QPCR pronto para uso para detecção de DNA de Trypanosoma cruzi ou outros organismos patogênicos

O protocolo de gelificação produz reações qPCR prontas para uso que diminuem o tempo e as etapas necessárias para iniciar uma execução. Este protocolo permite que as reações de qPCR sejam produzidas e controladas quanto à qualidade e grandes quantidades de uma só vez, diminuindo as chances de erro do operador durante os cálculos da receita ou alíquota em poços. Este método pode ser aplicado a qualquer qPCR que já esteja totalmente otimizado no formato congelado convencional.

A demonstração visual desse método é importante porque duas das principais etapas de controle de qualidade são visuais. Para preparar a solução de melezitose, pesar quatro gramas de melezitose em um tubo de plástico de 15 mililitros, adicionar seis mililitros de água livre de nuclease e vórtice na velocidade máxima até que o pó seja solubilizado. Faça o volume final para 10 mililitros com água livre de nuclease, em seguida, rotule e armazene a solução a dois a oito graus Celsius por até seis meses.

Para preparar a solução de trealose, pese quatro gramas de trealose em um tubo de plástico de 15 mililitros, adicione seis mililitros de água livre de nuclease e o vórtice na velocidade máxima até que o pó seja solubilizado. Em seguida, compor o volume para 10 mililitros com água livre de nuclease e filtrar a solução através de um filtro de 0,2 mícron. Rotule e armazene a solução a dois a oito graus Celsius por até seis meses.

Para preparar a solução de glicogênio, pese dois gramas de glicogênio em um tubo de 15 mililitros, adicione seis mililitros de água livre de nuclease e faça vórtice até que o pó seja solubilizado. Mantenha a solução a dois a oito graus Celsius por oito a 12 horas, porque a solubilização do glicogênio produz muitas bolhas. No dia seguinte, removendo a solução da incubação, completar o volume para 10 mililitros com água livre de nuclease e armazenar a solução rotulada a dois a oito graus Celsius por até seis meses.

Para preparar a solução de lisina, pese 7,5 miligramas de lisina em um tubo de 15 mililitros, adicione seis mililitros de água livre de nuclease e vortex até que o pó seja solubilizado. Completar o volume para 10 mililitros com água livre de nuclease. Filtrar a solução através de um filtro de 0,2 mícron e conservar a dois a oito graus Celsius durante um período máximo de seis meses.

Para preparar a mistura de gelificação, misture os volumes apropriados de soluções-estoque em um tubo de plástico de 50 mililitros. Misture os reagentes invertendo o tubo 10 vezes e armazene a solução rotulada a dois a oito graus Celsius por até três meses. Para preparar a mistura mestre de qPCR para gelificação, descongele os reagentes em um recipiente refrigerado.

Em seguida, misture os volumes apropriados dos reagentes em um tubo de 1,5 mililitro para preparar uma mistura mestre suficiente para uma tira de oito tubos ou uma placa de 96 poços. Em seguida, pipeta de 18,5 microlitros do mestre de gelificação mistura-se em cada poço de reação e coloque os tubos ou a placa no suporte condutor de calor dentro do forno a vácuo. Se estiver usando placas de 96 poços, coloque um saco de argila bentonítica no forno para cada duas placas de 96 poços para absorção de água.

Quando o ciclo estiver concluído, verifique os tubos ou placas para a gelificação adequada dos reagentes, garantindo que o volume seja visivelmente reduzido para cerca de cinco microlitros e os líquidos não se movam ao bater nos tubos ou placas com os dedos. Sele e armazene os tubos ou placas a dois a oito graus Celsius por oito a 12 horas antes do uso. Para usar a qPCR gelificada, remova a tira de tubo ou a placa da geladeira e abra-a em uma estação de trabalho para manipulação de amostras.

Adicione 15 microlitros de água livre de nuclease e cinco microlitros de amostra de DNA a cada vaso de reação. Sele os tubos ou placas, execute o experimento desejado e execute análises regulares de dados. No presente protocolo, a temperatura dentro da câmara é mantida constante a 30 graus Celsius, enquanto a pressão varia entre 910 a 930 milibar e perto do vácuo.

Após o ciclo de vácuo, a mistura mestre dentro do tubo diminui de volume, torna-se gelificada no fundo e não respinga nas paredes quando os tubos são batidos. Se a gelificação estiver incompleta, o líquido respinga nas paredes do tubo quando os tubos são tocados. A detecção de Trypanosoma cruzi-DNA usando sequências de oligonucleotídeos publicadas é mostrada aqui.

A detecção da mesma amostra quando a gelificação não foi executada corretamente, resultou em perda de sensibilidade. A etapa mais crítica é o cálculo do volume de reagentes antes da gelificação. O operador deve se lembrar de não adicionar água, pois ela será removida durante o processo.

Se as etapas do protocolo forem seguidas de perto, os operadores com habilidades básicas de laboratório e biologia molecular não terão dificuldade em realizar o processo de gelificação.