos externos até que o vaso esteja limpo. Meça o comprimento do vaso com uma régua colocada fora do prato e tire fotos para registros (Figura 1A).</li>
	<li>Tampão de digestão apropriado pré-aquecido a 37 °C: para enzima de dissociação de células de uso de scRNA-seq; para ensaios de cultura celular usar 1-6 mg/mL de Colagenase D, 3 mg/mL de protease derivada de bactérias, 100 mM de HEPES, 120 mM de NaCl, 50 mM de KCl, 5 mM de glicose, com 1 mM de CaCl2 6,38 (pH 7.0, não requer ajuste) adicionado 5 min antes do uso.</li>
	<li>Pegue a artéria mesentérica (tipicamente com um diâmetro de 6-8 mm) e corte longitudinalmente com uma tesoura para abrir o lúmen do vaso verticalmente.</li>
	<li>Utilizando agulhas, conecte o recipiente à cera preta nos quatro cantos, deixando a intima exposta (Figura 1B).</li>
	<li>Adicione 1 mL de tampão de digestão pré-aquecido à intima. Pegue um bisturi estéril e raspe o lúmen do vaso suavemente duas vezes. NOTA: O objetivo deste procedimento é dissociar a camada intimal, que pode precisar de prática. É preciso ter força suficiente para remover o endotélio, mas não tanto que as camadas mais profundas do tecido também sejam removidas, o que reduzirá a representação da CE.</li>
	<li>Transfira o tampão de digestão para um tubo de 5 mL. Adicione 1 mL de tampão de digestão à intima e pipeta para cima e para baixo cuidadosamente para coletar as células restantes e adicionar ao tubo de 5 mL. Incubar células a 37 °C, girando a 150 rpm por 5 min.</li>
	<li>Adicione 2 mL de m199 médio (ou D-PBS se continuar com scRNA-seq) à suspensão celular para saciar a reação enzimática. Misture suavemente e centrífuga a 4 °C, 600 x g por 5 min.</li>
	<li>Remova o supernasce e armazene o supernatante separadamente para a cultura como um controle para observar se todas as células são capturadas na pelota na etapa 1.8. Resuspense a pelota celular em 1 mL de m199 médio (ou D-PBS se proceder com scRNA-seq).</li>
	<li>Avalie a viabilidade celular misturando 10 μL de azul trypan com 10 μL de estoque celular. Observe a morfologia celular e conte as células usando um hemótmetro. NOTA: Neste ponto, as células podem ser usadas para quantificação de proteínas ou RNA ou cultivadas in vitro usando mídia de cultura CE seguindo os protocolos padrão39. Alternativamente, eles podem ser preparados para sequenciamento como descrito na próxima seção.</li>
	<li>Para a cultura, cubra dois poços de uma placa de 6 poços, pipetando 500 μL de reagente de fixação em poços por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a remoção do reagente de fixação e lavagem com D-PBS estérei, dispense o estoque completo da célula em um poço, e o supernatante manteve como controle no segundo poço.</li>
</ol>2. Preparação para estudos de scRNA-seq (tempo estimado: 3-4 h)
<ol><li>Centrifugar o estoque celular da etapa 1.11 a 4 °C, 600 x g por 5 min. Remova o supernatante e resuspenque a pelota suavemente com uma pipeta P1000 e ponta de furo largo em 1 mL de 0,04% de albumina de soro bovino (BSA) em D-PBS. Misture bem para garantir uma suspensão de célula única.</li>
	<li>Passe a solução através de um filtro de 40 μm para remover detritos celulares. Se os detritos permanecerem, passe por um segundo filtro em 4 mL de 0,04% BSA em D-PBS.</li>
	<li>Centrifugar a 4 °C, 600 x g por 5 min. Remova o supernatante e resuspenque a pelota em 500 μL de 0,04% BSA em D-PBS usando uma pipeta P1000 com uma ponta de pipeta larga. Misture bem para garantir uma suspensão de célula única.</li>
	<li>Avalie a viabilidade celular misturando 10 μL de estoque celular com 10 μL de azul trypan. Usando um hemótmetro, observe a morfologia, determine se há uma suspensão unicelular sem aglomerados, verifique se há detritos teciduais e calcule o número de células vivas e mortas.</li>
	<li>Se as células estiverem agrupadas ou os detritos permanecerem, repita a lavagem com 0,04% de BSA em D-PBS ou passe novamente pelo coador de 40 μm. NOTA: Embora isso reduza o rendimento, é importante que as células existam em uma suspensão de célula única limpa para sequenciamento ideal.</li>
	<li>A suspensão unicelular pode ser usada para scRNA-seq.</li>
</ol>3. Perfil de transcriptome espacial (tempo estimado: 3-4 h)
<ol><li>Adicione isopentano (2-metilbutano) a um recipiente de metal e esfrie em nitrogênio líquido (LN2) ou gelo seco (LN2 é preferido, pois trará a temperatura mais baixa do que o gelo seco). Despeje o composto de temperatura de corte ideal (OUT) em poços de criomolds plásticos rotulados tomando cuidado para não criar bolhas e remover aquelas que aparecem. Deixe criomold em gelo seco para esfriar.</li>
	<li>Corte pelo menos duas seções coronais, 1 cm de comprimento do vaso. Usando fórceps longos (12"), submergir o tecido em isocento até congelar. Submergir rapidamente o tecido em OUTUBRO na orientação com o lúmen visível no centro. Tome cuidado para remover quaisquer bolhas, especialmente aquelas próximas ao tecido.</li>
	<li>Usando fórceps longos (12"), segure os criomoldes e segure-os no recipiente de metal. Embora a base dos moldes deva estar no líquido, não deve ser muito profunda para permitir que isopentane corra sobre o tecido. Observe o congelamento, o OCT ficará branco progressivamente do lado de fora em 1-2 min.</li>
	<li>Armazene essas seções em um recipiente lacrado a -80 °C por até 6 meses. NOTA: Mantenha amostras em gelo seco o tempo todo e não permita mais de um ciclo de congelamento. Este tecido pode ser usado para análise histológica, fluorescência de RNA/DNA na hibridização situ (FISH), ou transcrição espacial, que será descrita agora.</li>
	<li>Configure a temperatura criostat para -20 °C para a câmara e -10 °C para a cabeça do espécime. Equilibre as seções do vaso embutido oct, facas, pincéis e slides a -20 °C no criostat por aproximadamente 30 minutos. Durante o equilíbrio, limpe a máquina e todos os equipamentos que possam tocar as seções, incluindo a lâmina, com 70% de etanol seguido da solução de descontaminação RNase.</li>
	<li>Conecte a amostra distribuindo uma pequena quantidade de OCT no bloco criostat circular e colocando a amostra em cima antes de congelar. Coloque o bloco no centro da cabeça da amostra e enrosque o bloco no lugar usando uma alça preta alta à esquerda. Corte qualquer excesso de OCT em torno da nave.</li>
	<li>Ajuste a espessura de corte para 10 μm no criostat, corte aproximadamente 60 seções e coloque-as em um tubo pré-resfriado de 1,5 mL. Estas seções serão usadas para avaliar a qualidade do RNA. Após a remoção do criostat, adicione imediatamente 1 mL de reagente de extração de RNA e vórtice até que as seções sejam completamente dissolvidas.</li>
	<li>Adicione 200 μL de clorofórmio e misture até que a solução se assemelhe a um milkshake de morango. Centrifugar a 11.200 x g por 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Colete a fase aquosa (fase clara em cima de camadas brancas e rosas) e adicione 500 μL de isopropanol a ele. Misture invertendo os tubos mais de 10 vezes e coloque a -80 °C por pelo menos 20 min.</li>
	<li>Centrifugar a 11.200 x g por 10 min a 4 °C. Dissolva a pelota de RNA purificada em 5 μL de água sem RNase. Examine o número de integridade do RNA (RIN). NOTA: As amostras com RIN ≥ 7 são preferidas, mas rin ≥ 6 é aceitável. O número de seções teciduais e o volume de solução para a dissolução de RNA podem exigir otimização dependendo do sistema usado para garantir que a concentração final de RNA esteja dentro da faixa de função RIN para permitir uma avaliação rin precisa.</li>
	<li>Pratique seções de corte e colocação adequadamente dentro dos quadros fiduciários usando lâminas de vidro simples antes de prosseguir para a otimização de tecido comercialmente disponível ou slides de expressão genética. Isso pode ser conseguido desenhando quadrados de 6,5 mm x 6,5 mm em um escorregador de vidro simples, resfriando a -20 °C no criostat e colocando seções nesta área de captura.</li>
	<li>Corte seções de 10 μm com placa anti-rolo no lugar, gire e achate cuidadosamente tocando suavemente a seção através do OCT circundante.</li>
	<li>O uso de pincéis criostat sem RNase coloca a seção de tecido dentro do quadrado, usando apenas o OCT circundante. Coloque imediatamente um dedo (em luvas) na parte de trás da área de captura para derreter a seção para o slide.</li>
	<li>Uma vez que a seção tenha aderido, coloque o slide na criobar para permitir que a seção congele. Deve-se tomar cuidado para evitar a dobra tecidual e o excesso de tecido nas bordas demarcadas do quadro fiduciário. Se necessário, corte o tecido em metades ou trimestres ao longo do lúmen usando uma lâmina para garantir que a seção do vaso se encaixe dentro do quadro de 6,5 mm x 6,5 mm.</li>
	<li>Corte 10 seções de μm de tecido conforme 3,12-3,14 na otimização do tecido ou slides de expressão genética. Transfira o slide para um e-mail de slides colocado em gelo seco. Armazene slides a -80 °C por até 4 semanas antes de prosseguir com os protocolos espaciais publicados33,34.</li>
</ol>4. Análise de dados de sequenciamento (tempo estimado: até 1 semana, dependendo da familiaridade com o software)
NOTA: Apenas para análise transcriômica espacial, pule para a etapa 4.8. os dados scRNA-seq são processados usando o pipeline padronizado alinhado ao transcriptome de referência hg38 humano. O pacote R Seurat (v3.2.2) é usado para analisar dados scRNA-seq seguindo as diretrizespublicadas 40.
<ol><li>Filtro usando métricas de controle de qualidade bem estabelecidas: células raras com um número muito alto de genes (potencialmente multiplets) e células com altas porcentagens mitocondriais (células de baixa qualidade ou moribundos frequentemente apresentam contaminação mitocondrial) são removidas.</li>
	<li>Normalize os dados usando o "sctransform", um método para melhorar a integração da amostra em comparação com a normalização do log. Esses dados normalizados são usados para redução de dimensionalidade e agrupamento, enquanto os níveis de expressão normalizados por troncos são usados para análise com base nos níveis de expressão genética, como a classificação do tipo celular41.</li>
	<li>Selecione genes marcadores por tipo de célula, por exemplo, molécula de adesão celular endotelial plaquetária-1 (PECAM1) e fator von Willebrand (VWF) para CES, lucan (LUM) e procórgeno C-Endopeptidase Enhancer (PCOLCE) para fibroblastos, gene de translocação de células B 1 (BTG1) e CD52 para macrófagos, C1QA e C1QB para monócitos, e cadeia pesada de mísina 11 (MYH11) e transgelin (TAGLN) para células musculares lisas vasculares36.</li>
	<li>Calcule o nível médio de expressão entre células únicas entre cada par de marcadores, a fim de ter um único marcador com um nível médio de expressão associado a cada célula tipo42.</li>
	<li>Aplique um Modelo de Mistura Gaussiana (GMM) com dois componentes nos dados de expressão de cada marcador em células únicas, a fim de separar as células em dois conjuntos, ou seja, expressar o marcador e expressar o marcador humildemente. Desta forma, para cada marcador, cada célula é atribuída a um dos dois componentes42.</li>
	<li>Use enriquecimento estatístico para o conjunto de genes marcadores, um teste exato de Fisher, para atribuir um tipo de célula a cada aglomerado. Ao fazer isso, um conjunto de valores p são obtidos por cluster, cada um correspondendo a um tipo de célula. O tipo de célula com o menor valor p é atribuído a esse cluster.</li>
	<li>Processe os dados transcriômicos espaciais usando os dutos da Space Ranger resultando em descodificação espacial e geração de métricas de controle de qualidade (QC), incluindo leituras total alinhadas ao transcriptome humano hg38, o número médio de Identificador Molecular Único (UMI) ou genes por ponto35. NOTA: O pacote R Seurat (v3.2.2) é usado para analisar os dados processados pela Space Ranger seguindo as diretrizespublicadas 40.</li>
	<li>Normalize os dados utilizando o "sctransform", método demonstrado para melhorar a análise a jusante em comparação com a normalização do tronco dada a heterogeneidade do tecido e a variância muito alta na contagem entre as manchas.</li>
</ol>

S.Z. é um fundador e membro do conselho da Genemo, Inc.

O fluxo de trabalho apresentado detalha um conjunto de técnicas para traçar CEs de uma única peça de artéria humana com resolução unicelular e espacial. Existem várias etapas críticas e fatores limitantes no protocolo. Uma chave para o perfil do transcriptome é o frescor do tecido e da integridade do RNA. É importante manter os tecidos no gelo o máximo possível antes do processamento para minimizar a degradação do RNA. Normalmente, os tecidos pós-morte são processados entre 8-14 h após a hora da morte. No entanto, recome...

Forrando o lúmen dos vasos sanguíneos, as células endoteliais (CE) são reguladores cruciais do tom vascular e da perfusão tecidual. Os CES são notáveis em sua capacidade de reagir ao ambiente extracelular e adaptar-se às mudanças na dinâmica e composição do fluxo sanguíneo. Essas respostas dinâmicas são mediadas através de uma rede de eventos de sinalização intracelular, incluindo modulações transcricionais e pós-transcricionais com resolução spatio-temporal. A desregulação dessas respostas está implicada em muitas patologias, incluindo, mas não se limitando a doenças cardiovasculares, diabetes e câncer 1,2.
Uma grande proporção de estudos faz uso de linhas celulares ou modelos animais para interrogar o transcriptome ce. A primeira é uma ferramenta útil, dada a relativa facilidade de uso e a barata. No entanto, a cultura serial pode introduzir alterações fenotípicas nas CE, como características fibroblásticas e falta de polarização, desconectando-as de seu estado in vivo 3. As células primárias, por exemplo, a veia umbilical humana EC (HUVEC) têm sido uma escolha popular desde a década de 1980, mas são derivadas de um leito vascular de desenvolvimento que não existe em adultos, portanto improvável de representar plenamente CEs maduros. Os animais, especialmente os modelos de camundongos, representam melhor o ambiente fisiológico ou fisioterápico das CE e permitem o interrogatório de transcritos como resultado da perturbação genética. As ECs de Murine podem ser isoladas de vários tecidos, incluindo os tecidos de aorta, pulmões e adiposos usando procedimentos baseados em enzimas 4,5,6,7. No entanto, as células isoladas não podem ser usadas para múltiplas passagens, a menos que transformadas6 e muitas vezes são limitadas em número, o que requer a junção de vários animais 5,8,9.
O advento de novas tecnologias explorando a arquitetura de embarcações a nível transcriptômico, particularmente com resolução unicelular, possibilitou uma nova era de biologia endotelial ao revelar novas funções e propriedades das CE 5,10,11,12,13,14. Um rico recurso construído pelos investigadores de Tabula Muris coletou perfis transcriômicos unicelulares de 100.000 células, incluindo CEs em 20 diferentes órgãos murinos15, que revelaram genes de marcadores EC comuns e assinaturas transcriômicas únicas com diferenças interetos intra-tecidos 5,13. No entanto, há diferenças claras entre camundongos e humanos no genoma, epigenome e transcriptome, especialmente nas regiões não codificadoras 16,17,18. Essas desvantagens supracitadas enfatizam a importância da análise das CES utilizando amostras humanas para obter um perfil fiel das CE em seu estado natal em saúde e doença.
A maioria dos métodos de isolamento da CE depende da dissociação física através da homogeneização, corte fino e picar o tecido antes da incubação com enzimas proteolíticas para tempos diferentes. As enzimas e condições também variam consideravelmente entre os tipos de tecido, da trippsina à colagem, utilizadas sozinhas ou em combinação 19,20,21. Mais enriquecimento ou purificação à base de anticorpos são frequentemente incluídos para aumentar a pureza das CE. Tipicamente, anticorpos contra marcadores de membrana CE, por exemplo, CD144 e CD31 são conjugados a contas magnéticas e adicionados à suspensão celular22,23. Tal estratégia pode ser geralmente adaptada para o isolamento da CE a partir de múltiplos tecidos humanos e de camundongos, incluindo as técnicas introduzidas neste protocolo.
Em seu estado natal, as CE interagem com vários tipos de células e podem existir em nichos vasculares onde a proximidade celular é crucial para a função. Embora estudos de sequenciamento de RNA unicelular e uni nuclear (scRNA e snRNA-seq) tenham sido primordiais para os recentes avanços na descrição da heterogeneidade ce, o processo de dissociação interrompe o contexto tecidual e o contato celular, que também são importantes para entender a biologia da CE. Desenvolvido em 2012 e nomeado Método do Ano em 202024, o perfil de transcriptome espacial tem sido utilizado para traçar o perfil da expressão genética global, mantendo as características espaciais em vários tecidos, incluindo cérebro25, tumor26 e tecido adiposo27. As tecnologias podem ser direcionadas, utilizando sondas especializadas específicas para sequências específicas de RNA ligadas a reagentes de afinidade ou tags fluorescentes, detectando genes selecionados na resolução subcelular 28,29,30,31. Eles também podem ser nãoalvos 32,33, tipicamente usando oligonucleotídeos espacialmente barrados para capturar RNA, que juntos são convertidos em cDNA para posterior preparação da biblioteca seq e, portanto, tem a vantagem de deduzir a expressão genética de tecido inteiro de forma imparcial. No entanto, a resolução espacial não é atualmente alcançada em um único nível celular com tecnologias comercialmente disponíveis. Isso pode ser superado até certo ponto com a integração de dados com dados scRNA-seq, permitindo, em última análise, o mapeamento de transcriptome unicelular em um contexto complexo de tecido, mantendo suas informações espaciais originais34.
Aqui, um fluxo de trabalho é descrito para traçar o perfil de transcriptome CE utilizando artéria mesentérica superior humana, uma artéria periférica que tem sido usada para estudar vasodilatação, remodelação vascular, estresse oxidativo e inflamação 35,36,37. Duas técnicas são descritas: 1) para isolar e enriquecer as CEs da intimação dos vasos sanguíneos que combinam dissociação mecânica e digestão enzimática adequada para sequenciamento de transcrição unicelular ou cultura in vitro subsequente; 2) preparar seções arteriais para o perfil do transcriptome espacial (Figura 1). Essas duas técnicas podem ser realizadas de forma independente ou complementar para traçar CEs e suas células circundantes. Além disso, este fluxo de trabalho pode ser adaptado para uso em qualquer artéria média ou grande.

<table><tbody><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>prato de 10 cm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>23G agulhas</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>2-metilbutano</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC327270010</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; filtro Fisher</td><td></td><td>14100150</td><td></td></tr><tr><td>4200 Sistema TapeStation</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2991BA</td><td></td></tr><tr><td>tubo de 5 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>14282300</td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 poços</td><td>Greiner Bio-One</td><td>07-000-208</td><td></td></tr><tr><td>Fator de fixação</td><td>Aplicações celulares</td><td>123-500</td><td>Reagente de fixação no protocolo</td></tr><tr><td>Cera preta</td><td></td><td></td><td>Qualquer cera preta comercial pode ser usada</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino tratada com choque térmico</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>BP510</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher</td><td>C607</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Escovas de</td> criostato <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica D-Glucose</td><td></td><td>Fisher D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Fisher</td><td></td><td>MT25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>Protease derivada de bactérias no protocolo</td></tr><tr><td>Bisturis de segurança descartáveis</td><td>Myco Instrumentação</td><td>6008TR-10</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Fisher</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Fisher</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375-100g</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de amostra D1000 de alta sensibilidade</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5603</td><td></td></tr><tr><td>Fita de tela D1000 de alta sensibilidade</td><td>Incubadora</td><td></td> Agilent Technologies 5067-5584 <td></td></tr><tr><td></td> Mantida em 37 &deg;<td></td><td></td><td> C 5% CO2</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher</td><td>BP26324</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogênio</td><td></td><td></td><td></td>líquido</tr><tr><td>Meio 199</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2520-10X</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de lata</td><td></td><td></td><td></td>de metal</tr><tr><td></td><td>Leica</td><td></td><td>Para avaliar a morfologia celular</td></tr><tr><td>Meio de cultura endotelial microvascular</td><td>Aplicações celulares</td><td>111-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 44/44R Agitador orbital</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Composto de temperatura de corte ideal</td><td>Fisher</td><td>4585</td><td></td></tr><tr><td>Criomoldes de plástico</td><td></td><td></td> Fita de tela de RNA 22363553 <td></td>Fisher</tr><tr><td></td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>Tela de RNA Fita de amostra de buffer</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5577</td><td></td></tr><tr><td>RNase ZAP</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de RNase</td><td>Takara</td><td>RR036B</td><td>Água sem RNase (2) no kit</td></tr><tr><td>Pinça estéril de 12" de comprimento</td><td>F.S.T</td><td>91100-16</td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina estéril</td><td>F.S.T</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura fina estéril</td><td>F.S.T</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost PLUS Gold Slides</td><td>Fisher</td><td>1518848</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol reagente</td><td>Fisher</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Corning</td><td>MT25900CI</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzima (1X) vermelho fenol Thermo</td><td>Fisher</td><td>12605010</td><td>Enzima de dissociação celular no protocol</td></tr><tr><td>Visium Accessory Kit</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000215</td><td></td></tr><tr><td>Visium Gateway Package, 2rxns</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000316</td><td></td></tr><tr><td>Visium Spatial Gene Expression Slide & Kit de reagentes, 4 rxns</td><td>10X Genomics</td><td>PN-1000184</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e perfil das células endoteliais mesentóricas primárias humanas no nível transcriptome

Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level

As células endoteliais (CE) são cruciais para a função vascular e do corpo inteiro através de sua resposta dinâmica às pistas ambientais. Elucidar o transcritor e o epigenome das CE é primordial para entender seus papéis no desenvolvimento, saúde e doença, mas é limitado na disponibilidade de células primárias isoladas. As tecnologias recentes permitiram o perfil de alto rendimento do transcritor e do epigenome ce, levando à identificação de subpopulações de células EC até então desconhecidas e trajetórias de desenvolvimento. Embora as culturas CE sejam uma ferramenta útil na exploração da função e disfunção da CE, as condições de cultura e múltiplas passagens podem introduzir variáveis externas que alteram as propriedades da CE nativa, incluindo morfologia, estado epigenético e programa de expressão genética. Para superar essa limitação, o presente artigo demonstra um método de isolar as CEs primárias humanas das artérias mesentéricas doadoras com o objetivo de capturar seu estado natal. Os CES na camada intimal são dissociados mecanicamente e bioquimicamente com o uso de enzimas particulares. As células resultantes podem ser usadas diretamente para RNA em massa ou sequenciamento de RNA de células únicas ou banhadas para cultura. Além disso, um fluxo de trabalho é descrito para a preparação do tecido arterial humano para transcrição espacial, especificamente para uma plataforma comercialmente disponível, embora este método também seja adequado para outras técnicas de perfil de transcriptome espacial. Essa metodologia pode ser aplicada a diferentes vasos coletados de uma variedade de doadores em estados de saúde ou doenças para obter insights sobre a regulação transcricional e epigenética da CE, um aspecto crucial da biologia celular endotelial.

A análise de CEs da artéria mesentérica usando uma combinação de dissociação mecânica e enzimática ou criopreservação para uso em vários ensaios a jusante é retratada aqui (Figura 1). As CE podem ser perfiladas nas artérias mesentéricas usando as seguintes etapas: A) dissociação mecânica da intima juntamente com digestão de colagem às células culturais; B) geração de suspensão unicelular para scRNA-seq; ou C) seções transversais da artéria podem ser incorporadas em OCT para serem criosection...

O protocolo descreve o isolamento, a cultura e o perfil das células endoteliais da artéria mesentérica humana. Além disso, é fornecido um método para preparar a artéria humana para transcrição espacial. Os ensaios proteômicos, transcriptomics e funcionais podem ser realizados em células isoladas. Este protocolo pode ser reaproveitado para qualquer artéria de médio ou grande porte.

Isolamento e Perfil das Células Endoteliais Mesentóricas Primárias Humanas no Nível Transcriptome

Endothelial cells (ECs) are crucial for vascular and whole-body function through their dynamic response to environmental cues. Elucidating the ...

Caracterizar a expressão genética no nível transcriptômico é fundamental para entender a função celular na saúde e na doença. Nosso método se concentra na captura de células endoteliais, a camada crucial da parede vascular, das artérias menestéricas dos doadores humanos para perfil transcrito com uma resolução unicelular e espacial. Há uma população enriquecida de células endoteliais de um vaso sem um passo de classificação, o que pode causar perda celular.Além disso, existem outros tipos de células que permitem a investigação de interações célula-células no contexto tecidual. Usamos essa técnica para investigar as alterações arteriais no diabetes e na obesidade. Dependendo da disponibilidade do vaso, essas técnicas também podem ser reaproveitadas para explorar a biologia em outras vasculaturas e outras doenças.Se for a primeira vez, dois passos-chave requerem mais prática. Um, raspando, embora a força adequada deve ser exercida para remover células integrais sem separar camadas mais profundas. E dois, seção criostat.Certifique-se de que as seções são frias, planas e estão dentro dos limites do slide especializado. Demonstrando o procedimento estarão Yingjun Luo e Xiaofang Tang, do

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Medicine

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Nós apresentamos uma preparação para a visualização e manipulação de sinalização do cálcio em nativa, endotélio microvascular intacta. Tubos endoteliais recém isolado das artérias de resistência do mouse fornecendo músculo esquelético manter vivo na morfologia e sinalização dinâmica dentro e entre as células vizinhas. Tubos endoteliais pode ser preparado a partir de microvasos de outros tecidos e órgãos.

Isolamento de tubos endoteliais microvasculares de Artérias Rato Resistência

As células endoteliais vasculares desempenham um papel significativo em muitos distúrbios cardiovasculares importantes. Este artigo descreve um método simples para isolar e expandir as células endoteliais da aorta do camundongo sem o uso de nenhum equipamento especial. Nosso protocolo fornece um meio eficaz de identificar mecanismos na fisiopatologia das células endoteliais.

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

Este protocolo está preparado para compartilhar nosso método de isolamento de células endoteliais coronárias de camundongos para fins de imagem ou para conduzir experimentos biológicos moleculares.

Isolamento de células de camundongo Coronária endoteliais

Células endoteliais de tumor são importantes determinantes do microambiente do tumor e o curso da doença. Aqui, um protocolo para o isolamento de células endoteliais puras e viáveis de carcinoma colorectal humana e cólon normal para ser usado em pesquisa de teste e patogênese da droga é descrito.

Isolamento de células endoteliais humanas do cólon Normal e Carcinoma colorrectal - um protocolo melhorado

A diferenciação dos adipócitos brancos e bege de tecido adiposo vascular progenitores tem potencial para melhoria metabólica em obesidade. Descrevemos os protocolos para um CD34 + CD31 + isolamento de células endoteliais de gordura humana e uma subsequente em vitro expansão e diferenciação em adipócitos brancos e bege. Diversas aplicações a jusante são discutidas.

Isolamento, expansão e indução de Adipogenic de CD34 + CD31 + células endoteliais de tecido adiposo humano de Omental e subcutâneo

Células endoteliais microvasculares dos músculos esqueléticos (MMEC) forma a parede interna dos capilares musculares e regular a ambos, troca de fluidos/moléculas e migração de células (imunes) entre o tecido muscular e sangue. Isolamento de MMEC murino primário, conforme descrito aqui, permite investigações in vitro abrangentes da unidade"myovascular".

Isolamento de células endoteliais Microvascular do principal músculo esquelético murino

Apresentamos um protocolo simples para o isolamento de células mononucleares de sangue periférico de sangue inteiro obtidos de pacientes diagnosticados com Síndrome de Sézary, seguido pela seleção de células T CD4+, sua estimulação com phorbol12-myristate13-acetato e ionóforo A23187, e preparação de RNA para perfil transcriômico.

Isolando células mononucleares de sangue periféricos humanos e células T CD4+ de pacientes com síndrome de Sézary para perfil transcriômico

Apresentamos um método para isolar células e núcleos endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos expostas a condições de fluxo estáveis ou perturbadas para a realização de experimentos ômicos unicelulares.

Isolamento de células endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos para experimentos multi-ômicos unicelulares

Este protocolo descreve um método para o isolamento de células endoteliais da retina pós-natais murinas otimizado para o rendimento, pureza e viabilidade celular. Essas células são adequadas para abordagens de sequenciamento de próxima geração.

Isolamento de células endoteliais da retina murinas para sequenciamento de próxima geração

Este protocolo detalha um método para a dissecção de depósitos adiposos de camundongos e o isolamento e digestão das respectivas artérias para liberar e, em seguida, identificar a população de células endoteliais. Células recém-isoladas usadas em aplicações a jusante avançarão na compreensão da biologia celular vascular e dos mecanismos de disfunção vascular.

Isolamento e Identificação de Células Endoteliais Vasculares de Depósitos Adiposos Distintos para Aplicações a Jusante

Este protocolo descreve o isolamento de células endoteliais de camundongos de todo o pâncreas.

Isolamento de células endoteliais pancreáticas de camundongo

Aprenda a isolar células endoteliais de artérias mesentéricas humanas para perfil transcriptômico em nível de célula única e espacial. Este método permite estudar interações celulares e alterações vasculares em diabetes e obesidade.

Isolamento e Perfil das Células Endoteliais Mesentóricas Primárias Humanas no Nível Transcriptome

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