Name: QPCR pronto para uso para detecção de DNA de Trypanosoma cruzi ou outros organismos patogênicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 50 s
Description: Aprenda a preparar reações de qPCR prontas para uso para detecção de DNA de Trypanosoma cruzi. Este protocolo de gelificação reduz o tempo de preparo e minimiza erros operacionais em diagnósticos moleculares.

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Os autores agradecem a Aline Burda Farias pela assistência técnica com o forno a vácuo, bem como à administração do Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brasil) por permitir o acesso aos referidos equipamentos. Este trabalho foi parcialmente financiado pela bolsa CNPq 445954/2020-5.

1. Preparação de soluções-mãe e mistura de gelificação
NOTA: Quatro soluções-estoque serão preparadas (400 mg/mL de melezitose, 400 mg/mL de trealose, 0,75 mg/mL de lisina e 200 mg/mL de glicogênio) e misturadas de acordo com a proporção mostrada na Tabela 1 para produzir a mistura de gelificação. Embora o protocolo descreva 10 mL de produção de soluções de estoque, ele pode ser adaptado para volumes menores ou maiores.
<ol><li>Solução de Melezitose<ol><li>Pesar 4 g de melezitose em um tubo de plástico de 15 mL, adicionar 6 mL de água livre de nuclease e vórtice na velocidade máxima do instrumento até que o pó seja solubilizado. NOTA: Mais água pode ser adicionada para facilitar a solubilização, tomando cuidado para não exceder o volume final (veja abaixo).</li>
		<li>Perfazer o volume final até 10 mL com água livre de nuclease. Rotular e armazenar a 2-8 °C por até 6 meses.</li>
	</ol></li>
	<li>Solução de trealose<ol><li>Pesar 4 g de trealose em um tubo de plástico de 15 mL, adicionar 6 mL de água livre de nuclease e vórtice na velocidade máxima do instrumento até que o pó seja solubilizado. NOTA: Mais água pode ser adicionada para facilitar a solubilização, tomando cuidado para não exceder o volume final (veja abaixo).</li>
		<li>Perfazer o volume até 10 ml com água isenta de nuclease e filtrar a solução através de um filtro de 0,2 μm. Rotular e armazenar a 2-8 °C por até 6 meses.</li>
	</ol></li>
	<li>Solução de glicogênio<ol><li>Pesar 2 g de glicogênio em um tubo de plástico de 15 mL, adicionar 6 mL de água livre de nuclease e vórtice na velocidade máxima do instrumento até que o pó seja solubilizado. NOTA: Mais água pode ser adicionada para facilitar a solubilização, tomando cuidado para não exceder o volume final (veja abaixo).</li>
		<li>Mantenha a solução em repouso a 2-8 °C por 8-12 h porque a solubilização do glicogênio produz muitas bolhas (Figura 1). Completar o volume até 10 ml com água isenta de nuclease. Rotular e armazenar a 2-8 °C por até 6 meses.</li>
	</ol></li>
	<li>Solução de lisina<ol><li>Pesar 7,5 mg de lisina em um tubo de plástico de 15 mL, adicionar 6 mL de água livre de nuclease. Vórtice à velocidade máxima do instrumento até que o pó seja solubilizado. NOTA: Mais água pode ser adicionada para facilitar a solubilização, tomando cuidado para não exceder o volume final (veja abaixo).</li>
		<li>Perfazer o volume até 10 ml com água isenta de nuclease e filtrar a solução através de um filtro de 0,2 μm. Transferir a solução para um balão de âmbar ou protegê-la da luz. Rotule e armazene a 2-8 °C graus por até 6 meses.</li>
	</ol></li>
	<li>Mistura de gelificação (GM)<ol><li>Em um tubo plástico de 50 mL, misture os volumes de soluções-estoque de acordo com a Tabela 1.</li>
		<li>Misture os reagentes por dez inversões de ponta a ponta do tubo. NOTA: Não há necessidade de uma etapa de filtragem se esta etapa for executada em um exaustor de segurança de fluxo laminar. Se esta etapa não for executada num ambiente limpo, filtrar a solução através de um filtro de 0,2 μm antes de a transferir para um balão de âmbar.</li>
		<li>Transferir a solução para um balão de âmbar ou protegê-la da luz. Rotular e armazenar a 2-8 °C por até 3 meses. NOTA: Como etapa de controle de qualidade para a preparação da mistura de gelificação, certifique-se de que os valores medidos de pH, condutividade e densidade estejam dentro das seguintes faixas: pH 5,55-6,66; condutividade 0,630-0,757 mS/cm; e densidade 1,08-1,11 g/cm3. Todas as medições devem ser efectuadas a 25 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação da mistura mestre de qPCR para gelificação
NOTA: Nesta etapa, a mistura mestre de qPCR para gelificação é preparada. Assim, a água não é adicionada à mistura, mas em vez disso, a mistura de gelificação é adicionada (Tabela 2).
<ol><li>Descongelar os reagentes em um recipiente refrigerado. Misture os reagentes em um tubo de 1,5 mL de acordo com a Tabela 2. Um exemplo de uma reação com um volume final de 25 μL contendo 5 μL de amostra de DNA é mostrado aqui. NOTA: A amostra de ADN não é adicionada à mistura neste passo; ele é usado aqui apenas para calcular os volumes finais de cada reagente do master mix qPCR. Amostras de DNA devem ser adicionadas logo antes de iniciar a corrida (veja a etapa 4 abaixo).</li>
</ol>3. Gelificação dos reagentes nos recipientes de reacção
<ol><li>Multiplique adequadamente os volumes mostrados na Tabela 2 para a preparação de uma tira de oito tubos ou de uma placa de 96 poços.</li>
	<li>Pipetar 18,5 μL da mistura mestra de gelificação mostrada na Tabela 2 em cada poço de reação. NOTA: Este volume representa os volumes de mistura de oligonucleotídeos, tampão de PCR e mistura de gelificação usados para uma reação (de acordo com a Tabela 2) e variará dependendo da concentração dos reagentes e do volume necessário para uma reação. O volume final na mistura mestra de gelificação é diferente do volume em uma mistura mestra regular porque a água não é adicionada.</li>
	<li>Coloque os tubos/placa no suporte condutor de calor (por exemplo, alumínio) dentro do forno a vácuo. NOTA: O suporte condutor de calor é opcional. O operador deve certificar-se de que o fundo dos tubos está em contacto com a prateleira do forno a vácuo para permitir um rápido equilíbrio térmico.</li>
	<li>Coloque um saco de argila bentonítica para cada duas placas de 96 poços. NOTA: Os sacos de argila bentonítica são usados para absorver a água removida da mistura mestra de gelificação pela pressão diferencial exercida pelo vácuo. Sacos de argila bentonítica foram considerados desnecessários para menos de duas placas de 96 poços.</li>
	<li>Submeter os tubos/placas que contêm a mistura mestra de gelificação a três ciclos de vácuo (30 ± 5 mBar) de 30 min cada, alternando com a libertação de vácuo até atingir a pressão atmosférica (900-930 mBar), sob temperatura controlada (30 °C ± 1 °C) (Figura 2). NOTA: O instrumento usa software para controlar os parâmetros, e um exemplo do ciclo é mostrado na Figura 2. O usuário deve criar o perfil para a execução, indicando os parâmetros escolhidos.</li>
	<li>Quando o ciclo estiver concluído, verifique os tubos/placas quanto à gelificação adequada dos reagentes, certificando-se de que o volume está visivelmente reduzido (Figura 3) e que os líquidos não se movem ao bater nos tubos/placas com os dedos. NOTA: Se a gelificação não ocorresse, a solução respingaria nas paredes do tubo quando os tubos fossem grampeados (Figura 3).</li>
	<li>Selar e armazenar os tubos/placas a 2-8 °C durante 8-12 h antes da utilização.</li>
</ol>4. Usando um qPCR gelificado
<ol><li>Remova a tira de tubo ou a placa do frigorífico e abra-a numa estação de trabalho para manipulação da amostra. Adicione 15 μL de água livre de nuclease a cada vaso de reação. NOTA: O volume de reagentes gelificados é considerado de cerca de 5 μL. Assim, juntamente com o volume da amostra de DNA (veja abaixo), o volume de reação final é de 25 μL.</li>
	<li>Adicionar 5 μL de amostra de ADN. NOTA: Qualquer modelo de DNA de qualidade qPCR pode ser usado. No presente trabalho, o DNA foi extraído de 108 epimastigotas de T. cruzi (cepa Dm28c) e diluído em série na proporção de 1:10 usando tampão TE.</li>
	<li>Sele os tubos/placas e prossiga para o equipamento de sua escolha. Execute o experimento e prossiga para a análise regular dos dados.</li>
</ol>

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<li>Kamau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample-ready+multiplex+qPCR+assay+for+detection+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria.</a> Malaria Journal. 13, 158(2014).</li>
<li>Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+and+further+challenges+in+lyophilization%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Recent advances and further challenges in lyophilization.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).</li>
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<li>Iglesias, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+a+new+gelled+nested+PCR+test+for+the+diagnosis+of+imported+malaria%3A+comparison+with+microscopy%2C+rapid+diagnostic+test%2C+and+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Research%22%5BJournal%5D)">Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR.</a> Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).</li>
<li>Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+diagnostics+for+Chagas+disease%3A+up+to+date+and+novel+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Os últimos anos têm destacado a necessidade de encontrar tecnologias mais sensíveis e específicas para ajudar a diagnosticar doenças tropicais e negligenciadas. Embora importantes para o controle epidemiológico, os testes parasitológicos (microscopia óptica) e sorológicos apresentam limitações, principalmente no que se refere à sensibilidade e aplicabilidade no local de atendimento. Técnicas de amplificação de DNA, como PCR, amplificação isotérmica e respectivas variações, têm sido usadas há muito tempo em ambientes de l...

A doença de Chagas foi descoberta no início doséculo 20 em regiões rurais do Brasil, onde a pobreza era generalizada 1,2. Ainda hoje, a doença continua ligada aos determinantes sociais e econômicos da saúde nas Américas. A doença de Chagas é bifásica, compreendendo uma fase aguda e uma crônica. É causada pela infecção pelo parasita Trypanosoma cruzi, sendo transmitida por insetos vetores, transfusões de sangue por via congênita ou ingestão oral de alimentos contaminados 3,4.
O diagnóstico da doença de Chagas pode ser feito por meio da observação de sintomas clínicos (especialmente o sinal de Romaña), baciloscopia sanguínea, sorologia e testes moleculares como PCR em tempo real (qPCR) ou amplificação isotérmica 4,5,6,7,8,9. Os sintomas clínicos e a baciloscopia de sangue são utilizados em casos suspeitos de infecções agudas, enquanto a busca de anticorpos é utilizada como ferramenta de triagem em pacientes assintomáticos. Devido à sua sensibilidade e especificidade, a qPCR tem sido sugerida para ser utilizada como ferramenta de monitoramento para pacientes crônicos, para pacientes agudos submetidos a tratamento medindo a carga parasitária no sangue e como marcador substituto de falha terapêutica 6,8,10,11,12 . Embora mais sensível e específica do que os testes atualmente disponíveis, a qPCR é efetivamente impedida de ser conhecida como ferramenta diagnóstica em regiões desfavorecidas em todo o mundo devido à exigência de temperaturas de congelamento para transporte e armazenamento13,14,15.
Para contornar esse obstáculo, técnicas de conservação como a liofilização e a gelificação têm sido exploradas16,17. Embora a liofilização proporcione conservação por anos, requer reagentes especialmente feitos sem a presença de glicerol, que é comumente usado para estabilização/conservação enzimática18. Embora a gelificação tenha demonstrado proporcionar conservação por meses, ela permite o uso de reagentes regulares19. A solução de gelificação compreende quatro componentes, cada um com papéis específicos no processo: os açúcares trealose e melezitose protegem as biomoléculas durante o processo de dessecação, reduzindo as moléculas de água livre na solução, o glicogênio produz uma matriz protetora mais ampla e o aminoácido lisina é usado como um eliminador de radicais livres para inibir as reações oxidantes entre o carboxila da biomolécula, grupos amino e fosfato. Esses componentes definem uma mistura sol-gel que evita a perda da estrutura terciária ou quaternária durante o processo de dessecação, ajudando a manter a atividade das biomoléculas na reidratação19. Uma vez estabilizadas dentro dos tubos de reação, as reações podem ser armazenadas por alguns meses a 2-8 °C ou algumas semanas a 21-23 °C em vez do regular -20 °C. Essa abordagem já foi incorporada em testes destinados a auxiliar no diagnóstico de doenças como doença de Chagas, malária, leishmaniose, tuberculose e ciclosporíase13,14,15,20.
O presente trabalho descreve todas as etapas para preparar as soluções necessárias para o procedimento de gelificação, as armadilhas no processo e o aspecto final esperado de uma qPCR gelificada pronta para uso dentro de tiras de oito tubos. O mesmo protocolo pode ser adaptado para tubos únicos ou placas de 96 poços. Finalmente, a detecção do DNA de T. cruzi será mostrada como uma corrida de controle.

<table><tbody><tr><td>Sacos de argila bentonita (ativados)</td><td>Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Espanha)</td><td>026157/STD</td><td>Não deve ser confundido com pacotes de sílica gel</td></tr><tr><td>Glicogênio</td><td>Amersham Bioscience</td><td>Cat# US16445</td><td></td></tr><tr><td>Lisina</td><td>Acros Organic</td><td>Cat# 365650250</td><td></td></tr><tr><td>Melezitoze</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 63620</td><td></td></tr><tr><td>Água</td> <td>sem nucleasefornecedor</td><td></td><td></td>preferencial</tr><tr><td>Oligonucleotídeos</td><td>fornecedor</td><td></td><td></td>preferencial</tr><tr><td>PCR mastermix</td><td>fornecedor preferencial ou Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brasil)</td>Kit <td></td><td>NAT Chagas</td></tr><tr><td>PCR termociclador</td> fornecedor <td>preferido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>software para forno a vácuo</td><td>Memmert Gmbh</td><td>Celsius v10.0</td><td></td></tr><tr><td>Trealose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# T9531</td><td></td></tr><tr><td>DNA de Trypanosoma cruzi</td><td>de parasitas cultivados internamente, ou comprado de fornecedores credenciados, como ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forno a vácuo</td><td>Memmert Gmbh</td><td>VO-400</td><td></td></tr></tbody></table>

qpcr pronto para uso para detecção de dna de trypanosoma cruzi ou outros organismos patogênicos

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

A PCR em tempo real (qPCR) é uma técnica notavelmente sensível e precisa que permite amplificar quantidades minúsculas de alvos de ácido nucleico a partir de uma infinidade de amostras. Tem sido amplamente utilizado em muitas áreas de pesquisa e alcançou aplicação industrial em campos como diagnóstico humano e seleção de características em culturas de culturas de culturas de organismos geneticamente modificados (OGM). No entanto, a qPCR não é uma técnica à prova de erros. A mistura de todos os reagentes em uma única mistura mestra subsequentemente distribuída em 96 poços de uma placa qPCR regular pode levar a erros do operador, como mistura incorreta de reagentes ou dispensação imprecisa nos poços. Aqui, é apresentada uma técnica chamada gelificação, em que a maior parte da água presente na mistura mestre é substituída por reagentes que formam uma mistura sol-gel quando submetida a vácuo. Como resultado, os reagentes de qPCR são efetivamente preservados por algumas semanas à temperatura ambiente ou alguns meses a 2-8 o C. Os detalhes da preparação de cada solução são mostrados aqui, juntamente com o aspecto esperado de uma reação gelificada projetada para detectar oDNA satélite de T. cruzi (satDNA). Um procedimento semelhante pode ser aplicado para detectar outros organismos. Iniciar uma corrida de qPCR gelificada é tão simples quanto remover a placa da geladeira, adicionar as amostras aos seus respectivos poços e iniciar a corrida, diminuindo assim o tempo de configuração de uma reação de placa cheia para o tempo que leva para carregar as amostras. Além disso, as reações de PCR gelificadas podem ser produzidas e controladas quanto à qualidade em lotes, economizando tempo e evitando erros comuns do operador durante a execução de reações de PCR de rotina.

Três dos reagentes que formam a mistura de gelificação são facilmente solubilizados após vórtices vigorosos. No entanto, o glicogênio requer vórtice cuidadoso para garantir que o pó tenha sido completamente solubilizado. Infelizmente, o vórtice vigoroso produz muitas bolhas, o que dificulta a determinação do volume real da solução (Figura 1A-B). Portanto, é essencial deixar a solução de glicogênio descansar na geladeira até que a maior parte da solução presa...

O presente trabalho descreve as etapas para a produção de qPCR pronta para uso para detecção de DNA de T. cruzi que pode ser pré-carregada no vaso de reação e armazenada na geladeira por vários meses.

QPCR pronto para uso para detecção de DNA de Trypanosoma cruzi ou outros organismos patogênicos

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

O protocolo de gelificação produz reações qPCR prontas para uso que diminuem o tempo e as etapas necessárias para iniciar uma execução. Este protocolo permite que as reações de qPCR sejam produzidas e controladas quanto à qualidade e grandes quantidades de uma só vez, diminuindo as chances de erro do operador durante os cálculos da receita ou alíquota em poços. Este método pode ser aplicado a qualquer qPCR que já esteja totalmente otimizado no formato congelado convencional.A demonstração visual desse método é importante porque duas das principais etapas de controle de qualidade são visuais. Para preparar a solução de melezitose, pesar quatro gramas de melezitose em um tubo de plástico de 15 mililitros, adicionar seis mililitros de água livre de nuclease e vórtice na velocidade máxima até que o pó seja solubilizado. Faça o volume final para 10 mililitros com água livre de nuclease, em seguida, rotule e armazene a solução a dois a oito graus Celsius por até seis meses.Para preparar a solução de trealose, pese quatro gramas de trealose em um tubo de plástico de 15 mililitros, adicione seis mililitros de água livre de nuclease e o vórtice na velocidade máxima até que o pó seja solubil

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Neste vídeo, demonstramos a técnica de PCR digital duplex (ddPCR) - uma modificação da técnica tradicional de PCR que é útil na detecção de dois marcadores genéticos diferentes simultaneamente. Uma única reação de PCR é particionada em gotículas emulsionadas do tamanho de nanolitros que são amplificadas independentemente, e a detecção de sinais de amplificação de fluorescência de cores diferentes da fração de gotículas é usada para calcular a concentração inicial das sequências alvo.

PCR digital duplex para quantificação simultânea de marcadores genéticos duplos

Este protocolo descreve a detecção de qPCR de citomegalovírus em tecido de biópsia fixado em formalina e embebido em parafina, que é rápido, sensível, específico e útil para interpretar padrões de coloração ambíguos de hematoxilina e eosina ou imuno-histoquímica.

qPCR é um método sensível e rápido para detecção de DNA por citomegalovírus em formalina-fixo, tecido da biópsia de parafina-embedded

Fornecido é um protocolo para o desenvolvimento de um ensaio de amplificação da polimerase recombinase em tempo real para quantificar a concentração inicial de amostras de DNA usando um termociclador ou um microscópio e aquecedor de platina. Também é descrito o desenvolvimento de um controle positivo interno. Os scripts são fornecidos para processar dados brutos de fluorescência em tempo real.

Desenvolvimento de um Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Ensaio com um controlo positivo interno

A adição de uma etiqueta a uma proteína é uma maneira poderosa de obter informações sobre sua função. Aqui, descrevemos um protocolo para marcar endogenamente centenas de proteínas de Trypanosoma brucei em paralelo, de modo que a marcação em escala de genoma seja alcançável.

De alto rendimento Gene Tagging no<em&gt; Trypanosoma brucei</em

O Trypanosoma cruzi agente da doença de Chagas produz duradouro infecções assintomáticas que se desenvolvem abruptamente em patologia clinicamente reconhecida. O protocolo de pesquisa a seguir descreve um curto prazo baseada na família epidemiológico estudo para desvendar a T. cruzi infecção transmitida sexualmente da mãe à progênie.

Transmissão sexual de tripanosomas americanas de machos e fêmeas para companheiros de ingênua

Descrevemos um ensaio colorimétrico de alta produtividade medindo β-galactosidase atividade em três estágios do ciclo de vida de Trypanosoma cruzi, o agente causador da doença de Chagas. Este ensaio pode ser usado para identificar compostos trypanocidas de forma fácil, rápida e reprodutível.

In vitro Triagem de drogas contra todas as etapas do ciclo de vida de Trypanosoma cruzi usando parasitas expressando β-galactosidase

Este protocolo descreve os passos para gerar um modelo 3D de distribuição metabólica durante a infecção por triplosomatida, incluindo coleta de amostras, extração metabólica, uma visão geral da aquisição de dados de espectrometria de massa de cromatografia líquida-tandem, geração de modelo 3D e, finalmente, visualização de dados.

Cartografia Química se aproxima para estudar infecção por tripanosmatotida

Para facilitar a detecção rápida e precisa de Acinetobacter baumannii, apresentamos um protocolo que emprega a amplificação da polimerase recombinase (RPA) em conjunto com a endonuclease LbaCas12a para identificar infecções por A. baumannii .

Detecção rápida e específica de infecções por Acinetobacter baumannii usando um sistema baseado em amplificação da polimerase recombinase/Cas12a

Aqui, descrevemos um procedimento simples e rápido para detectar DNA de patógenos de abelhas, como Lotmaria passim e Nosema ceranae, usando uma lise celular pronta para amplificação, amplificação da polimerase recombinase e ensaios CRISPR/Cas12a.

Detecção de DNA no local de parasitas tripanossomatídeos e Nosema ceranae por meio de lise alcalina acoplada ao sistema RPA/CRISPR/Cas12a

Aqui, é demonstrado como o Ensaio de Ligação à Proximidade in situ (PLA) pode ser usado para detectar e visualizar as interações proteínas-proteínas diretas entre ATM e p53 em culturas de células suspensas expostas ao estresse genotóxico.

Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

Aprenda a preparar reações de qPCR prontas para uso para detecção de DNA de Trypanosoma cruzi. Este protocolo de gelificação reduz o tempo de preparo e minimiza erros operacionais em diagnósticos moleculares.

QPCR pronto para uso para detecção de DNA de Trypanosoma cruzi ou outros organismos patogênicos

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