Name: Usando a microscopia de 2-fótons para quantificar os efeitos da obstrução ureteral unilateral crônica nos processos glomerulares (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Aprenda a usar microscopia de 2-fótons para quantificar os efeitos da obstrução ureteral unilateral crônica nos processos glomerulares em ratos Munich Wistar Fromter. Esta técnica permite observar interações celulares em tempo real.

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Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais Grants RO1DK091623 e P30DK079312 (para B.A.M.). Agradecemos à equipe do Genomics Core Facility do Research Technology Support Facility (RTSF) da Michigan State University por realizar a análise de nanocordas.

<ol><li>Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Indiana+O%27Brien+center+for+advanced+renal+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Indiana O'Brien center for advanced renal microscopic analysis.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 320 (5), 671-682 (2021).</li>
<li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (3), 905-916 (2002).</li>
<li>Eisenbach, G., Liew, J., Boylan, J., Manz, N., Muir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+angiotensin+on+the+filtration+of+protein+in+the+rat+kidney%3A+a+micropuncture+study%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Effect of angiotensin on the filtration of protein in the rat kidney: a micropuncture study.</a> Kidney International. 8 (2), 80-87 (1975).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+microscopy+as+a+tool+for+studying+renal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology.</a> Methods. 128, 20-32 (2017).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A., Palygin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+imaging+and+microscopy+for+dynamic+processes+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent imaging and microscopy for dynamic processes in rats.</a> Methods in Molecular Biology. 2018, 151-175 (2019).</li>
<li>Huber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+functional+podocin-nephrin+complex%3A+mutations+in+the+NPHS2+gene+disrupt+nephrin+targeting+to+lipid+raft+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains.</a> Human Molecular Genetics. 12 (24), 3397-3405 (2003).</li>
<li>Kawachi, H., Koike, H., Kurihara, H., Sakai, T., Shimizu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+rat+homologue+of+podocin%3A+expression+in+proteinuric+states+and+in+developing+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology+JASN%22%5BJournal%5D)">Cloning of rat homologue of podocin: expression in proteinuric states and in developing glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology JASN. 14 (1), 46-56 (2003).</li>
<li>Roselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+glomerular+filtration+defect+and+severe+renal+disease+in+podocin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Early glomerular filtration defect and severe renal disease in podocin-deficient mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 24 (2), 550-560 (2004).</li>
<li>Schießl, I., Bardehle, S., Castrop, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficial+nephrons+in+BALB%2Fc+and+C57BL%2F6+mice+facilitate+in+vivo+multiphoton+microscopy+of+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Superficial nephrons in BALB/c and C57BL/6 mice facilitate in vivo multiphoton microscopy of the kidney.</a> PloS One. 8 (1), 52499(2013).</li>
<li>Chevalier, R., Forbes, M., Thornhill, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li>
<li>Forbes, M., Thornhill, B., Chevalier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximal+tubular+injury+and+rapid+formation+of+atubular+glomeruli+in+mice+with+unilateral+ureteral+obstruction%3A+a+new+look+at+an+old+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+physiology%22%5BJournal%5D)">Proximal tubular injury and rapid formation of atubular glomeruli in mice with unilateral ureteral obstruction: a new look at an old model.</a> American Journal of Physiology. Renal physiology. 301 (1), 110-117 (2011).</li>
<li>Yang, H. -C., Zuo, Y., Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today.+Disease+Models%22%5BJournal%5D)">Models of chronic kidney disease.</a> Drug Discovery Today. Disease Models. 7 (1-2), 13-19 (2010).</li>
<li>Hackl, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+fate+of+glomerular+epithelial+cells+in+vivo+using+serial+multiphoton+imaging+in+new+mouse+models+with+fluorescent+lineage+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tracking the fate of glomerular epithelial cells in vivo using serial multiphoton imaging in new mouse models with fluorescent lineage tags.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1661-1666 (2013).</li>
<li>Kitching, A., Kuligowski, M., Hickey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+recruitment+to+glomeruli+in+mice+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte recruitment to glomeruli in mice using intravital microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 109-117 (2009).</li>
<li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%3A+twenty-something+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).</li>
<li>El Karoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+stress+drives+proteinuria-induced+kidney+lesions+via+Lipocalin+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum stress drives proteinuria-induced kidney lesions via Lipocalin 2.</a> Nature Communications. 7, 10330(2016).</li>
<li>VA, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Research Notes. 2, 80(2009).</li>
<li>Springer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+transcriptome+and+bioinformatics+approach+to+unilateral+ureteral+obstructive+uropathy+in+the+fetal+sheep+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">A combined transcriptome and bioinformatics approach to unilateral ureteral obstructive uropathy in the fetal sheep model.</a> The Journal of Urology. 187 (2), 751-756 (2012).</li>
<li>Braun, F., Becker, J., Brinkkoetter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+or+let+die%3A+Is+there+any+cell+death+in+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Live or let die: Is there any cell death in podocytes.</a> Seminars in Nephrology. 36 (3), 208-219 (2016).</li>
<li>Kim, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+angiopoietin-1+in+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Electrolyte+%26+Blood+Pressure+E+%26+BP%22%5BJournal%5D)">The role of angiopoietin-1 in kidney disease.</a> Electrolyte & Blood Pressure E & BP. 6 (1), 22-26 (2008).</li>
<li>Liu, F., Zhuang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+receptor+tyrosine+kinase+signaling+in+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of receptor tyrosine kinase signaling in renal fibrosis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 972(2016).</li>
<li>Martini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+biology+identifies+shared+transcriptional+networks+in+CKD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Integrative biology identifies shared transcriptional networks in CKD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 25 (11), 2559-2572 (2014).</li>
<li>Mühlberger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+bioinformatics+analysis+of+proteins+associated+with+the+cardiorenal+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Integrative bioinformatics analysis of proteins associated with the cardiorenal syndrome.</a> International Journal of Nephrology. 2011, 809378(2010).</li>
<li>Satirapoj, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periostin%3A+novel+tissue+and+urinary+biomarker+of+progressive+renal+injury+induces+a+coordinated+mesenchymal+phenotype+in+tubular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology%2C+Dialysis%2C+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Periostin: novel tissue and urinary biomarker of progressive renal injury induces a coordinated mesenchymal phenotype in tubular cells.</a> Nephrology, Dialysis, Transplantation. 27 (7), 2702-2711 (2012).</li>
<li>Fengxin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb+contributes+to+renal+fibrosis+by+promoting+tubular+epithelial+cell+cycle+arrest+at+G2%2FM%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Numb contributes to renal fibrosis by promoting tubular epithelial cell cycle arrest at G2/M.</a> Oncotarget. 7 (18), 25604-25619 (2016).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+glomerular+permeability+of+fluorescent+macromolecules+using+2-photon+microscopy+in+Munich+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50052(2013).</li>
<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (3), 489-494 (2009).</li>
<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+normal+kidney+filters+nephrotic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells%3A+retrieval+is+disrupted+in+nephrotic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The normal kidney filters nephrotic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells: retrieval is disrupted in nephrotic states.</a> Kidney International. 71 (6), 504-513 (2007).</li>
<li>Sandoval, R. M., Wang, E., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+bottom+and+using+it%3A+Offsets+and+sensitivity+in+the+detection+of+low+intensity+values+in+vivo+with+2-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Finding the bottom and using it: Offsets and sensitivity in the detection of low intensity values in vivo with 2-photon microscopy.</a> Intravital. 2 (1), 23674(2014).</li>
<li>Kuligowski, M. P., Kitching, A. R., Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+recruitment+to+the+inflamed+glomerulus%3A+a+critical+role+for+platelet-derived+P-selectin+in+the+absence+of+rolling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte recruitment to the inflamed glomerulus: a critical role for platelet-derived P-selectin in the absence of rolling.</a> Journal of Immunology. 176 (11), 6991-6999 (2006).</li>
<li>Devi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+reveals+a+new+leukocyte+recruitment+paradigm+in+the+glomerulus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus.</a> Nature Medicine. 19 (1), 107-112 (2013).</li>
<li>Finsterbusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patrolling+monocytes+promote+intravascular+neutrophil+activation+and+glomerular+injury+in+the+acutely+inflamed+glomerulus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Patrolling monocytes promote intravascular neutrophil activation and glomerular injury in the acutely inflamed glomerulus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5172-5181 (2016).</li>
<li>Shroff, U. N., Gyarmati, G., Izuhara, A., Deepak, S., Peti-Peterdi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+view+of+macula+densa+cell+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">A new view of macula densa cell protein synthesis.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (6), 689-704 (2021).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse.

O estudo da fisiologia glomerular tem visto muitas abordagens diferentes, mais notavelmente o uso de micropunção, perfusão de glomérulos isolados e microscopia. A disponibilidade de glomérulos de superfície em ratos Wistar de Munique, cepas Fromter e Simonsen, permitiu estudos dinâmicos in vivo. Uma observação importante para os pesquisadores que adotam essa tecnologia é a necessidade de definir parâmetros de aquisição para manter imagens consistentes entre os estudos, de modo que a autofluorescência no tecido permaneça consistente. Utilizar um cubo de epifluorescência de fluoresceína / rodamina de passagem dupla e ajustar as configurações de ganho aos canais de emissão verde e vermelho para imitar na tela do computador o que é visto através das oculares garantirá uma assinatura de cor consistente na autofluorescência, mesmo entre diferentes sistemas de microscópio.
A cepa de Fromter tem sido amplamente utilizada, pois apresenta um número reduzido de glomérulos totais, ~75% normais, e os homens desenvolvem espontaneamente hipertensão por volta das 12 semanas de idade, com proteinúria progressiva e subsequente esclerose glomerular focal, eventualmente morrendo de insuficiência renal12. O uso desses ratos e a adição da microscopia de 2 fótons com sua fototoxicidade reduzida, maior profundidade de penetração e capacidade de visualizar múltiplas sondas fluorescentes simultaneamente abriram caminho para novas descobertas 1,4,5. Com o desenvolvimento de hardware e software de computador, os dados quantitativos são agora o padrão para todos os laboratórios de 2 fótons. Múltiplas técnicas quantitativas têm sido desenvolvidas e aplicadas aos processos glomerular, túbulo proximal, vascular e intersticial em condições fisiológicas e de doença 1,4,5,27,28,29,30.
As instalações geradoras de camundongos transgênicos adicionaram uma nova dimensão ao estudo da fisiologia e patologia renal, e era apenas uma questão de tempo até que isso fosse combinado com a microscopia de 2 fótons para delinear ainda mais a importância de produtos genéticos específicos na estrutura e função renal. No entanto, os glomérulos de camundongos, exceto em camundongos muito jovens, estão localizados a mais de 100 μm da superfície do rim9. A microscopia de dois fótons é melhor realizada a uma profundidade entre 20 e 50 μm como resolução, e a intensidade da fluorescência diminui rapidamente a partir de então devido ao espalhamento da luz emitida e à absorção da interação com a hemoglobina. Portanto, foi necessário induzir glomérulos superficiais. A abordagem comumente utilizada é um modelo de obstrução unilateral prolongada por 12 semanas. Como esses modelos não permitem determinações de linha de base, a separação dos efeitos da UUO do processo que está sendo estudado não é possível.
Usando ratos MWF, pode-se comparar a função glomerular basal com a seguinte UUO. Sabe-se que esse modelo UUO induz inflamação e uma rápida taxa de fibrose e tem sido utilizado para estudar DRC e fibrose10,11,12. Como esperado, houve um aumento nos glomérulos superficiais em ratos MWF e SD. Além disso, os resultados quantitativos obtidos após a UUO para os ratos MWF e SD foram muito comparáveis. A redução do fluxo sanguíneo aqui registrada havia sido relatada anteriormente comparando dados microscópicos após UUO com dados de micropunção3. Também foi sabido que a histologia tubular e intersticial está marcadamente alterada, e os TPs são, em sua maioria, não funcionais, como aqui relatado, com ausência de endocitose albumina. Os estudos da Figura 2 e da Figura 3 mostram uma redução drástica na taxa de fluxo de hemácias nos capilares glomerular e peritubular e maior adesão aos leucócitos. As reduções no fluxo são provavelmente devidas ao bloqueio capilar da adesão leucocitária e formações de rouleaux.
Para avaliar melhor a inflamação, quantificamos a permeabilidade à albumina e mostramos que ela aumenta dez vezes. Além disso, glomérulos isolados mostraram que a expressão de mRNA aumentou para muitos genes anteriormente conhecidos por estarem aumentados na inflamação renal em uma variedade de estados de doença renal 17,19,20,21,22,23,24,25,26 . Os aumentos na densidade da superfície glomerular e na permeabilidade à albumina foram progressivos, como mostram os dados de UUO de 12 semanas. Os dados atuais são os primeiros a mostrar diretamente que os glomérulos sofrem danos estruturais significativos, inflamação e alterações moleculares no modelo UUO. Os resultados são consistentes com um estudo anterior de tecido renal inteiro que analisou biópsias renais de ovelhas após UUO, encontrando múltiplos marcadores de inflamação elevados19. Os presentes resultados indicam que existe inflamação acentuada dentro dos glomérulos, anteriormente conhecida apenas para o tecido cortical.
Os presentes dados diferem de estudos anteriores em camundongos, onde não foram encontradas alterações na expressão da molécula de adesão, deposição de complemento e infiltração de neutrófilos entre glomérulos pós-hidronefróticos e normais de 12 semanas31. Além disso, o laboratório Hickey usou o modelo UUO de 12 semanas para estudar reações imunes em glomérulos de camundongos. Não encontraram diferenças na infiltração de neutrófilos entre glomérulos de camundongos de quatro semanas de idade e glomérulos pós-obstrutivos32,33. Estes estudos posteriores foram realizados depois que a pelve do rim obstruído foi drenada de urina. Não fizemos isso, pois queríamos determinar o efeito da UUO na função glomerular como seria in vivo, sem remover artificialmente o fluido causador da obstrução. Finalmente, o uso de UUO em camundongos está sendo substituído por glomérulos de imagem a mais de 100 μm abaixo da superfície. Embora possível, há um trade-off de resolução e intensidade, ambos sendo reduzidos significativamente à medida que se vai além de 50 μm34.
Os resultados apresentados não surpreendem se juntarmos os dados da literatura existente sobre alterações histológicas, formação de glomérulos atubulares, inflamação, fibrose, hemodinâmica10,11,12. Os dados apresentados, incluindo adesão leucocitária, formações rouleaux, marcadores de inflamação molecular glomerular e aumento da permeabilidade à albumina, indicam ainda a extensa inflamação que está em curso neste modelo UUO mesmo às cinco semanas e também presente às doze semanas. Claramente, a UUO crônica não é um estado fisiológico, e o uso de UUO para induzir glomérulos superficiais representa um modelo de lesão. Os ratos MWF, que apresentam glomérulos superficiais em condições fisiológicas, podem ser estudados longitudinalmente à medida que a lesão ocorre. É possível gerar ratos transgênicos, e numerosos pesquisadores estão criando-os com biossensores para fazer perguntas específicas. Em particular, a Faculdade de Medicina de Wisconsin agora tem uma colônia de ratos MWF e fez ratos transgênicos com a finalidade de estudar processos glomerulares sob condições fisiológicas e patológicas. Esses ratos MWF oferecem uma grande oportunidade para estudar processos glomerulares em ratos normais, doentes e geneticamente alterados.

Compreender os processos glomerulares, especialmente a biologia dos podócitos, tem sido um objetivo há mais de 50 anos. Ratos Wistar de Munique com glomérulos de superfície têm desempenhado um papel central nesses estudos, incluindo estudos de micropunção, para compreender inúmeros aspectos dos processos fisiológicos e patológicos 1,2,3. A utilização da microscopia para o estudo intravital dos componentes glomerulares foi limitada devido aos efeitos da fototoxicidade até o advento da microscopia de 2 fótons que minimizou essa exposição tóxica e aumentou a profundidade de penetração 1,2. Juntamente com os rápidos avanços em hardware e software de computador, isso permitiu estudos tridimensionais (3D) e quadridimensionais (tempo) por horas em uma única configuração 1,4,5.
A quantificação do fluxo sanguíneo capilar glomerular, vasoconstrição e dilatação em resposta a drogas, permeabilidade e os efeitos da carga sobre a permeabilidade e inflamação são apenas alguns dos processos glomerulares que têm sido estudados. Além disso, o segmento S1 do túbulo proximal é identificável, e as diferenças no comportamento do epitélio tubular S1 e S2 podem ser quantificadas 1,4. Estudos em camundongos, especialmente com a disponibilidade universal de instalações transgênicas em camundongos, levaram a rápidos avanços na compreensão da biologia molecular dos processos de doenças glomerulares. Proteínas individuais são responsáveis pela disfunção glomerular em estudos knockout, principalmente no que diz respeito à proteinúria 6,7,8. No entanto, a utilização de modelos de camundongos para exames de imagem glomerular tem sido limitada, pois os glomérulos estão mais de 100 μm abaixo da superfície nas numerosas cepasestudadas9.
Isso levou os pesquisadores a desenvolver e utilizar modelos de camundongos, resultando em glomérulos de superfície que podem ser estudados. O modelo mais comum é o uso de UUO completo10,11,12. Ao final do período prolongado de UUO, existem inúmeros glomérulos superficiais em rins de camundongos que podem ser e têm sido estudados13,14. Não houve nenhum estudo de linha de base ou controle nesses estudos em camundongos para determinar os efeitos da UUO prolongada na biologia glomerular. Por se tratar de um modelo grave e prolongado de lesão, resultando em fibrose rápida e destruição cortical10,11,12, levantamos a hipótese de que haveria efeitos sobre os processos e a função glomerular. Para responder a essa pergunta, ratos Munich Wistar Fromter (MWF) com glomérulos superficiais foram usados para estudar parâmetros de controle/basais, e o achado basal foi comparado com estudos glomerulares em ratos MWF após cinco semanas de UUO. Também estudamos ratos Sprague Dawley (SD) que não apresentam glomérulos superficiais após UUO. Os resultados indicam que 5 semanas de UUO em ratos MWF e SD de fato aumentam o número de glomérulos superficiais. No entanto, estes eram glomérulos anormais com alterações acentuadas no fluxo sanguíneo glomerular, inflamação e permeabilidade e tamanho das macromoléculas.

<table><tbody><tr><td>70 &micro; Filtro de células estéreis M</td><td>Corning</td><td>#421751</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m filtro de células estéreis</td><td>Corning</td><td>#421752</td><td></td></tr><tr><td>CA Micro tesoura Modelo 1C300</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>Cat# 72930</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento elétrico</td><td>Sunbeam</td><td>Kroger</td><td></td></tr><tr><td>Manuseio de Fórceps</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>Cat# 72962</td><td></td></tr><tr><td>Kelly Hemostática (reta)</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>Cat#72930</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Invertido Multi-Fóton Leica Dive SP-8</td><td>Leica Microsystems</td><td>Nota: Versão 7.1r1</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai DeepSee laser de titânio-safira</td><td>Spectra-Physics</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mayo Tesoura de Dissecação</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>Cat# 78180-1C3</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph Software de processamento de imagem</td><td>Molecular Dynamics</td><td>Cat# 78266-04</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corportation</td><td>2007 versão</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT RNA Assay Kit</td><td>Invitrogen/ThermoFisher</td><td>Q33140</td><td></td></tr><tr><td>Reptitherm Undertank Heater</td><td>Zoomed</td><td>Amazon</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Cleanup Kit (Colunas de rotação)</td> <td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>RPE buffer</td><td>Qiagen</td><td>1018013</td><td></td></tr><tr><td>Strate-Line Autoclave Tape</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# 11-889-1</td><td></td></tr><tr><td>TRI Reagent</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverwash)</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>Cat# 70665-07</td><td></td></tr></tbody></table>

usando a microscopia de 2-fótons para quantificar os efeitos da obstrução ureteral unilateral crônica nos processos glomerulares

Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes

A aplicação de novos métodos de microscopia a modelos adequados de doenças animais para explorar a fisiologia dinâmica do rim continua a ser um desafio. Ratos com glomérulos superficiais oferecem uma oportunidade única para investigar processos fisiológicos e fisiopatológicos usando microscopia intravital de 2 fótons. A quantificação do fluxo sanguíneo capilar glomerular e a vasoconstrição e dilatação em resposta a drogas, permeabilidade e inflamação são apenas alguns dos processos que podem ser estudados. Além disso, ratos transgênicos, ou seja, podócitos marcados com corantes fluorescentes e outras abordagens de biomarcadores moleculares, fornecem maior resolução para monitorar e quantificar diretamente as interações proteína-proteína e os efeitos de alterações moleculares específicas.
Em camundongos, que não possuem glomérulos superficiais após quatro semanas de idade, a obstrução ureteral unilateral (UUO) por várias semanas tem sido usada para induzir glomérulos superficiais. Como este modelo de indução não permite estudos de linha de base, quantificamos os efeitos da UUO em processos glomerulares no modelo UUO em ratos Munich Wistar Frömter (MWF), que apresentam glomérulos superficiais em condições fisiológicas. O modelo UUO por cinco semanas ou mais induziu alterações significativas na morfologia renal macroscópica, na microvasculatura peritubular e glomerular, bem como na estrutura e função do epitélio tubular. O fluxo de hemácias (hemácias) glomerulares e peritubulares diminuiu significativamente (p < 0,01), provavelmente devido ao aumento significativo da aderência de leucócitos (leucócitos) nos capilares glomerular e peritubular. O coeficiente de peneiramento glomerular da albumina aumentou de 0,015 ± 0,002 em MWFs não tratados para 0,045 ± 0,05 em ratos UUO MWF de 5 semanas de idade. Doze semanas de UUO resultaram em novos aumentos na densidade glomerular de superfície e no coeficiente de peneiramento glomerular (GSC) para albumina. A albumina fluorescente filtrada através dos glomérulos não foi reabsorvida pelos túbulos proximais. Esses dados sugerem que o uso de UUO para induzir glomérulos superficiais limita a capacidade de estudar e interpretar processos glomerulares normais e alterações de doenças.

Aqui, apresentamos um protocolo utilizando microscopia de 2 fótons em ratos Wistar Fromter de Munique com glomérulos superficiais para quantificar os efeitos da obstrução ureteral prolongada na dinâmica e função glomerular.

Usando a microscopia de 2-fótons para quantificar os efeitos da obstrução ureteral unilateral crônica nos processos glomerulares

Applying novel microscopy methods to suitable animal disease models to explore the dynamic physiology of the kidney remains a challenge. Rats with surface ...

Os dados apresentados neste estudo mostram os efeitos dramáticos da obstrução ureteral unilateral sobre a função renal, inflamação e fibrose. Ajuda-nos a compreender os mecanismos fisiopatológicos da obstrução ureteral unilateral. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de estudar as interações célula-célula, eventos subcelulares e associar estrutura e função de forma dinâmica dentro de um rim em funcionamento.A demonstração do procedimento ureteral será feita pela Dra. Silvia Campos-Bilderback, que é cirurgiã em nosso laboratório. Para começar, anestesiar o rato, em seguida, fazer uma incisão ao longo da linha média e localizar o rim esquerdo para separá-lo dos órgãos peritoneais circundantes. Depois de localizar o pedículo renal, compreendendo a artéria renal, a veia renal e o ureter, separe o ureter sem danificar a estrutura delicada.Use fórceps para enrolar e amarrar uma sutura 3-0 ao redor do ureter, em seguida, amarre um nó alguns milímetros em ambos os lados do primeiro nó para garantir a obstrução completa. Uma vez que o ureter está amarrado, feche cuidadosamente as sucessivas camadas musculares e, em seguida, feche o abdômen completamente. Feche a pele externa com grampos cirúrgicos.Para o preparo cirúrgico, coloque o rato anestesiado com uma linha de acesso venoso de demora de lado com o flanco esquerdo raspado voltado para cima plano e reto sobre a mesa. Certifique-se de que as patas dianteiras do rato se tocam umas às outras, assim como as patas traseiras. Uma vez que o rato esteja posicionado, palpar o flanco esquerdo logo abaixo das costelas para sentir o rim e determinar a posição natural no abdômen, em seguida, desenhe uma linha usando um marcador permanente ao longo da área raspada, bissectando o centro do rim em uma orientação nariz-cauda.Use um par de pinças dentadas para agarrar e levantar a pele para cima e apertar a linha de marcador permanente com um par de hemostatos para esmagar a vasculatura subjacente e evitar sangramento. Repita o procedimento para a fina camada muscular externa para minimizar o sangramento. Para fazer a incisão final da fina camada muscular abdominal interna, palpar o rim para estimar o tamanho e a posição e levantar a camada muscular interna com um par de fórceps, em seguida, esmagar uma linha que corta a pele acima do rim com os hemostatos que é aproximadamente 1/3 do tamanho estimado do rim.Enquanto mantém o aperto na camada muscular com a pinça, faça a incisão final. Em seguida, use fórceps em cada mão para segurar e segurar a gordura do rim no polo inferior do rim com uma técnica de mão sobre a mão trabalhando para baixo. Tendo um aperto firme na gordura com uma mão, puxe a gordura e aperte muito suavemente o rim através da incisão.Se o rim não passar, amplie facilmente a incisão. Para identificar os glóbulos brancos ou leucócitos alojados nas alças capilares, administrar a coloração nuclear Hoechst 33342 a 8 microgramas por quilograma de peso do rato através de uma linha de acesso venoso de demora. No microscópio, coloque o rim exposto contra a borda do prato com uma ligeira rotação para que o lado abdominal do rim esteja em contato com o deslizamento da tampa e o lado dorsal esteja voltado para longe da borda.Para minimizar ainda mais o movimento, embale duas almofadas de gaze estéreis 2 por 2 umedecidas com solução salina contra o lado dorsal do rim, reforçando o contato do lado abdominal do rim com a borda. Quando a amostra estiver posicionada, olhe através da ocular do microscópio sob iluminação de epifluorescência usando um cubo FITC de rodamina de dupla passagem. Se um movimento for detectado na posição da amostra, faça pequenos ajustes ajustando a gaze, garantindo que ela não empurre sob o rim.Enrole o rato ligeiramente para que o tórax fique mais longe do prato. Escaneie a superfície do rim usando iluminação de epifluorescência e marque as posições dos glomérulos usando o software associado ao controlador de estágio motorizado. Para cada canal de cor sob iluminação de 2 fótons, pegue um volume 3D raso da parte superior de cada glomérulo marcado para servir como imagem de fundo.Na opção de exibição do software de imagem, use uma pseudopaleta de cores para visualizar as intensidades fracas da fluorescência de fundo das alças capilares glomerulares. Usando um vaso sanguíneo superficial como ponto focal, infundir lentamente a albumina sérica fluorescente Texas Red RAP ou TRRSA enquanto observa o aumento e a queda da fluorescência devido à distribuição sistêmica até que uma intensidade na vasculatura peritubular e alças capilares esteja logo abaixo da saturação. Após 10 minutos, adquira volumes 3D para todos os glomérulos marcados e fotografados em intervalos de 1 micrômetro.Encontre um vaso apropriado, seja um laço capilar ou um vaso peritubular, em seguida, gire a imagem usando a função Rotate, pois a função Line Scan no software de aquisição de imagem requer que o vaso seja perpendicular. Uma vez que a embarcação esteja girada e deitada, selecione a função XT no menu Aquisição e configure-a para digitalizar 4.000 linhas. Colocar a linha transversal ao recipiente a examinar com o plano focal no diâmetro máximo do segmento.Em seguida, clique com o botão esquerdo do mouse na imagem composta colorida e selecione a guia Tirar instantâneo para gerar uma imagem de referência da área onde a varredura de linha foi feita. Clique imediatamente no botão Iniciar para capturar a varredura de linha da embarcação. Posteriormente, importe as varreduras de linha para o software de processamento de imagem para determinar a taxa de fluxo RBC.No menu suspenso Medida, abra a caixa de diálogo Mostrar Estatísticas de Região e selecione a ferramenta Desenho de Linha Única para desenhar uma linha que corresponda à inclinação das sombras do RBC. Depois de observar a largura e a altura da linha, use uma equação para calcular a velocidade e, em seguida, obtenha uma média de cinco cálculos para relatar a velocidade de cada varredura de linha. Centralize um glomérulo no campo de imagem e pegue um conjunto de dados 3D começando na superfície glomerular e terminando em 30 a 35 micrômetros.Use um tamanho de passo de 1 micrômetro na direção Z. Identifique os leucócitos comparando o canal azul de Hoechst com o canal de albumina Texas Red, procurando a exclusão de corante vermelho na alça capilar e uma mancha nuclear correspondente. Se os leucócitos parecerem estáticos em três seções ópticas, defina as células como aderidas e, em seguida, relate os valores como ocorrência por 10 seções ópticas do topo do glomérulo tomadas em intervalos de 1 micrômetro.O número de ratos glomerulares por campo em ratos Wistar Fromter ou MWF de Munique foi aumentado no grupo UUO de 5 semanas do que em ratos não tratados. Ratos Sprague-Dawley, ou ratos SD, passaram de sem glomérulos superficiais para 2,02 por campo após cinco semanas de obstrução ureteral unilateral. Imagens tridimensionais reconstruídas foram observadas para visualizar a superfície renal.A obstrução uretal unilateral de 5 semanas nos ratos SD não resultou em áreas semelhantes ao epitélio tubular normal, como observado no MWF, não tratado e parcialmente em ratos MWF UUO de 5 semanas. No estudo da dinâmica vascular renal, o fluxo sanguíneo renal foi significativamente reduzido nos grupos MWF UUO de 5 semanas e SD em comparação com ratos não tratados. A velocidade dos eritrócitos dentro das alças capilares glomerulares foi significativamente diminuída nos MWF UUO de 5 semanas e nos ratos SD em comparação com os ratos MWF não tratados.Além disso, os ratos MWF não tratados tiveram menos leucócitos por 10 seções ópticas do topo, enquanto o número aumentou em ratos UUO MWF de 5 semanas e ratos UUO SD de 5 semanas. Com obstrução uretal unilateral, observou-se um aumento na permeabilidade à albumina. Um acúmulo de albumina dentro do espaço de Bowman foi intenso após obstrução uretal unilateral.A endocitose do segmento S1 é grande quantidade de albumina, como observado com condições fisiológicas em ratos MWF não tratados. A mesma captação não pôde ser observada em ratos MWF ou SD após 5 semanas de obstrução uretal unilateral. Muitos métodos diferentes, como a repetição de imagens para estudar um processo ao longo do tempo, a fixação de uma área específica para imagens e a subsequente utilização do tecido fixo para realizar microscopia de maior resolução, podem ser feitos em conjunto com essa técnica.A técnica é considerada tecnologia disruptiva. Ele permite que os investigadores respondam a muitas novas perguntas. Ao fazê-lo, novos insights foram fornecidos e dados de mudança de paradigma foram obtidos.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este vídeo demonstra o procedimento para gerar um modelo de camundongo com obstrução ureteral unilateral. O procedimento envolve o corte de um dos ureteres do camundongo para obstruir o fluxo de urina.

Modelo murino de obstrução ureteral unilateral: um procedimento cirúrgico para obstruir o fluxo urinário de um rim em modelos de camundongos

Uma técnica de alta resolução utilizando microscopia intavital 2-fotão para visualizar e quantificar directamente filtração gloemrular nos glomérulos superfície. Este método permite a determinação direta de características de permeabilidade de macromoléculas em estados normais e doentes.

Quantificar glomerular Permeabilidade de Macromoléculas fluorescentes Usando Microscopia 2-Photon em Munique Ratos Wistar

O modelo murino de obstrução ureteral unilateral irreversível (UUO) é apresentado juntamente com o modelo de UUO reversível no qual a obstrução ureteral é aliviada pela anastomose do ureter cortado na bexiga. Esses modelos permitem o estudo da inflamação e cicatrização renal, bem como a remodelação tecidual.

Um modelo murino de irreversível e reversível obstrução ureteral unilateral

Este protocolo descreve um rim completo check-up que deve ser realizado em modelos do rato da doença glomerular. Os métodos permitem análise detalhada funcional, estrutural e mecanicista da função glomerular, que pode ser aplicada a todos os modelos do rato da doença glomerular.

Avaliação da função renal em modelos do rato da doença Glomerular

Apresentamos o uso da microscopia 2-fóton para colocar uma micropipeta no espaço urinário de Bowman em camundongos, combinando 2 técnicas fundamentais da fisiologia renal. Uso da microscopia 2-fóton supera limitações críticas de microscopia convencional para estudos de Fisiologia renal de micropunção.

Micropunção do espaço de Bowman em camundongos facilitada pela microscopia de fóton 2

A combinação da rotulagem do anticorpo, do esclarecimento ótico, e da microscopia de luz avançada permite a análise tridimensional de estruturas ou de órgãos completos. Descrito aqui é um método simples para combinar o Immunolabeling de fatias de rim grossas, o esclarecimento ótico com cinnamate do Ethyl, e a imagem latente confocal que permite o visualização e a quantificação de estruturas tridimensionais do rim.

Esclarecimento ótico e imagem latente do tecido Immunolabeled do rim

Descrevemos um método para avaliar a expressão de microRNA nos rins de camundongos com obstrução ureteral unilateral (UUO) por reação quantitativa em cadeia de polimerase de transcrição reversa. Este protocolo é adequado para estudar perfis de expressão de microRNA renal em camundongos com UUO e no contexto de outras condições patológicas.

Avaliação quantitativa de PCR em tempo real de expressões de microRNA no rim do rato com obstrução ureteral unilateral

O presente protocolo descreve um modelo passo a passo reprodutível de obstrução ureteral unilateral.

Um modelo murino imaturo de obstrução ureteral unilateral reversível

Este protocolo descreve um método para induzir obstrução ureteral unilateral (UUO) em camundongos para estudar a progressão da fibrose tecidual na nefropatia obstrutiva. Inclui procedimentos cirúrgicos, cuidados pós-operatórios e métodos para avaliação da fibrose.

Modelo de obstrução ureteral unilateral para investigação de fibrose intersticial renal

Este artigo fornece instruções detalhadas para permitir que os investigadores realizem obstrução ureteral unilateral reversível em camundongos usando um modelo padronizado que permite a análise dos resultados estruturais e funcionais de longo prazo após a reversão da obstrução ureteral prolongada.

Um modelo de camundongo para avaliar os resultados estruturais e funcionais de longo prazo após a reversão da obstrução ureteral unilateral prolongada

Aprenda a usar microscopia de 2-fótons para quantificar os efeitos da obstrução ureteral unilateral crônica nos processos glomerulares em ratos Munich Wistar Fromter. Esta técnica permite observar interações celulares em tempo real.

Usando a microscopia de 2-fótons para quantificar os efeitos da obstrução ureteral unilateral crônica nos processos glomerulares (Vídeo) | JoVE Journal

Usando a microscopia de 2-fótons para quantificar os efeitos da obstrução ureteral unilateral crônica nos processos glomerulares

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