Name: Diferenciação Robusta de iPSCs Humanas em uma População Pura de Adipócitos para Estudo de Distúrbios Associados a Adpócitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Aprenda a diferenciar iPSCs humanas em adipócitos maduros usando ácido retinóico e coloração com Nile red. Este método gera populações puras para estudos de distúrbios metabólicos e obesidade.

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Este trabalho foi financiado por uma bolsa do Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi foi apoiada pela bolsa GSRA do Qatar National Research Fund (QNRF).

O estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa institucional apropriado e realizado de acordo com os padrões éticos estabelecidos na Declaração de Helsinque de 1964 e suas alterações posteriores ou padrões éticos comparáveis. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do HMC (nº 16260/16) e QBRI (nº 2016-003). Este trabalho também é otimizado para hESCs como H1 e H9. Amostras de sangue foram obtidas de indivíduos sadios com pleno consentimento informado. As iPSCs são geradas a partir de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de indivíduos saudáveis.
1. Cultura e manutenção de iPSCs
<ol><li>Preparar placas revestidas com matriz de membrana basal reconstituindo a matriz de revestimento em knockout-DMEM na proporção de 1:80 e armazenar a 4 °C.</li>
	<li>Preparar meios de cultura iPSCs adicionando 50 mL de 10x meio de suplemento de células-tronco a 500 mL de meio basal de células-tronco, juntamente com 5 mL de 100x penicilina-estreptomicina (P/S) e armazenar a 4 °C para uso a curto prazo ou a -20 °C para uso a longo prazo.</li>
	<li>Forre as placas com matriz de revestimento - 1 mL para uma placa de 6 poços, 500 μL para uma placa de 12 poços, 250 μL para uma placa de 24 poços - e incube a placa a 37 °C por 1-2 h.</li>
	<li>Remova uma alíquota de meios de cultura iPSCs e pré-aqueça à temperatura ambiente antes de usar.</li>
	<li>Descongelar um frasco para injetáveis de iPSCs (CTEs ou iPSCs) em banho-maria a 37 °C e transferir para um tubo cônico de 15 mL contendo 2-3 mL de meio de cultura.</li>
	<li>Centrifugar o tubo a 120 x g durante 4 minutos à temperatura ambiente (RT-23 °C).</li>
	<li>Retirar o sobrenadante e adicionar 2 mL de meio de cultura fresco suplementado com 10 μM de inibidor de ROCK (Y-27632). Plaquear as células em um poço de uma placa de 6 poços revestida com matriz e colocar a placa a 37 °C.</li>
	<li>Após 24 h, retirar o meio e substituí-lo por meios de cultura frescos.</li>
	<li>Troque o meio todos os dias até que as células atinjam 80%-90% de confluência.</li>
	<li>Ao atingir a confluência, passe as células seguindo os passos descritos abaixo.<ol><li>Retire o meio e lave as células com solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco.</li>
		<li>Adicionar reagente de dissociação iPSCs (ver Tabela de Materiais)-500 μL para um poço de uma placa de 6 poços, 250 μL para um poço de uma placa de 24 poços - e incubar por 1 min a 37 °C.</li>
		<li>Remover o reagente de dissociação e incubar as células secas por 1 min a 37 °C.</li>
		<li>Coletar as células usando meio de cultura - 1 mL para um poço de uma placa de 6 poços e 250 μL para um poço de uma placa de 24 poços - em um tubo cônico de 15 mL e centrífuga a 120 x g por 4 min.</li>
		<li>Ressuspender as células em meio de cultura - 2 mL para um poço de uma placa de 6 poços e 500 μL para um poço de uma placa de 24 poços suplementado com inibidor de ROCK de 10 μM e plaqueá-las em placas revestidas com matriz fresca a 40% de confluência.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Diferenciação de iPSC em CTMs
<ol><li>Preparar meios de diferenciação de CTM adicionando 15% de soro fetal bovino (SFB) e 1% P/S a DMEM + piruvato de baixa glicose e armazenar a 4 °C.</li>
	<li>Ao atingir 80% de confluência, utilizar iPSCs para formação do corpo embrionário (BE) seguindo os passos descritos abaixo.<ol><li>Lavar as células com DPBS e incubá-las com meio de dissociação/EDTA-500 μL para um poço de uma placa de 6 poços, 250 μL para um poço de uma placa de 24 poços.</li>
		<li>Incubar a 37 °C durante 1 min, aspirar o reagente de dissociação e manter as células a 37 °C durante mais 1 min. Para iniciar a diferenciação MSC, ~10-12 x 106 células são necessárias.</li>
		<li>Coletar as células em um tubo cônico de 15 mL usando meios de cultura. Certifique-se de ser muito suave durante a coleta para evitar que as células fiquem únicas e permitir a formação de EB. Centrifugar as células a 120 x g durante 4 min.</li>
		<li>Ressuspender as células em 3 mL de meio de diferenciação de CTM contendo 10 μM de inibidor de ROCK.</li>
		<li>Misture e distribua 0,5 mL/poço em uma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços. NOTA: O uso de placa de fixação ultrabaixa incentivaria a agregação celular em EBs em vez de sua fixação na superfície.</li>
		<li>Colocar a placa na incubadora a 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Após 24 h, induzir as EBs obtidas com tratamento com ácido retinóico (AR) seguindo os passos descritos abaixo.<ol><li>Adicionar 10 μM de RA a 3 mL de meio de diferenciação de CTM. Coletar as EBs em um tubo de 15 mL e deixá-las descansar por 15 min.</li>
		<li>Remover o sobrenadante das EBs e adicionar meio de diferenciação MSC suplementado com 10 μM RA.</li>
		<li>Ressuspenda suavemente e distribua 0,5 mL/poço na mesma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços.</li>
		<li>Colocar a placa na incubadora a 37 °C. Não perturbe os EBs pelas próximas 48 h.</li>
		<li>Após 48 h, coletar as EBs em um tubo de 15 mL e deixá-las descansar por 15 min.</li>
		<li>Remover o sobrenadante das EBs e adicionar meios de diferenciação MSC suplementados com 0,1 μM de AR.</li>
		<li>Ressuspenda suavemente e distribua 0,5 mL/poço na mesma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços.</li>
		<li>Colocar a placa na incubadora a 37 °C. Não perturbe os EBs pelas próximas 48 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Remova o RA adicionado às células seguindo as etapas descritas abaixo.<ol><li>Após 48 h do último tratamento da AR, coletar os EBs e deixá-los descansar por 15 min.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e adicionar DMEM meio de baixa glicose sem citocinas.</li>
		<li>Ressuspenda suavemente e distribua 0,5 mL/poço em uma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços. Colocar a placa na incubadora a 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaquete os EBs derivados de iPSCs seguindo as etapas descritas abaixo.<ol><li>Após 48 h da etapa anterior (etapa 2.4), coletar as EBs em um tubo de 15 mL e deixá-las descansar por 15 min.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e ressuspender em 2 mL de meio de diferenciação de CTM fresco.</li>
		<li>Transfira para dois poços de uma placa de 6 poços revestida com matriz de membrana basal.</li>
		<li>Troque a mídia a cada dois dias por mais 5 dias.</li>
		<li>Após 5 dias, remover o meio gasto e substituí-lo por meio de diferenciação de CTM fresco contendo 2,5 ng/mL de fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF).</li>
	</ol></li>
	<li>Passe pelos EBs plaqueados quando atingirem 80%-90% de confluência, seguindo os passos descritos abaixo.<ol><li>Lave as células com DPBS, adicione tripsina-EDTA-500 μL para um poço de uma placa de 6 poços e incube as células a 37 °C por 3 min.</li>
		<li>Coletar as células usando meios de diferenciação de CTM em um tubo cônico de 15 mL e girar a 750 x g por 4 min.</li>
		<li>Ressuspender em meio de diferenciação de CTM com 2,5 ng/mL de bFGF e plaquear as células em placas revestidas com matriz de membrana basal na proporção de 1:3.</li>
		<li>Repita a passagem quando as células atingirem 70%-80% de confluência. Espera-se que ganhe 3-6 milhões de células por 2-3 passagens.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análise por citometria de fluxo de CTMs derivadas de iPSCs
NOTA: Ao passar por 2-3 passagens, as células devem ser acessadas para a eficiência da diferenciação das CTM. A diferenciação será considerada bem-sucedida se as células expressarem marcadores de diferenciação CTM - CD44, CD73, CD90 e CD105 com mais de 90% de eficiência, e não expressarem níveis elevados de marcadores hematopoéticos - CD14, CD19, CD34 e CD45. A eficiência desses marcadores pode ser acessada seguindo os passos abaixo.
<ol><li>Passe as células usando as etapas descritas acima (passo 2.6) e obtenha 1 x 105 células em um poço de uma placa de 96 poços com fundo em v.</li>
	<li>Centrifugar a placa a 375 x g durante 4 min a 4 °C.</li>
	<li>Ressuspender 1 x 105 células em 100 μL de DPBS frio com 1 μL de anticorpo conjugado (Ab) (ver Tabela de Materiais) e incubar a 4 °C por 30-40 min, evitando a exposição à luz.</li>
	<li>Ressuspender mais 1 x 105 células em 100 μL de DPBS frio com o respectivo controle isotípico do Ab conjugado na concentração de 1:100 ) e incubar a 4 °C por 30-40 min evitando a exposição à luz.</li>
	<li>Após a incubação, centrifugar a placa a 375 x g durante 4 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante agitando a placa sobre a pia.</li>
	<li>Ressuspender as células em 100 μL de DPBS frio.</li>
	<li>Centrifugar as células a 375 x g durante 4 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células em 200 μL de DPBS fria e coletar em tubos de microcentrífuga escuros e frios de 1,5 mL e mantê-los no gelo até serem analisados por classificação celular ativada por fluorescência (FACS).</li>
	<li>Para a análise FACS, distribua as células usando dispersão lateral (SSC-A) versus dispersão direta (FSC-A) para excluir os detritos. Além disso, distribua as células fechadas usando altura espalhada para frente (FSC-H) versus área dispersa para frente (FSC-A) para distinguir singlets de duplos da população de células vivas. NOTA: As células foram fechadas em relação ao deslocamento do controle isotípico para cada marcador, e um mínimo de 10.000 eventos fechados de cada amostra corada foi usado para análise.</li>
</ol>4. Diferenciação das CTMs em adipócitos
<ol><li>Preparar o meio basal de diferenciação de adipócitos adicionando 10% de reposição sérica knockout (KOSR), 1% de glutamina, 1% P/S, 4,5 ng/μL de glicose ao meio essencial mínimo (MEM)-alfa e armazenar a 4 °C.</li>
	<li>Permitir que as CTMs atinjam acima de 90% de confluência. Continue cultivando-os por mais 48 h para permitir que eles passem por um período de parada de crescimento.</li>
	<li>Preparar o meio de diferenciação completa dos adipócitos adicionando 100 μg/mL de 3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX), 1 μM de dexametasona, 0,2 U/mL de insulina, 100 μM de indometacina e 10 μM de rosiglitazona ao meio basal.</li>
	<li>Remova o meio de diferenciação MSC e lave as células usando DPBS.</li>
	<li>Adicionar o meio completo de diferenciação de adipócitos - 2 mL para um poço de uma placa de 6 poços e 1 mL para um poço de uma placa de 12 poços - e incubar as células a 37 °C. Troque a mídia de diferenciação completa a cada dois dias por 14 dias.</li>
</ol>5. Avaliação da eficiência de diferenciação de adipócitos
<ol><li>No 14º dia de diferenciação, verificar a eficiência da diferenciação pela coloração das células para marcadores de maturação de adipócitos, FABP4 e adiponectina.</li>
	<li>Retire o meio e lave as células com DPBS.</li>
	<li>Fixar as células com paraformaldeído (PFA) a 4% - 200 μL em um poço de placa de 24 poços - e incubar à temperatura ambiente por 15 min.</li>
	<li>Eliminar o PFA e lavar com solução salina tris-tamponada com tween 0,5% (TBST) e colocá-lo em um agitador à temperatura ambiente por 15 min. Repita o processo duas vezes.</li>
	<li>Permeabilizar as células fixas com solução salina tamponada com fosfato com Triton X-100 a 0,5% (PBST) e colocá-las em um agitador à temperatura ambiente por 15-20 min.</li>
	<li>Descarte o PBST e adicione o tampão de bloqueio (5%-6% de albumina de soro bovino (BSA) em PBST)-500 μL para um poço de uma placa de 6 poços e 250 μL para um poço de uma placa de 12 poços - e incube à temperatura ambiente no agitador por 40-60 min.</li>
	<li>Diluir os anticorpos primários contra FABP4, adiponectina em 2%-3% BSA, a uma concentração de 1:500 (ver Tabela de Materiais). Adicione estes anticorpos apenas se criados em animais diferentes e coloque a placa no agitador a 4 °C, durante a noite.</li>
	<li>Remova os anticorpos primários e lave as células três vezes com TBST (15 min cada) e coloque-as em um agitador à temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar anticorpos secundários Alexa Fluor em PBST (1:500). Incubar as células nas combinações de anticorpos secundários (de acordo com a espécie em que o anticorpo primário é elevado) por 60 minutos à temperatura ambiente e cobrir a placa com papel alumínio para protegê-la da luz.</li>
	<li>Descarte os anticorpos secundários, lave com TBST três vezes e coloque a placa no agitador.</li>
	<li>Para corar os núcleos, adicionar 1 μg/mL de Hoechst 33342-200 μL para um poço de uma placa de 24 poços diluída em PBS e incubar por 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Descarte a solução de Hoechst e adicione PBS-500 μL para um poço de uma placa de 24 poços às células. Mantenha as placas cobertas de luz até serem visualizadas em microscópio de fluorescência invertido.</li>
</ol>6. Classificação de adipócitos usando vermelho do Nilo
<ol><li>Preparar a solução de trabalho vermelha do Nilo adicionando 1 mg/ml de solução-mãe vermelha do Nilo em DMSO e conservar a -20 °C. Logo antes do uso, descongele o estoque vermelho do Nilo e reconstitua em DPBS para atingir a concentração de 300 nM da solução de trabalho.</li>
	<li>No ou após o 14º dia de diferenciação dos adipócitos, descarte o meio das células e lave com DPBS.</li>
	<li>Adicionar a solução de trabalho vermelha do Nilo -1 mL em um poço de uma placa de 6 poços - e incubar a 37 °C por 15 min.</li>
	<li>Remover a solução vermelha do Nilo e adicionar tripsina-EDTA -500 μL em um poço de uma placa de 6 poços - e incubar a 37 °C por 4 min.</li>
	<li>Coletar as células usando DMEM contendo FBS a 5% em um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar a 750 x g por 4 min.</li>
	<li>Retirar o sobrenadante e ressuspender em DPBS-1 mL para 1 x 106 células. Centrifugar a 750 x g por 4 min.</li>
	<li>Retirar o sobrenadante e ressuspender em DPBS-1 mL para 1 x 106 células. Use um classificador FACS para isolar as células vermelhas positivas do Nilo usando o canal FL1.</li>
	<li>Recultivar as células selecionadas em meios de diferenciação de adipócitos ou coletar as células selecionadas para isolamento de RNA e proteínas.</li>
	<li>Extrair o RNA das células selecionadas e realizar análise quantitativa relativa dos marcadores de diferenciação de adipócitos, incluindo FABP4, PPARG e C/EBPA. As células vermelho-positivas do Nilo mostram um aumento significativo na expressão gênica de pelo menos duas vezes em comparação com as células não classificadas.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram não ter interesses concorrentes.

Este protocolo tem importância primordial devido à sua capacidade de fornecer CTMs em alto rendimento e eficiência. Essa produção em massa de CTMs em escala foi possível pela incubação transitória de EBs derivadas de iPSCs com 10 μM de AR14,15. O tratamento transitório com 10 μM de AR aumentou o rendimento das CTM em 11,2 a 1542 vezes14,15, sendo esse protocolo aplicável tanto em iPSCs quanto em hPSCs. Ne...

As células-tronco mesenquimais (CTMs) atuam como um recurso transitório efetivo para a produção de células de origem mesodérmica, como adipócitos, osteócitos e condrócitos, que poderiam ser posteriormente utilizadas para modelar suas respectivas doenças genéticas. No entanto, abordagens anteriores baseavam-se na obtenção dessas CTMs a partir de tecidos adultos 1, o que impunha o desafio de obtê-las em grande número dos doadores e a limitação de mantê-las funcionalmente viáveis em condições subótimas de cultivo in vitro 1,2. Esses obstáculos têm gerado uma grande demanda de se ter um protocolo para geração de CTMs in vitro. Células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) podem ser usadas como uma fonte valiosa de CTMs, exibindo características deCTMs 3,4,5. As CTMs derivadas de iPSCs podem ser utilizadas como opção terapêutica em diversas doenças. Além disso, a capacidade das CTMs derivadas de iPSCs de gerar adipócitos as torna um valioso modelo humano in vitro para estudar adipogênese humana, obesidade e distúrbios associados a adipócitos.
Os protocolos atuais de diferenciação de adipócitos podem ser classificados em dois grupos, com um envolvendo diferenciação de adipócitos usando coquetéis químicos ou à base de proteínas, resultando em um rendimento de 30%-60%6,7,8,9, enquanto o outro envolvendo manipulação genética para indução robusta de fatores-chave de transcrição que governam o desenvolvimento de adipócitos para dar um rendimento de 80%-90%10, 11º. No entanto, a manipulação genética não recapitula o processo natural de diferenciação dos adipócitos e, muitas vezes, mascara os paradigmas sutis que chegam durante a adipogênese, tornando-a ineficaz para fins de modelagem da doença12,13. Portanto, apresentamos uma maneira de classificar adipócitos maduros quimicamente derivados de imaturos marcando fluorescentemente adipócitos portadores de lipídios usando vermelho do Nilo.
Apresentamos aqui um protocolo envolvendo a incubação transitória de corpos embrionários (EBs) derivados de iPSCs com ácido all-trans retinóico para produzir um grande número de CTMs de rápida proliferação, que poderiam ser posteriormente utilizadas para gerar adipócitos14. Também apresentamos uma maneira de classificar adipócitos maduros derivados quimicamente do pool de diferenciação heterogênea marcando fluorescentemente suas gotículas lipídicas usando um corante lipofílico; Vermelho do Nilo. Isso permitiria a geração de uma população pura de adipócitos maduros com funcionalidade aprimorada para modelar com precisão os distúrbios metabólicos associados aos adipócitos.

<table><tbody><tr><td>Adiponectina</td><td>Abcam</td><td>ab22554</td><td>Marcador de maturação de adipócitos</td></tr><tr><td>anti-CD105</td><td>BD Pharmingen</td><td>560839</td><td>Marcador de diferenciação MSC</td></tr><tr><td>anti-CD14</td><td>BD Pharmingen</td><td>561712</td><td>Marcador de diferenciação MSC</td></tr><tr><td>anti-CD19</td><td>BD Pharmingen</td><td>555415</td><td>Marcador de diferenciação MSC</td></tr><tr><td>anti-CD34</td><td>BD Pharmingen</td><td>555824</td><td>Marcador de diferenciação MSC</td></tr><tr><td>anti-CD44</td><td>abcam</td><td>ab93758</td><td>Marcador de diferenciação MSC</td></tr><tr><td>anti-CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td> 560975</td><td>Marcador de diferenciação MSC</td></tr><tr><td>anti-CD73</td><td>BD Pharmingen</td><td>550256</td><td>Marcador de diferenciação MSC</td></tr><tr><td>anti-CD90</td><td>BD Pharmingen</td><td>555596</td><td>Marcador de diferenciação MSC</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D</td><td>233-FP</td><td>MSC suplemento de meio de cultura</td></tr><tr><td>C / EBPA</td><td>Abcam</td><td>ab40761</td><td>Marcador de maturação de adipócitos</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Torics</td><td>1126</td><td>Suplemento de meios de diferenciação de adipócitos</td></tr><tr><td>FABP4</td><td>Abcam</td><td>ab93945</td><td>Marcador de maturação de adipócitos</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Suplemento de meio de cultura</td> <td>ThermoFisher</td><td>10082147</td> MSC</tr><tr><td>Glutamax</td><td>ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td>MSC suplemento de mídia de cultura</td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5879</td><td>Suplemento de mídia de diferenciação de adipócitos</td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I7378</td><td>Suplemento de mídia de diferenciação de adipócitos</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>91077C</td><td>Suplemento de mídia de diferenciação de adipócitos</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12660012</td><td>Meios basais para a preparação de matrigel</td></tr><tr><td>Baixo teor de glicose DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11885084</td><td>MSC meios de cultura</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Matriz de revestimento</td></tr><tr><td>MEM-alfa</td><td>ThermoFisher</td><td>12561056</td><td>Meios de diferenciação de adipócitos</td></tr><tr><td>Nilered</td><td>Sigma Aldrich</td><td>19123</td><td>Marcador de classificação para adipócito</td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>MSC/Suplemento de mídia de adipócitos</td></tr><tr><td>Salina tamponada com fosfato</td><td>Tampão</td><td>de lavagem de 14190144</td><td>ThermoFisher</td></tr><tr><td>Pierce&trade; 20X TBS Buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>28358</td><td>tampão de lavagem</td></tr><tr><td>PPARG</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>2443</td><td>Marcador de maturação de adipócitos</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stem Cell Tecnologias</td><td>5872</td><td>Reagente de dissociação</td></tr><tr><td>Ácido retinóico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625</td><td>MSC suplemento de mídia de diferenciação</td></tr><tr><td>Inibidor de rocha</td><td>Tocris</td><td>1254/10</td><td>hPSC suplemento de mídia de cultura</td></tr><tr><td>Roziglitazona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2408</td><td>Suplemento de mídia de diferenciação de adipócitos</td></tr><tr><td>StemFlex</td><td>ThermoFisher</td><td>A334901</td><td>hPSC meio de cultura</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Thermo Fisher</td><td>28314</td><td>Reagente de permebealização</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>ThermoFisher</td><td>25200072</td><td>Reagente de dissociação</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7942</td><td>Tampão de lavagem</td></tr></tbody></table>

diferenciação robusta de ipscs humanas em uma população pura de adipócitos para estudo de distúrbios associados a adpócitos

Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders

Avanços recentes na tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) têm permitido a geração de diferentes tipos celulares, incluindo adipócitos. Entretanto, os métodos de diferenciação atuais têm baixa eficiência e não produzem uma população homogênea de adipócitos. Aqui, contornamos esse problema usando um método baseado em trans-retinóicos para produzir células-tronco mesenquimais (CTMs) em alto rendimento. Ao regular as vias que governam a proliferação, sobrevivência e adesão celular, nossa estratégia de diferenciação permite a geração eficiente de corpos embrionários (EBs) que se diferenciam em uma população pura de CTMs multipotentes. O elevado número de CTMs geradas por este método fornece uma fonte ideal para a geração de adipócitos. No entanto, a heterogeneidade da amostra resultante da diferenciação dos adipócitos permanece um desafio. Portanto, usamos um método à base de vermelho do Nilo para purificar adipócitos maduros portadores de lipídios usando FACS. Essa estratégia de classificação nos permitiu estabelecer uma maneira confiável de modelar distúrbios metabólicos associados aos adipócitos usando um pool de adipócitos com heterogeneidade amostral reduzida e funcionalidade celular aprimorada.

Esquema e morfologia das células durante a diferenciação mesenquimal: A diferenciação de iPSCs em CTMs envolve vários estágios de desenvolvimento abrangendo a formação de EB, diferenciação de CTM e expansão de CTM (Figura 1). Durante esses estágios de desenvolvimento, as células adquirem várias morfologias devido aos diferentes produtos químicos estimulatórios a que são submetidas. Ao iniciar a diferenciação, as células são plaqueadas em suspensão e espera-se que sejam redondas, com bordas c...

O protocolo permite a geração de uma população de adipócitos puros a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). O ácido retinóico é usado para diferenciar iPSCs em células-tronco mesenquimais (CTMs) que são usadas para produzir adipócitos. Em seguida, uma abordagem de classificação baseada na coloração vermelha do Nilo é usada para obter adipócitos puros.

Diferenciação Robusta de iPSCs Humanas em uma População Pura de Adipócitos para Estudo de Distúrbios Associados a Adpócitos

Recent advances in induced pluripotent stem cell (iPSC) technology have allowed the generation of different cell types, including adipocytes. However, the ...

Abordagens anteriores se baseavam em métodos altamente invasivos para a obtenção de células-tronco mesenquimais in vitro, mas essas células-tronco mesenquimais tinham uma limitação de produzir pool heterogêneo de 30% com eficiência variando de 30 a 60%Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um alto número de células-tronco mesenquimais de proliferação rápida que podem produzir uma população pura de adipócitos maduros por triagem usando vermelho do Nilo. Quando as iPSCs atingirem 80% de confluência, lavar as células com DPBS e adicionar meio de dissociação contendo EDTA. Incubar as células a 37 graus Celsius por um minuto.Após um minuto, aspirar o reagente de dissociação e colocar as células a 37 graus Celsius por mais um minuto. Em seguida, retire a placa da incubadora. Adicione um mililitro de meio StemFlex por poço e colete cuidadosamente as células em um tubo cônico de 15 mililitros.Centrifugar as células. Retire o sobrenadante e ressuspenda-o suavemente em três mililitros de meio de diferenciação MSC contendo 10 micromoles de um inibidor de rocha. Misture a suspensão celular e distribua 500 microlitros por poço em uma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços.Em seguida, coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius. Após 24 horas, para induzir os corpos embrionários atingidos, colete-os em um tubo de 15 mililitros e permita que eles se acomodem. Após 15 minutos, retirar o sobrenadante e adicionar meio de diferenciação MSC suplementado com ácido retinóico 10 micromolares.Ressuspenda os corpos embrionários suavemente e distribua 500 microlitros por poço na mesma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços. Em seguida, coloque a placa na incubadora. Após 48 horas, colete os corpos embrionários em um tubo de 15 mililitros e deixe-os se acomodar por 15 minutos.Em seguida, remova o sobrenadante e adicione o meio de diferenciação MSC suplementado com ácido retinóico 0,1 micromolar. Após ressuspender os corpos embrionários, distribua 500 microlitros por poço na mesma placa de 24 poços e coloque a placa na incubadora. Quarenta e oito horas após o último tratamento com ácido retinóico, coletar os corpos embrionários, remover o sobrenadante e adicionar meio DMEM de baixa glicose sem citocinas.Ressuspenda suavemente e distribua 500 microlitros da suspensão celular por poço na mesma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços e, em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius. Após 48 horas, para plaquear os corpos embrionários derivados da iPSC, coletar os corpos embrionários em um tubo de 15 mililitros, deixá-los se acomodar, remover o sobrenadante e ressuspender em dois mililitros de meio fresco de diferenciação de CTM. Em seguida, transfira a suspensão para dois poços de uma placa de seis poços revestida com matriz de membrana basal e incube as células a 37 graus Celsius.Após cinco dias, substituir o meio gasto por um meio fresco de diferenciação de CTM contendo 2,5 nanogramas por mililitro de fator de crescimento básico de fibroblastos e continuar a diferenciação de CMS por até 11 e 15 dias. Quando os corpos embrionários plaqueados atingirem 80 a 90% de confluência, passe-os lavando com DPBS, adicionando tripsina-EDTA e incubando a 37 graus Celsius por um minuto. Retire a tripsina-EDTA da placa e incube novamente a 37 graus Celsius por um minuto.Em seguida, adicione um mililitro de mídia por poço. Após três minutos, coletar as células usando meios de diferenciação de CTM em um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugar as células. Em seguida, ressuspender as células em um meio de diferenciação de CTM contendo fator de crescimento básico de fibroblastos e plaquear as células em placas revestidas com matriz de membrana basal na proporção de um para três.Depois que as CTMs atingirem 90% de confluência, continue cultivando-as por mais 48 horas para permitir que elas passem por um período de parada de crescimento. Em seguida, remova o meio e lave as células com DBPS. Após a lavagem, adicionar meio de diferenciação completa de adipócitos à placa e incubar as células a 37 graus Celsius.Troque o meio a cada dois dias por 14 dias. Diferenciar CTMs derivadas de iPSC em adipócitos. Para classificar os adipócitos usando vermelho do Nilo, prepare a solução de trabalho vermelho do Nilo em DMSO, conforme descrito no manuscrito do texto.Antes do uso, descongelar a solução estoque e reconstituí-la em DPBS para atingir uma concentração de solução de trabalho de 300 nanomolares. No ou após o 14º dia de diferenciação dos adipócitos, descartar o meio das células e lavar com DPBS. Em seguida, adicione a solução de trabalho vermelho do Nilo.Tampe a placa e incube as células a 37 graus Celsius. Após 15 minutos, substituir a solução vermelha do Nilo por tripsina-EDTA e incubar as células a 37 graus Celsius por quatro minutos. Em seguida, colete as células usando DMEM contendo 5% FBS em um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue as células.Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em DPBS a uma densidade de 1 milhão de células por mililitro. Em seguida, usando o classificador FACS, isole as células vermelhas positivas do Nilo usando o canal FL-1. Coletar as células selecionadas e recultivá-las em meios de diferenciação de adipócitos ou proceder à extração de RNA seguida de análise quantitativa dos marcadores de diferenciação de adipócitos.Ao iniciar a diferenciação, as células plaqueadas em suspensão são redondas com bordas celulares definidas e de pequeno a médio diâmetro de diâmetro. A viabilidade dos corpos embrionários é observada pelo rápido comportamento de proliferação, dando origem a mais CTMs. Esse comportamento de proliferação rápida, juntamente com sua morfologia peculiar e alongada, é mantido mesmo após a passagem das CTMs para placas revestidas com matriz fresca.Uma boa diferenciação produz CTMs confiáveis com eficiência de expressão superior a 90% dos marcadores de superfície mesenquimal CD73, CD44 e CD90. Além disso, a avaliação das células quanto à ausência de marcadores de superfície que retratam o fenótipo hematopoético CD14, CD34 e CD19 mostrou eficiência de expressão inferior a 1%, Alta expressão na distribuição citoplasmática de FABP4, um marcador para adipócitos terminalmente diferenciados, indica sua maturidade de desenvolvimento. Além disso, a alta expressão de adiponectina, outro marcador de maturidade dos adipócitos, indica que os adipócitos são funcionais o suficiente para sofrer armazenamento lipídico e adipogênese em resposta à sinalização da glicose.Após a coloração, o vermelho do Nilo liga-se exclusivamente aos adipócitos maduros portadores de lipídios, tornando-se uma ferramenta eficaz para classificar adipócitos maduros usando citometria de fluxo ativada por fluorescência. As células vermelho-positivas do Nilo mostram um aumento significativo da regulação dos marcadores de maturação em pelo menos duas vezes em comparação com as células não selecionadas. Você tem que ser muito gentil ao coletar células durante a formação do corpo embrionário e dissociação de células mesenquimais, pois isso teria um grande impacto na eficiência de sobrevivência pós-dissociação de células-tronco mesenquimais.A população pura de adipócitos obtida de pacientes portadores de mutação pode ser submetida ao sequenciamento funcional e ao transcriptoma completo para determinar vias regulatórias e de sinalização afetadas por determinada mutação sem que os dados sejam afetados pela heterogeneidade da amostra. Esta técnica permitirá a geração escalável de células-tronco mesenquimais in vitro, eliminando a necessidade de colhê-las de doadores humanos para diferenciá-las prontamente em adipócitos, condrócitos e osteócitos para o entendimento da patogênese de doenças relacionadas ao tecido.

robust-differentiation-human-ipscs-into-pure-population-adipocytes-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Os adipócitos maduros podem representar uma fonte abundante de células-tronco por meio da desdiferenciação, o que leva a uma população homogênea de células semelhantes a fibroblastos. A digestão da colagenase é usada para isolar adipócitos maduros da gordura humana. O objetivo do nosso protocolo é obter células de gordura multipotentes e desdiferenciadas a partir de adipócitos humanos maduros.

Geração de adiposo humano Stem Cells através Dedifferentiation de adipócitos maduros em Culturas de teto

Este protocolo descreve o isolamento de células-tronco derivadas do tecido adiposo de porco (pADSC) de tecidos adiposos subcutâneos com exame de multipotência. O pADSC multipotente é usado para delinear processos de diferenciação de adipócitos e estudar a transdiferenciação em múltiplas linhagens celulares de mesênquima mesodérmico ou outras linhagens de ectoderma e endoderme para estudos regenerativos.

Isolamento e diferenciação de células tronco derivadas de tecido adiposo de Suínos Subcutânea tecidos adiposos

Este protocolo descreve a abordagem técnica para isolar subpopulações de células estromais adipogênicas e fibroinflamatórias de depósitos de tecido adiposo branco intra-abdominal murino (WAT) por classificação de células ativadas por fluorescência ou separação de esferas imunomagnéticas.

Isolamento de Subpopulações de Células Estromais Adipogênicas e Fibro-Inflamatórias de Depósitos Adiposos Intra-Abdominais Murinos

Apresentamos um método simples para isolar células progenitoras adiposas altamente viáveis de almofadas de gordura epidímica do rato usando a triagem celular ativada por fluorescência.

Preparação de células progenitoras adiposas adiposas de tecidos adiposos epidímicos do rato

Este relatório descreve um protocolo para o isolamento simultâneo de preadipócitos primários marrons e brancos de camundongos recém-nascidos. Células isoladas podem ser cultivadas na cultura e induzidas a se diferenciar em adipócitos brancos e marrons totalmente maduros. O método permite a caracterização genética, molecular e funcional das células de gordura primárias na cultura.

Isolamento e diferenciação de preadipócitos brancos e marrons primários de camundongos recém-nascidos

Este protocolo descreve o isolamento de pré-adipócitos de camundongos da gordura subcutânea, sua diferenciação em adipócitos maduros e a indução de resistência à insulina. A ação da insulina é avaliada pela fosforilação/ativação de membros da via de sinalização da insulina através do western blot. Este método permite a determinação direta da resistência/sensibilidade à insulina em adipócitos primários.

Adipócitos diferenciados de camundongos em cultura primária: um modelo de resistência à insulina

Os pré-adipócitos são isolados da fração vascular estromal do tecido adiposo marrom interescapular de camundongos recém-nascidos e diferenciados em células que acumulam gotículas lipídicas, expressam marcadores moleculares e mostram a morfologia mitocondrial de adipócitos marrons maduros. Essas células são posteriormente analisadas por imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão.

Diferenciação e imagem de adipócitos marrons da fração vascular estromal do tecido adiposo interescapular de camundongos recém-nascidos

Este protocolo descreve o isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino para obtenção de pré-adipócitos e diferenciação de adipócitos in vitro. O uso de um dissociador tecidual para digestão da colagenase reduz a variação experimental e aumenta a reprodutibilidade.

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

O tamanho e a fragilidade dos adipócitos maduros limitaram as técnicas e ferramentas disponíveis para seu estudo e isolamento. Aqui, é descrito um protocolo para o isolamento de adipócitos murinos maduros, que pode ser facilmente adaptado para diferentes depósitos adiposos e dietas de camundongos.

Isolamento e cultura de adipócitos murinos primários de camundongos magros e obesos

Aqui, apresentamos um método padrão para isolar eficientemente células-tronco e adipócitos derivados do adiposo, caracterizado por redução de &gt;90% no tempo de processamento, alta viabilidade celular e ampla compatibilidade.

Isolamento Eficiente de Células-Tronco e Adipócitos Derivados do Adiposo a partir do Tecido Adiposo Suíno

Aprenda a diferenciar iPSCs humanas em adipócitos maduros usando ácido retinóico e coloração com Nile red. Este método gera populações puras para estudos de distúrbios metabólicos e obesidade.

Diferenciação Robusta de iPSCs Humanas em uma População Pura de Adipócitos para Estudo de Distúrbios Associados a Adpócitos

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