Microscopia intravital longitudinal usando uma janela de imagem mamária com tampa substituível

A glândula mamária é altamente dinâmica e passa por várias rodadas de remodelação ao longo da vida. Nosso protocolo permite capturar a dinâmica celular que conduz rearranjos teciduais na glândula mamária saudável e doente. Nossa janela de imagem mamária com uma tampa substituível permite realizar imagens intravitais longitudinais da glândula mamária por longos períodos de tempo, até várias semanas.

A tampa substituível da janela de imagem mamária garante condições ideais de imagem em todos os momentos e permite manipulação de tecidos ou administração de medicamentos entre as sessões de imagem. Nosso método não só fornece insights sobre biologia saudável da glândula mamária, mas também nos permite estudar a iniciação e progressão do tumor mamário no nível unicelular. Comece colocando a tampa da janela de imagem mamária em uma superfície estéril e aplicando cola adesiva cianoacrila ao redor de todo o perímetro da tampa da borda.

Coloque cuidadosamente um deslizamento de vidro redondo de 10 milímetros em cima da tampa. Use uma vara de madeira estéril para posicionar o deslizamento da tampa de vidro e aplique alguma força para empurrá-lo para baixo para garantir uma vedação hermética entre o deslizamento da tampa de vidro e a moldura da tampa. Certifique-se de que o vidro não cubra os orifícios nos braços da tampa.

Desinfete as tampas e a janela de imagem mamária submergindo-as em 80% de etanol por pelo menos 30 minutos em uma placa de Petri fechada. Use uma ponta de algodão embebida em acetona para remover o excesso de cola adesiva cianoacrilato no deslizamento da tampa do vidro. Para preparar o rato para a cirurgia, raspe a área ao redor da quarta glândula mamária usando uma lâmina de barbear.

Use o quarto mamilo como marco e remova os cabelos soltos usando fita adesiva. Realize um teste de retirada da pata para verificar se o animal está adequadamente anestesiado. Levante suavemente a pele usando fórceps graefe finos e use uma pequena tesoura de mola para fazer uma incisão diagonal de 10 a 15 milímetros na pele em cima da quarta almofada de gordura mamária Use o quarto mamilo como ponto de orientação e certifique-se de não cortar ou danificar o peritônio ou a glândula mamária.

Separe a pele da almofada de gordura mamária e camadas de tecido subjacente usando dissecção contundente de até cinco a oito milímetros ao redor da linha de incisão para criar um bolso para caber na moldura da janela de imagem mamária. Defina a região de interesse, ou ROI, com base nas características macroscópicas do tecido mamário, incluindo a localização do linfonodo ou uma lesão tumoral. Tente manter o ROI central no que diz respeito à incisão.

Pegue a janela de imagem mamária usando fórceps estéreis e teste se a incisão é grande o suficiente para inserir a janela. Se necessário, amplie ligeiramente a incisão até que a janela de imagem mamária se encaixe. Remova a janela e use uma sutura de seda 5-0 para colocar uma sutura de corda de bolsa de uma a dois milímetros de distância da borda da incisão começando da extremidade caudal e de fora para dentro da pele.

Mova aproximadamente cinco milímetros ao longo da incisão e passe o fio de sutura através da pele de dentro para fora. Repita este procedimento ao longo da borda da incisão, criando assim uma sutura circular composta de cinco a seis loops. A saída final da linha de sutura deve estar localizada a aproximadamente dois a cinco milímetros da primeira entrada.

Coloque a janela de imagem mamária dentro da incisão e use os fórceps Graefe para colocar cuidadosamente a pele no sulco da janela. Certifique-se de deixar os laços da sutura lá fora. Puxe os laços da sutura da corda da bolsa e puxe suavemente as duas extremidades da sutura para apertá-la no sulco da janela de imagem mamária.

Amarre com nós cirúrgicos e corte o excesso de rosca. Use um palito para aplicar geleia de petróleo na borda interna da janela, evitando o tecido subjacente. Empurre suavemente a estrutura da janela para baixo com fórceps estéreis e posicione a tampa na moldura da janela.

Isso evitará um volume de ar entre o tecido mamário da glândula e a tampa da janela de imagem mamária. Coloque as pontas das fórceps finas através dos orifícios nos braços da tampa e aperte a tampa torcendo-a no sentido horário. Se algum ar permanecer depois de apertar a tampa, introduza uma agulha de insulina estéril através da pele na cavidade entre o tecido mamário e a tampa e puxe lentamente o êmbolo, criando assim um vácuo entre o tecido da glândula mamária e a tampa da janela de imagem mamária.

Agora, o linfonodo pode ser facilmente observado após este procedimento. Inspecione a condição da estrutura da janela de imagem mamária e da tampa, incluindo a estabilidade das suturas ou qualquer dano potencial à tampa. Posicione o mouse na entrada de tal forma que a janela de imagem mamária caia no orifício da caixa de imagem.

Aplique fita semi-transparente e em papel sobre a parte de trás do mouse para estabilizar o mouse e reduzir o movimento do tecido devido à respiração. Para sessões de imagem superiores a três horas, coloque uma agulha flexível subcutânea no pescoço do mouse e fixe-a com fita de papel. Conecte uma seringa de 10 milímetros com uma mistura de nutrientes a um tubo de silicone flexível e empurre a mistura de nutrientes até chegar ao fim do tubo.

Conecte o tubo de silicone à agulha flexível e injete 50 microliters da solução infundida a cada 30 minutos. Coloque a tampa sobre a caixa de imagem para fechá-la. Em seguida, proteja a caixa de imagem no estágio do microscópio.

Verifique se o mouse está estável dentro da caixa de imagens. Defina a área de interesse usando o modo de epifluorescência do microscópio e aplique as configurações do microscópio. Use a função Espiral no modo navegador de software de imagem para gerar uma grande varredura de ladrilhos e criar um mapa de referência do tecido.

Defina a região de interesses dentro da visão geral da Espiral e, em seguida, defina os planos Z superior e inferior para determinar a pilha Z. Pressione Comece a obter as pilhas Z tridimensionais ou quadridimensionais detalhadas do tecido. Coloque as pontas das fórceps finas através dos orifícios da janela de imagem mamária nos braços da tampa e solte a tampa torcendo no sentido anti-horário.

Alternativamente, o tecido pode ser manipulado ou reposicionado usando fórceps estéreis para otimizar as condições de imagem para a região específica de interesse. Aplique geleia de petróleo na borda interna da janela de imagem mamária, evitando o tecido subjacente. Empurre suavemente a estrutura da janela para baixo com fórceps estéreis e posicione a tampa na moldura da janela.

Por fim, coloque as pontas das fórceps finas através dos orifícios dos braços da tampa e alimente a tampa torcendo-a no sentido horário. Pubertal Rosa26 Cre/ERT2 Rosa26-membrana de tomate-membrana GFP camundongos foram injetados com uma baixa dose de tamoxifeno, levando à recombinação mediada por Cre do alelo GFP de membrana de tomate rosa26. Os camundongos foram imagens nos dias um, três e cinco para acompanhar as mudanças dinâmicas na glândula mamária em desenvolvimento.

As imagens representativas mostram a renderização 3D de um duto mamário alongado e ramificado ao longo de vários dias, imagens através de uma janela de imagem mamária. Imagens únicas de plano Z da ponta de ramificação e do ramo alongamento são mostradas aqui. Células únicas no estroma são destacadas por asteriscos brancos.

As imagens representativas mostram o linfonodo inguinal do mouse retratado através de uma janela de imagem mamária. A segunda geração harmônica é retratada em verde. Imagens renderizadas em 3D de uma estrutura ductal mamária de um rato CFP de membrana e-cadherin feminina adulta durante vários dias consecutivos são mostradas aqui.

O padrão de colágeno I foi usado para refazer o mesmo ROI e o sinal CFP da membrana e-cadherina foi usado para marcar as células ductais. Os ratos verde-vermelhos kikume foram imagens no dia zero antes e depois da exposição à luz violeta. As sessões de imagem foram repetidas nos dias dois, seis e dez após a conversão.

A mesma área da glândula mamária foi imagens através de uma janela de imagem mamária por 10 dias. Regiões menores foram foto-convertidas no dia zero e apresentaram uma taxa de diluição semelhante do sinal vermelho Kikume ao longo do tempo, indicando uma taxa de rotatividade igual em todo o epitélio. Imagens de zoom das regiões indicadas mostram heterogeneidade proliferativa no nível celular seis e 10 dias após a conversão de fotos.

A quantificação da razão vermelho-verde de diferentes células 10 dias após a fotoconversão revelou taxas de diluição altamente variáveis de algumas células dentro do mesmo microambiente ductal. Uma etapa crucial deste procedimento é abrir a tampa entre as sessões de imagem. Esta característica única da janela melhora as condições de imagem e permite imagens longitudinais do tecido.

A janela de imagem mamária com tampa substituível facilitará novas questões sobre in vivo, testes de drogas de ação rápida e triagem no campo de iniciação tumoral e progressão na glândula mamária do camundongo.