Name: Investigação espectrométrica de massa multifacetada de neuropeptídeos em Callinectes sapidus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprenda a análise espectrométrica de massa de neuropeptídeos em Callinectes sapidus. Este método permite quantificação e localização de peptídeos endógenos para pesquisa em neurociência e desenvolvimento de biomarcadores.

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Esta pesquisa foi apoiada pela National Science Foundation (CHE-1710140 e CHE-2108223) e Institutos Nacionais de Saúde (NIH) através da bolsa R01DK071801. A.P. foi apoiada em parte pela NiH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505). N.V.Q. foi apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde, sob o Prêmio Nacional de Serviço de Pesquisa Ruth L. Kirschstein do National Heart Lung and Blood Institute para o Centro de Pesquisa Cardiovascular da Universidade de Wisconsin-Madison (T32 HL007936). L.L. gostaria de reconhecer as bolsas NIH R56 MH110215, S10RR029531 e S10OD025084, bem como o apoio de financiamento de um Professor de Conquista Distinto de Vilas e Professor de Charles Melbourne Johnson com financiamento fornecido pela Wisconsin Alumni Research Foundation e pela University of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.

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Os autores não têm nada a revelar.

A identificação precisa, quantificação e localização de neuropeptídeos e peptídeos endógenos encontrados no sistema nervoso são cruciais para entender sua função23,24. A espectrometria de massa é uma técnica poderosa que pode permitir que tudo isso seja realizado, mesmo em organismos sem um genoma totalmente sequenciado. A capacidade deste protocolo de detectar, quantificar e localizar neuropeptídeos a partir de tecido coletado de C. sapidus através de u...

O sistema nervoso é complexo e requer uma rede de neurônios para transmitir sinais através de um organismo. O sistema nervoso coordena informações sensoriais e resposta biológica. As interações complexas e complicadas envolvidas na transmissão de sinais requerem muitas moléculas de sinalização diferentes, como neurotransmissores, esteroides e neuropeptídeos. Como os neuropeptídeos são as mais diversas e potentes moléculas de sinalização que desempenham papéis-chave na ativação de respostas fisiológicas ao estresse e outros estímulos, é de interesse determinar seu papel específico nesses processos fisiológicos. A função neuropeptídeo está relacionada à sua estrutura de aminoácidos, que determina mobilidade, interação receptora e afinidade1. Técnicas como a histoquímica, importante porque os neuropeptídeos podem ser sintetizados, armazenados e liberados em diferentes regiões do tecido, e a eletrofisiologia têm sido empregadas para investigar a estrutura e função do neuropeptídeo 2,3,4, mas esses métodos são limitados pelo throughput e especificidade para resolver a vasta diversidade sequencial de neuropeptídeos.
A espectrometria de massa (MS) permite a análise de alto rendimento da estrutura e abundância do neuropeptídeo. Isso pode ser realizado através de diferentes técnicas de EM, mais comumente cromatografia-eletrospraização líquida MS (LC-ESI-MS)5 e desorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-MS)6. Utilizando medidas de massa de alta precisão e fragmentação de MS, a MS fornece a capacidade de atribuir sequência de aminoácidos e status de modificação pós-translacional (PTM) a neuropeptídeos de misturas complexas sem conhecimento a priori para ajudar na verificação de sua função 7,8. Além das informações qualitativas, a MS permite informações quantitativas de neuropeptídeos por meio de quantitação sem rótulos (LFQ) ou métodos baseados em rótulos, como rotulagem isotópica ou isobárica9. As principais vantagens do LFQ incluem sua simplicidade, baixo custo de análise e diminuição das etapas de preparação da amostra que podem minimizar a perda de amostras. No entanto, as desvantagens do LFQ incluem o aumento dos custos de tempo do instrumento, pois requer múltiplas réplicas técnicas para lidar com o erro quantitativo da variabilidade run-to-run. Isso também leva a uma diminuição da capacidade de quantificar com precisão pequenas variações. Os métodos baseados em rótulos são submetidos a uma variação menos sistemática, pois várias amostras podem ser rotuladas diferencialmente usando uma variedade de isótopos estáveis, combinados em uma amostra, e analisados através de espectrometria de massa simultaneamente. Isso também aumenta o rendimento, embora rótulos isotópicos possam ser demorados e caros para sintetizar ou comprar. A complexidade espectral do espectro de massa de varredura completa (MS1) também aumenta à medida que o multiplexing aumenta, o que diminui o número de neuropeptídeos únicos capazes de ser fragmentados e, portanto, identificados. Por outro lado, a rotulagem isobárica não aumenta a complexidade espectral no nível MS1, embora introduza desafios para analitos de baixa abundância, como neuropeptídeos. Como a quantitação isobárica é realizada no nível de espectro de massa de íons de fragmento (MS2), neuropeptídeos de baixa abundância podem ser incapazes de ser quantificados, pois componentes matriciais mais abundantes podem ser selecionados para fragmentação e aqueles selecionados podem não ter abundância alta o suficiente para serem quantificados. Com rotulagem isotópica, a quantitação pode ser realizada em todos os peptídeos identificados.
Além da identificação e quantificação, as informações de localização podem ser obtidas pela MS através de imagens MALDI-MS (MALDI-MSI)10. Ao rasterar um laser através de uma superfície de amostra, os espectros ms podem ser compilados em uma imagem de mapa de calor para cada valor m/z . Mapear a intensidade do sinal de neuropeptídeo transitório em diferentes regiões em condições pode fornecer informações valiosas para a determinação da função11. A localização de neuropeptídeos é especialmente importante porque a função neuropeptídeo pode diferir dependendo do local12.
Neuropeptídeos são encontrados em menor abundância in vivo do que outras moléculas de sinalização, como neurotransmissores, e assim requerem métodos sensíveis para detecção13. Isso pode ser alcançado através da remoção de componentes de matriz de maior abundância, como lipídios11,14. Considerações adicionais para a análise de neuropeptídeos precisam ser feitas quando comparadas aos fluxos de trabalho proteômicos comuns, principalmente porque a maioria das análises neuropeptidômicas omitem a digestão enzimática. Isso limita as opções de software para análise de dados de neuropeptídeos, pois a maioria foi construída com algoritmos baseados em dados de proteômica e correspondências de proteínas informadas pela detecção de peptídeos. No entanto, muitos softwares como o PEAKS15 são mais adequados à análise de neuropeptídeos devido às suas capacidades de sequenciamento de novo. Vários fatores precisam ser considerados para a análise de neuropeptídeos a partir do método de extração à análise de dados em MS.
Os protocolos descritos aqui incluem métodos para preparação de amostras e rotulagem isotópica de dimetila, aquisição de dados e análise de dados de neuropeptídeos por LC-ESI-MS, MALDI-MS e MALDI-MS. Através de resultados representativos de vários experimentos, demonstra-se a utilidade e a capacidade desses métodos de identificar, quantificar e localizar neuropeptídeos de caranguejos azuis, Callinectes sapidus. Para entender melhor o sistema nervoso, os sistemas de modelos são comumente usados. Muitos organismos não têm um genoma totalmente sequenciado disponível, o que impede a descoberta abrangente de neuropeptídeos no nível do peptídeo. Para mitigar esse desafio, está incluído um protocolo de identificação de novos neuropeptídeos e mineração de transcriptome para gerar bancos de dados para organismos sem informações completas do genoma. Todos os protocolos aqui apresentados podem ser otimizados para amostras de neuropeptídeos de qualquer espécie, bem como aplicados para a análise de quaisquer peptídeos endógenos.

<table><tbody><tr><td><forte>Produtos Químicos, Reagentes e Consumíveis</forte></td><td></td><td></td><td></td> matriz</tr> <tr><td>de ácido 2,5-dihidroxibenzóico (DHB)</td><td>Supelco</td><td>39319</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38S-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila Optima LC/MS grau</td><td>Fisher Chemical</td><td>A955-500</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Borano piridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179752</td><td></td></tr><tr><td>mistura de calibração de peptídeos Bruker</td><td>Bruker Daltonics</td><td>NC9846988</td><td></td></tr><tr><td>1068150019 capilar</td><td>polimicro</td><td></td><td>para fazer coluna de nanofluxo (75 &micro; m diâmetro interno x 360 &micro; m diâmetro externo)</td></tr><tr><td>Copo de criostato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6032</td><td>qualquer copo ou molde deve funcionar</td></tr><tr><td>&nbsp; Tubos de Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>30108434</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído - D2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492620</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico Optima LC/MS grau</td><td>Fisher Chemical</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Difco</td><td>214340</td><td>lugar em 37 &deg; C banho-maria para derreter</td></tr><tr><td>Caneta de barreira hidrofóbica</td><td>Vector Labs</td><td>15553953</td><td></td></tr><tr><td>lâminas de vidro revestidas com óxido de índio e estanho (ITO)</td><td>Delta Technologies</td><td>CB-90IN-S107</td><td>25 mm x 75 mm x 0,8 mm (largura x comprimento x espessura)</td></tr><tr><td>Frascos LC-MS</td><td>Thermo</td><td>TFMSCERT5000-30LVW</td><td></td></tr><tr><td>Metanol Optima LC/MS Grau</td><td>Fisher Chemical</td><td>A456-500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td> Tiras indicadoras de pH <td>de filme hidrofóbico</td></tr><tr><td></td><td>Supelco</td><td>109450</td><td></td></tr><tr><td>Aglomerados de fósforo vermelho</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>343242</td><td></td></tr><tr><td>Fase reversa C18 Material</td><td>As águas</td><td>186002350</td><td>embaladas manualmente na coluna de nanofluxo</td></tr><tr><td>Caneta Wite-out</td><td>BIC</td><td>150810</td><td></td></tr><tr><td>ZipTip</td><td>Millipore</td><td>Z720070</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos e Ferramentas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de pulverizador de matriz automática- M5</td><td>HTX Technologies, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga - 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>05-401-205</td><td></td></tr><tr><td>Criostato- HM 550</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>956564A</td><td></td></tr><tr><td>Drierita</td><td>Dessecante</td><td>2088701</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>WPI</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>MALDI placa alvo de aço inoxidável</td><td>Bruker Daltonics</td><td>8280781</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite XLS</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td>200 &micro; L</td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Híbrido Quadrupole-Orbitrap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>RapifleX MALDI-TOF/TOF</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac - SVC100</td><td>Savant</td><td>SVC-100D</td><td></td></tr><tr><td>Limpador Ultrassônico</td><td>Bransonic</td><td>2510R-MTH</td><td>para sonicação</td></tr><tr><td>Homogeneizador ultrassônico</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120110</td><td>FB120 Sonic Dismembrator com CL-18 Probe</td></tr><tr><td>Bomba de vácuo - Alcatel 2008 A</td><td>Ideal Vacuum Products</td><td>P10976</td><td>pressão final = 1 x 10-4</td></tr><tr><td>Torr Vortex Mixer</td><td>Corning</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria (37C) - Isotemp 110</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-460-10</td><td></td></tr><tr><td>Software de Análise de Dados</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expasy</td><td>https://web.expasy.org/translate/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>FlexAnalysis</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlexControl</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlexImaging</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEAKS Studio</td><td>Bioinformatics Solutions, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratório SCiLS</td><td>https://scils.de/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SignalP 5.0</td><td>https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tBLASTn</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMAS=tblastn& PAGE_ TYPE=BlastSearch& SHOW_ DEFAULTS=on& LINK_LOC =blasthome</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

investigação espectrométrica de massa multifacetada de neuropeptídeos em callinectes sapidus

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Neuropeptídeos são moléculas de sinalização que regulam quase todos os processos fisiológicos e comportamentais, como desenvolvimento, reprodução, ingestão de alimentos e resposta a estressores externos. No entanto, os mecanismos bioquímicos e o complemento completo dos neuropeptídeos e seus papéis funcionais permanecem mal compreendidos. A caracterização desses peptídeos endógenos é dificultada pela imensa diversidade dentro dessa classe de moléculas sinalizadoras. Além disso, neuropeptídeos são bioativos em concentrações 100x - 1000x inferiores aos neurotransmissores e são propensos à degradação enzimática após a liberação sináptica. A espectrometria de massa (MS) é uma ferramenta analítica altamente sensível que pode identificar, quantificar e localizar analitos sem conhecimento a priori abrangente. É adequado para traçar neuropeptídeos globalmente e ajudar na descoberta de novos peptídeos. Devido à baixa abundância e alta diversidade química desta classe de peptídeos, vários métodos de preparação de amostras, parâmetros de aquisição de EM e estratégias de análise de dados foram adaptados a partir de técnicas de proteômica para permitir a caracterização ideal do neuropeptídeo. Aqui, são descritos métodos para isolar neuropeptídeos de tecidos biológicos complexos para caracterização, quantitação e localização de sequências usando cromatografia líquida (LC)-MS e desorpção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI)-MS. Um protocolo para preparar um banco de dados de neuropeptídeo do caranguejo azul, Callinectes sapidus, um organismo sem informações genômicas abrangentes, está incluído. Esses fluxos de trabalho podem ser adaptados para estudar outras classes de peptídeos endógenos em diferentes espécies usando uma variedade de instrumentos.

O fluxo de trabalho para preparação da amostra e análise de MS é retratado na Figura 1. Após a dissecção do tecido neuronal, a homogeneização, extração e dessacração são realizadas para purificar amostras de neuropeptídeos. Se a quantificação isotópica à base de rótulo for desejada, as amostras ão então rotuladas e desálvadas mais uma vez. A amostra resultante é analisada através de LC-MS/MS para identificação e quantificação de neuropeptídeos.
Neuropeptídeos iden...

A caracterização espectrométrica em massa dos neuropeptídeos fornece informações de sequência, quantitação e localização. Este fluxo de trabalho otimizado não é apenas útil para estudos de neuropeptídeos, mas também para outros peptídeos endógenos. Os protocolos aqui fornecidos descrevem a preparação da amostra, aquisição de MS, análise de MS e geração de neuropeptídeos de banco de dados usando LC-ESI-MS, spotting MALDI-MS e imagens MALDI-MS.

Investigação espectrométrica de massa multifacetada de neuropeptídeos em Callinectes sapidus

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and ...

A análise de peptídeos endógenos, que são menores que a maioria das proteínas, mas maiores do que muitos peptídeos digeridos é um campo sob análise. Este protocolo aborda a scap em fluxos de trabalho baseados em espectrometria de massa. A espectrometria de massa é altamente sensível e pode ser usada para atingir neuropeptídeos específicos de interesse ou pode capturar e detectar uma gama de neuropeptídeos dentro de uma amostra.A quantitação e localização da expressão de neuropeptídeo por espectrometria de massa pode levar ao desenvolvimento de terapêutica de peptídeos e à descoberta de biomarcadores de neuropeptídeos para várias doenças. Para começar, a extração de neuropeptídeos coleta tecido cerebral do crustáceo e usando fórceps imediatamente coloque um tecido cada um em um tubo de 0,6 mililitro contendo 20 microliters de metanol acidificado. Adicione 150 microliters de metanol acidificado à amostra.Defina o tempo total do paciente Sonic para 24 segundos, tempo de pulso para oito segundos. Pausar o tempo para 15 segundos uma amplitude de 50% em um homogeneizador ultrassônico e homogeneizar as amostras no gelo. Centrifugar a amostra a quatro graus Celsius a 20.000 GS por 20 minutos.Com uma pipeta transferiu o supernasal para um tubo e secou-o em um concentrador de vácuo a aproximadamente 35 graus Celsius. Para desalar reconstituir a amostra de tecido extraído em 20 microlitres de ácido fórmico de 0,1%. Vórtice a solução e sonicate em um banho de água de temperatura ambiente por um minuto.Aplique 0,5 microliters de amostra em uma tira de pH para confirmar que o pH é menor que quatro. Centrífuga a 4 graus Celsius e 20.000 GS por 30 segundos. Prepare a lavagem de equilíbrio de molhar em soluções de ilusão.Obtenha uma ponta de desalar 10 microliter com resina C18. Coloque a ponta de desalado em uma pipeta de 20 microliteres que está definida para 15 microliters. Aspire a ponta três vezes com solução de molhar e três vezes com solução de colaboração equi.Aspirar na amostra 10 vezes seguido de lavar três vezes na solução de lavagem descartando cada lavagem. Elute aspirando 10 vezes em cada uma das soluções de ilusão para aumentar a Acetonitrila. Seque os neuropeptídeos aludidos em um concentrador de vácuo.Reconstitua os neuropeptídeos dessacados secos em cinco microlitres de ácido fórmico de 0,1%. Vórtice a solução e sonicate-lo em um banho de água de temperatura ambiente por um minuto. Centrífuga breve a 2000 GS. Para detectar neuropeptídeos e tecidos de crusta, pipeta uma gota de três microliter de amostra em um filme hidrofóbico.Pipeta três microliters de matriz DHB diretamente na gotícula amostral. Misture as soluções com tubulação para cima e para baixo. Pipeta um microliter da mistura de amostra e matriz em um poço da placa de aço inoxidável MALDI e use a ponta pipeta para espalhar cada mistura para as bordas da amostra bem.Localmente um microliter de calibre um para um e mistura de matriz em um poço perto da amostra. Insira a placa-alvo contendo manchas de amostra seca no instrumento de tempo de voo MALDI tandem. Com a matriz DHB definida a potência laser para 95%Selecione o ganho automático do detector ideal e o modo de movimento inteligente do portador da amostra completa.Adquira o MS Spectra na faixa de 200 a 3.200 M sobre Z e adicione vários espectros de cada ponto juntos para aumentar o sinal de neuropeptídeo para a relação ruído. Encha meio copo criostat com gelatina e deixe-o solidificar à temperatura ambiente. Mantenha a gelatina líquida restante quente em um banho de água de 37 graus Celsius.Colete tecido neuronal desejado do animal e use fórceps para mergulhar imediatamente o tecido em um tubo de 0,6 mililitro contendo água deionizada por um segundo. Coloque o tecido em cima da gelatina sólida e encha o resto do copo criostat com gelatina líquida. Use fórceps para posicionar o tecido.Coloque o copo criostat em uma superfície plana e congele com gelo seco. Para a preparação da secção, separe a amostra embutida de gelatina do molde criostat, cortando o molde. Monte o tecido incorporado em um mandril criostat, canalizado uma gota de um mililitro de água desionizada no mandril e pressione imediatamente o tecido incorporado na gotícula.Uma vez congelada, mais água deionizada ao redor do tecido para fixá-la ainda mais no mandril. Selado o tecido com uma espessura aproximada de uma célula. O polegar monta cada seção em um slide de vidro revestido de óxido de lata de índio colocando um lado do slide perto da seção e colocando um dedo do outro lado do slide para aquecer lentamente o vidro e permitir que a seção grude no slide.Exportar de Novo apenas peptídeos. CSV de picos com pontuação média de confiança local maior ou igual a 75. Pesquise na lista de peptídeos por motivos de sequência conhecidos indicativos de neuropeptídeos pertencentes a famílias específicas de neuropeptídeos.Escolha uma sequência de aminoácidos hormonais pré-pro conhecidos e use a explosão de TB N para pesquisar a sequência hormonal pré-pro de consulta contra um banco de dados. Selecione o organismo alvo e altere os parâmetros do algoritmo limiar até 1000 para incluir alinhamentos de pontuação baixa. Execute o programa de explosão e, em seguida, verifique os resultados para obter altos escores de escoologia entre consultas e sequências de assunto produzindo alinhamentos significativos.Salve o arquivo FASTA contendo sequência de nucleotídeos. Traduza a sequência de nucleotídeos hormonais pré-pro em sequências de peptídeos hormonais pré-pro usando a ferramenta de tradução expasy. Para chamadas sapidus selecione mitocondrial invertebrado para código genético e execute a ferramenta.Verifique se há sequência de peptídeos de sinal e locais de decote pro hormonal nas sequências de peptídeos usando sinal P.Este é um espectro de fragmentação de um neuropeptídeo identificado com cobertura de sequência de 100% em um erro de massa de fragmento baixo com um limite máximo de 0,02 Dalton. Aqui está um espectro de um neuropeptídeo também identificado com cobertura de 100%, mas com um baixo número de íons fragmentários, portanto a confiança da identificação é baixa. Estes são os cromatógrafos de íons extraídos para um único neuropeptídeo que foi identificado em duas corridas separadas e consecutivas.Embora o tempo de retenção difere ligeiramente, isso ainda pode ser usado para quantificação sem rótulo, porque a mudança de tempo é inferior a um minuto. Este é um exemplo de um espectro de massa de varredura completa contendo um neuropeptídeo que foi rotulado dimetil resultando em uma mudança de massa dalton 4.025 entre as formas leves e pesadas do neuropeptídeo. O espectro de massa de íons fragmentos de um peptídeo sequenciado de De Novo demonstra boa cobertura de fragmentação, onde íon de fragmento B e ou Y foi observado para cada aminoácido com um erro de massa baixo de 0,02 Dalton.Isso indica que foi observado um peptídeo endógeno pertencente à família de neuropeptídeos RYMI crustáceos. Exemplos de bons pontos que tocam todas as bordas da gravação do poço são mostrados à esquerda. E exemplos de pontos ruins são mostrados à direita.Após a imagem MALDI MS de neuropeptídeos de tecidos de callinectes sapidus, foram obtidas imagens de distribuição de íons de vários valores M sobre Z correspondentes a diferentes neuropeptídeos. A otimização do solvente de extração para um determinado tipo analy é crucial. Também garantir a homogeneização completa e ajustar o método conforme necessário.Nada será detectado rio abaixo se não for extraído. Esta técnica pode fornecer uma lista fundamental de neuropeptídeos importantes que podem ser ainda mais investigados como potenciais biomarcadores, bem como fornecer informações de localização não-marcadas sem a necessidade de anticorpos.

multi-faceted-mass-spectrometric-investigation-neuropeptides

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

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A parede celular bacteriana é composta de peptidoglycan, uma rede macromolecular de fios de açúcar cruzados por peptídeos. A Cromatografia Líquida Ultra Performance fornece alta resolução e throughput para novas descobertas da composição peptidoglycan. Apresentamos um procedimento para o isolamento das paredes celulares (sacculi) e sua posterior preparação para análise via UPLC.

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Imagiologia por espectrometria de massa (MSI) é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para descobrir e identificar várias espécies químicas em tecidos intactos, preservando os compostos em seus ambientes nativos, que pode fornecer novos insights sobre processos biológicos. Aqui um método MSI desenvolvido para a análise de moléculas pequenas é descrito.

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É apresentado um método para análise de espectrometria de massa de peptídeos endógenos em humano líquido cerebrospinal (CSF). Empregando filtração de corte de peso molecular, pre- fracionamento cromatográfico de, análise de espectrometria de massa e uma subsequente combinação de estratégias de identificação do peptide, foi possível expandir o conhecido peptidome CSF quase dez vezes em comparação a estudos anteriores.

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Este protocolo abrange uma análise detalhada da composição de peptidoglicanos usando cromatografia líquida, espectrometria de massas acoplada com extração avançada de recursos e software de análise bioinformática.

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Descrevemos aqui uma caracterização proteômica baseada em espectrometria de massa de linhagens celulares com destino tecidual conhecido no embrião do vertebrado Xenopus laevis .

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Modificações pós-translacionais (PTMs) alteram estruturas e funções proteicas. Métodos para o enriquecimento simultâneo de vários tipos de PTM podem maximizar a cobertura nas análises. Apresentamos um protocolo utilizando cromatografia de afinidade metálica ti(IV) automobilizada duplamente, seguida de espectrometria de massa para o enriquecimento simultâneo e análise da proteína N-glicosilação e fosforilação em tecidos pancreáticos.

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Aprenda a análise espectrométrica de massa de neuropeptídeos em Callinectes sapidus. Este método permite quantificação e localização de peptídeos endógenos para pesquisa em neurociência e desenvolvimento de biomarcadores.

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