Name: Extração e Purificação da Proteína FAHD1 do fígado de rim suíno e rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Aprenda a extrair e purificar a proteína FAHD1 de rim suíno e fígado de rato, preservando sua forma fisiológica e atividade catalítica. Este método suporta o desenvolvimento de anticorpos e inibidores farmacológicos de alta qualidade.

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Os autores agradecem muito a assistência técnica de Ayse Öztürk e Eva Albertini. Os camundongos utilizados para a geração de tecido hepático foram mantidos sob a supervisão da Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Instituto de Pesquisa de Envelhecimento Biomédico da Universidade de Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Áustria).

<ol><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+%28FAHD1%29+as+oxaloacetate+decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).</li>
<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+%28FAHD1%29+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).</li>
<li>Kang, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+surveillance+of+pre-malignant+hepatocytes+limits+liver+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development.</a> Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).</li>
<li>Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence%2C+structure+and+function-based+classification+of+the+broadly+conserved+FAH+superfamily+reveals+two+distinct+fumarylpyruvate+hydrolase+subfamilies%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies.</a> Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).</li>
<li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure. 7 (9), London, England. 1023-1033 (1999).</li>
<li>Bateman, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+inferences+from+the+crystal+structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+bound+phosphorus-based+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).</li>
<li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+-+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cellular+senescence+by+eukaryotic+members+of+the+FAH+superfamily+-+A+role+in+calcium+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284(2020).</li>
<li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li>
<li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+induces+senescence+with+a+distinct+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype.</a> Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+crystallization%2C+and+enzyme+assays+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729(2019).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain+Containing+Protein+1+%28FAHD1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molcules%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1).</a> Molcules. 26 (16), 5009(2021).</li>
<li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).</li>
<li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+outline+of+methods+for+protein+isolation+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A simple outline of methods for protein isolation and purification.</a> Endocrinology and Metabolism. 32 (1), Seoul, Korea. 18-22 (2017).</li>
<li>Amer, H. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+proteins%3A+Between+meaning+and+different+methods%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Technologies+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Purification of proteins: Between meaning and different methods).</a> Proteomics Technologies and Applications. , (2019).</li>
<li>Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+extraction+methods+shape+much+of+the+extracted+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 802(2018).</li>
<li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li>
<li>Gallagher, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28SDS-PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Essential+Laboratory+Techniques%22%5BJournal%5D)">SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).</a> Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).</li>
<li>Ahmed, U., Saunders, G. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf</a> (2011).</li>
<li>Sørensen, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+proteins+on+electroblotting+membranes+and+intensification+of+silver+staining+of+proteins+separated+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).</li>
<li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li>
<li>Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography</a> (2022).</li>
<li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli%3A+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 172(2014).</li>
<li>Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli%3A+A+5-year+update%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%3A+A+Publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Passos críticos no protocolo Seguir diretrizes comuns para o manuseio de proteínas é essencial, como trabalhar no gelo e em condições moderadas de pH e sal. O uso de inibidores de protease é benéfico para o método, enquanto o uso de inibidores proteasso é altamente recomendado. Congelar e descongelar a amostra pode sempre resultar em precipitação proteica (pelo menos parcialmente), por isso qualquer alíquota descongelada de lisato de proteína inicial (etapa 2) deve ser processada continuamente sem pau...

A proteína de domínio fah eucariótico 1 (FAHD1) atua como oxaloacetato bifuncional (OAA) decarboxylase (ODx)1 e hidrolase acylpyruvate (ApH)2. Está localizada nas mitocôndrias2 e pertence à ampla superfamília FAH de enzimas 1,2,3,4,5,6. Embora sua atividade de ApH seja apenas de menor relevância, a atividade ODx do FAHD1 está envolvida na regulação do fluxo de ciclo TCA 1,7,8,9. OAA não é apenas necessário para a reação de sinthase citrato central no ciclo do ácido tricarboxílico, mas também age como um inibidor competitivo de succinato desidrogenase como parte do sistema de transporte de elétrons e como metabólito catapleótico. A redução da expressão genética FAHD1 nas células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) resultou em uma redução significativa na taxa de proliferação celular10, e inibição significativa do potencial da membrana mitocondrial, associada a uma mudança concomitante para a glicólise. O modelo de trabalho refere-se à senescência associada à disfunção mitocondrial (MiDAS)11-like fenótipo8, onde os níveis mitocondrial de OAA são fortemente regulados pela atividade FAHD1 1,8,9.
A proteína recombinante é mais fácil de obter através da expressão e purificação de bactérias12 em vez de tecido. No entanto, uma proteína expressa em bactérias pode ser tendenciosa por possível falta de modificações pós-translacionais, ou pode ser simplesmente problemática (ou seja, devido à perda de plasmídeos, respostas de estresse bacteriano, ligações de dissulfeto distorcidas/não formadas, nenhuma ou má secreção, agregação de proteínas, decote protelítico, etc.). Para determinadas aplicações, a proteína precisa ser obtida a partir de lisesto celular ou tecido, a fim de incluir tais modificações e/ou excluir possíveis artefatos. A proteína purificada do tecido suporta o desenvolvimento de anticorpos de alta qualidade e/ou inibidores farmacológicos potentes e específicos para enzimas selecionadas, como para FAHD113.
Este manuscrito apresenta uma série de métodos para a extração e purificação do FAHD1 a partir de fígado de rim suíno e rato. Os métodos descritos requerem cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC), mas de outra forma usam equipamentos de laboratório comuns. Métodos alternativos podem ser encontrados em outros lugares 14,15,16,17. Após a extração total da proteína, o protocolo proposto envolve uma fase de teste, na qual são discutidos sub-protocolos para precipitação de sulfato de amônio e cromatografia de troca iônica (Figura 1). Após a definição desses subtítnicos, a proteína de interesse é extraída através de uma estratégia sequencial usando troca iônica e cromatografia de exclusão de tamanho com FPLC. Com base nessas diretrizes, o protocolo final pode ser adaptado individualmente para outras proteínas de interesse.
<img alt="Fluxo de trabalho de processamento de tecidos: centrifugação, precipitação, cromatografia; Análise de Western Blot." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63333/63333fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: A estratégia global deste protocolo. De cima para baixo: A proteína é extraída de tecidos. A homogeneidade do tecido é preparada, centrifugada e filtrada. Para cada par de amostras supernascidas e derivadas de pelotas, os testes para precipitação de sulfato de amônio e cromatografia de troca iônica (FPLC) precisam ser realizados para sondar para condições ideais. Após a criação desses sub-protocolos, a proteína pode ser extraída através de um procedimento sequencial de precipitação de sulfato de amônio, cromatografia de troca iônica e cromatografia de exclusão de tamanho repetitivo (FPLC) em diferentes concentrações de pH e sal. Todos os passos precisam ser controlados por mancha ocidental. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63333/63333fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m unidades de filtro</td><td>MERCK</td><td>SLGP033RS</td><td>Millex-HP, 0.22 &micro; m, PES 33 mm, não estéril</td></tr><tr><td>0,45 &micro; m unidades de filtro</td><td>MERCK</td><td>SLHP033NS</td><td>Millex-HP, 0.45 &micro; m, PES 33 mm, não estéril</td></tr><tr><td>15 mL Tubos Falcon</td><td>VWR</td><td>734-0451</td><td>tubos centrífugos</td></tr><tr><td>50 mL Tubos Falcon</td><td>VWR</td><td>734-0448</td><td>tubos centrífugos</td></tr><tr><td>Microplaca UV de 96 poços</td><td>Thermo-Fischer</td><td>8404</td><td>UV/VIS transparente de fundo plano 96 placas de poços</td></tr><tr><td>Solução de acrilamida/Bis (40%, proporção 29:1)</td><td>BIO-RAD</td><td>#1610147</td><td>40% de acrilamida/bis-acrilamida, 29:1 (3,3% de reticulante) solução para fundição de géis de poliacrilamida</td></tr><tr><td>&Auml; Sistema KTA FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td> <td>-</td> <td>usando o sistema FPLC da GE Healthcare; existem diferentes versões personalizadas; este trabalho usou o "&Auml; Sistema KTA pure"</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, filtros</td> centrífigos <td>MERCK</td><td>UFC901024</td> 10 kDa <td>para enriquecimento de proteínas; filtro de massa molecular de 10 kDa; 15 mL</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, filtros</td> centrífigos <td>MERCK</td><td>UFC801024</td> de 10 kDa <td>para enriquecimento de proteínas; filtro de massa molecular de 10 kDa; 4 mL</td></tr><tr><td>de sulfato de amônio em pó</td><td>MERCK</td><td>A4418</td><td>sulfato de amônio para biologia molecular, &ge; 99,0%</td></tr> <tr><td>grau de reagente de persulfato de amônio, 98%</td> <td>MERCK</td><td>215589</td><td>Catalisador para polimerização em gel de acrilamida.</td></tr><tr><td>Coomassie Azul brilhante R 250</td><td>MERCK</td><td>1125530025</td><td>Coomassie Azul brilhante R 250 (CI 42660) para eletroforese Marca registrada da Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6,2 (10 g / l, H 2O, 25 &deg; C)</td></tr> <tr><td>Membrana de celulose para tubos de diálise</td><td>MERCK</td><td>D9277</td><td>Membranas de celulose para a troca de tampões via diálise.</td></tr><tr><td>Tubos Eppendof 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>525-1042</td><td>tubos microcentrífugos; autoclavado</td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 Superdex 75 pg</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>28989334</td><td>As colunas pré-embaladas HiLoad Superdex 75 pg são para cromatografia de exclusão de tamanho de alta resolução de proteínas recombinantes</td></tr><tr><td>Membrana PVDF Immun-Blot</td><td>BIO-RAD</td><td>#1620177</td><td>As membranas de PVDF são membranas de blotting de proteínas otimizadas para aplicações fluorescentes e fluorescentes multiplex.</td></tr><tr><td>Célula de Transferência Eletroforética Mini Trans-Blot</td><td>BIO-RAD</td><td>#1703930</td><td>Use a Mini Célula Trans-Blot para blotting rápido de géis pré-moldados e fundidos à mão Mini-PROTEAN.</td></tr><tr><td>Célula de Eletroforese Vertical Mini-PROTEAN Tetra para Mini Géis Pré-moldados</td><td>BIO-RAD</td><td>#1658004</td><td>sistema de eletroforese vertical de 4 gels, inclui montagem de eletrodos, módulo de funcionamento complementar, tanque, tampa com cabos de alimentação, mini barragem de buffer de células.</td></tr><tr><td>As colunas Mono Q 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>17516701</td><td>Mono Q são colunas de cromatografia de troca aniônica forte para análise de proteínas ou polimento de proteínas em pequena escala e alta resolução.</td></tr><tr><td>Mono S 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>17516901</td><td>As colunas Mono S são colunas de cromatografia de troca catiônica forte para análise de proteínas ou polimento de alta resolução em pequena escala de proteínas.</td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 a 180 kDa</td><td>Thermo-Fischer</td><td>26616</td><td>Uma mistura de 10 proteínas coradas de azul, laranja e verde (10 a 180 kDa) para uso como padrões de tamanho em eletroforese de proteínas (SDS-PAGE) e western blotting.</td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de Proteína Pierce BCA</td><td>Thermo-Fischer</td><td>23225</td><td>Um ensaio de proteína de dois componentes, de alta precisão, compatível com detergente para determinação da concentração de proteína.</td></tr><tr><td>Sonificador 250; Disruptor de células ultrassônico com conversor</td><td>Branson-Novos</td><td></td> <td>modelos na https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf</td></tr><tr><td>Imunoglobulinas anti-coelho de suínos/HRP (isolado por afinidade)</td><td>Agilent Dako</td><td>P0399</td><td>O anticorpo usado para conjugação da peroxidase de rábano reage com imunoglobulinas de coelho de todas as classes.</td></tr><tr><td>TEMED, 1,2-Bis (dimetilamino) etano, TMEDA</td><td>MERCK</td><td>T9281</td><td>TEMED (N, N, N &prime; , N&prime; -Tetrametiletilenodiamina) é uma molécula que permite a rápida polimerização de géis de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Rolo do tubo</td><td>-</td><td>-</td><td>Um rolo geral do rotador do tubo; por exemplo, um modelo novo em https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71</td></tr><tr><td>rotador do tubo</td><td>-</td><td>-</td><td>Uma roda geral do rotador do tubo; por exemplo, um modelo novo em https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123</td></tr><tr><td>ULTRA-TURRAX; T 25 digital</td><td>IKA</td><td>0003725000</td><td>Novos modelos na https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/</td></tr></tbody></table>

extração e purificação da proteína fahd1 do fígado de rim suíno e rato

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

Fumarylacetoacetate hydrolase proteína contendo domínio 1 (FAHD1) é o primeiro membro identificado da superfamília FAH em eucariotes, agindo como oxaloacetate decarboxylase em mitocôndrias. Este artigo apresenta uma série de métodos para a extração e purificação do FAHD1 a partir de fígado de rim suíno e rato. Os métodos cobertos são cromatografia de troca iônica com cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC), filtragem de gel preparatório e analítico com FPLC e abordagens proteômicas. Após a extração total da proteína, a precipitação de sulfato de amônio e a cromatografia de troca iônica foram exploradas, e o FAHD1 foi extraído através de uma estratégia sequencial usando troca iônica e cromatografia de exclusão de tamanho. Esta abordagem representativa pode ser adaptada a outras proteínas de interesse (expressas em níveis significativos) e modificada para outros tecidos. A proteína purificada do tecido pode apoiar o desenvolvimento de anticorpos de alta qualidade e/ou potentes e específicos inibidores farmacológicos.

A proteína FAHD1 foi extraída do fígado de rim e camundongo suíno usando o protocolo apresentado. Para o tecido do rato, vários órgãos são necessários para obter vários μg após a etapa final de purificação. Por essa razão, este artigo se concentra na extração do FAHD1 dos rins suínos, que é um experimento muito mais exemplar. A extração de FAHD1 do fígado do camundongo é realizada para apresentar as dificuldades e possíveis armadilhas deste protocolo. É geralmente recomendado o uso de órgãos que mostram um alto nível de ...

Este protocolo descreve como extrair a proteína de domínio de hidrolase 1 (FAHD1) de rim suíno e fígado de camundongo. Os métodos listados podem ser adaptados a outras proteínas de interesse e modificados para outros tecidos.

Extração e Purificação da Proteína FAHD1 do fígado de rim suíno e rato

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

A purificação da proteína recombinante de bactérias é um método bem estabelecido. No entanto, vários problemas podem ocorrer ao usar essas técnicas. Ter métodos para extrair proteína do tecido é certamente atraente.A principal vantagem com este método é que se pode extrair a proteína em sua forma fisiológica, incluindo todos os efeitos mútuos que podem impactar sua atividade dobrável e catalítica. Esta abordagem pode ser adaptada a outras proteínas de interesse e modificada para outros tecidos. A proteína purificada do tecido pode apoiar o desenvolvimento de anticorpos de alta qualidade e inibidores farmacológicos.Para começar, prepare o tampão de proteína lyse misturando 250 mililitros de PBS com flúor de sódio de 50 milimolar, um flúor de fenilmetilsulfonyl milimolar, dois microgramas por aprotinína mililitro e um ortovanadato ativado milimolar. Filtre a solução usando uma unidade de filtro de seringa de 0,22 micrômetros. Prepare tubos com dois mililitros de tampão de lise por grama de tecido e coloque-os no gelo.Para preparar a amostra de tecido, disseque o tecido de cerca de 100 miligramas cada um em uma placa de vidro pré-limpa colocada no gelo em uma caixa de espuma de poliestireno. Transfira os pedaços de tecido para os tubos preparados para a lise subsequente. Para preparar uma solução de sulfato de amônio saturado, aqueça 500 mililitros de água dupla destilada a 70 graus Celsius.Durante a agitação, adicione gradualmente o sulfato de amônio em pó até que não haja mais sulfato de amônio. Esfrie esta solução saturada para a temperatura ambiente e armazene-a a quatro graus Celsius durante a noite. Para homogeneizar os tecidos renais suínos, sonicar a suspensão preferencialmente por uma sonda ultrassônica enquanto mantém a amostra no gelo.No caso dos tecidos hepáticos do rato, use um homogeneizador elétrico e lave-o regularmente em PBS para evitar entupimentos enquanto mantém as amostras no gelo. Tire 20 microlitros das amostras e verifique sob o microscópio se as células do tecido homogeneizado estão devidamente destruídas. Caso contrário, repita a homogeneização.Centrifugar os tubos a 10.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Colete o supernatante em um tubo fresco e coloque-o no gelo. Posteriormente, filtre o supernascer utilizando unidades de filtro de seringa de 0,45 micrômetros e 0,22 micrômetros.Aliquot o supernasal em lotes de 10 mililitros e congele-os a menos 20 graus Celsius para armazenamento a curto prazo ou a menos 80 graus Celsius para armazenamento mais longo. Prepare uma amostra de 50 microliteres para análise de SDS-PAGE ou western blot adicionando 10 microliters de cinco vezes o buffer amostral SDS a 40 microliters do supernante e, em seguida, fervendo a 95 graus Celsius por 10 minutos. Prepare um gel SDS-PAGE de 12,5% de poliacrilamida de 12,5% de poliacrilamida de acordo com as instruções do fabricante.Para realizar a análise SDS-PAGE, carregue os poços do gel posteriormente com uma escada marcador de proteína, cinco nanogramas de proteína recombinante FAHD1 humana como controle positivo, 20 microlitrais da amostra a serem analisados e os demais poços com 20 microliters de tampão de amostra SDS-PAGE preparados. Execute os géis SDS-PAGE a 125 volts usando o buffer de execução SDS. Depois que o SDS-PAGE estiver completo, realize uma análise de manchas ocidentais, teste as membranas usando o anticorpo disponível levantado contra o FAHD1.Depois de preparar alíquotas supernasas como descrito anteriormente, processe após o descongelamento ou processe diretamente após a extração de proteínas sem congelar a amostra. Filtre a amostra usando uma unidade de filtro de 0,22 micrômetro para excluir possíveis precipitados após o descongelamento. Prepare seis tubos de 1,5 mililitro no gelo e transfira 250 microliters de amostra para cada tubo.Prepare uma série de diluição de sulfato de amônio nos tubos preparados e compor o volume final para 1.000 microliter com tampão de proteína. Incubar as amostras a quatro graus Celsius durante a noite em um rotador de tubo. Usando uma centrífuga de mesa, centrífuga a 10.000 vezes G por 30 minutos a quatro graus Celsius e transfira cuidadosamente todos os supernantes em tubos separados.O ar seque as pelotas resultantes e resuspenque cada uma delas em 1.000 microliter de água dupla destilada. Para cada par de pelotas resuspended e supernadante da etapa anterior, misture 40 microliters com 10 microliters de cinco vezes o tampão amostral SDS e ferva a 95 graus Celsius com tampas abertas até que a maior parte do líquido tenha vaporizado. Em seguida, resuspengue a pelota em uma mistura de 50% de sulfóxido de dimetil em água dupla destilada.Execute o SDS-PAGE carregando as amostras derivadas das pelotas resuspended e sobrenantes em pares, seguido por uma análise de manchas ocidentais. No entanto, execute os géis a 80 volts por três horas. Configure o sistema FPLC com a coluna de troca aniônica ou cônica.Lave a coluna com cinco volumes de coluna de 20% de etanol em água dupla destilada, seguida por cinco volumes de coluna de água dupla destilada. Aplique a amostra na coluna por injeção ou usando uma bomba de amostra e colete o fluxo através. Lave a coluna com um volume de coluna do tampão de sal baixo.Configure uma elução linear de gradiente de tampão de sal 100% baixo para tampão de sal 100% alto dentro de três volumes de coluna. Colete continuamente uma fração mililitro. Após o gradiente ter terminado, continue a funcionar com um tampão de sal alto até que não sejam detectados mais picos associados à proteína no cromatografia ao longo da faixa de um volume de coluna.Aplique um mililitro de 25% SDS dissolvido em hidróxido de sódio molar de 0,5 e água dupla destilada para limpar a coluna. Lave consecutivamente a coluna com três volumes de coluna de água dupla destilada e três volumes de coluna de 20% de etanol em água dupla destilada. Colete as amostras de SDS-PAGE de todas as frações de pico e o fluxo.Esperje as frações coletadas em nitrogênio líquido e armazene-as a menos 80 graus Celsius. Depois de sondar-os via mancha ocidental, descongelar e juntar as frações contendo as proteínas de interesse e descartar as outras. Para realizar a etapa de purificação, reduza o volume da solução proteica para dois mililitros usando unidades de filtro de ultra centrifugação.Filtrar sequencialmente a solução com unidades de filtro de seringa de 0,45 micrômetros e 0,22 micrômetros para remover qualquer microprecipitação. Equilibre a coluna de cromatografia de exclusão de tamanho com um volume de coluna de tampão de execução contendo um dithiothreitol milimolar. Coloque a amostra na coluna e execute a unidade de cromatografia até que todas as proteínas sejam elucidadas como descrito anteriormente.Prepare 50 amostras de microliter para análise de SDS-PAGE e western blot descritas anteriormente. Lavar consecutivamente a coluna com uma coluna de volume duplo de água destilada e um volume de coluna de 20% de etanol em água dupla destilada. Depois de realizar a análise de manchas ocidentais, acumule todas as FRAções fahd1 contendo frações.Reduza o volume da solução proteica para dois mililitros usando unidades de filtro de ultra centrifugação. A exibição de manchas ocidentais mostra a presença de fahd1 suíno no supernante com uma banda a 25 kilodaltons, enquanto o controle positivo marcado é executado em 34 kilodaltons. O fahd1 suíno do lysate foi purificado pela cromatografia de troca aniônica e as proteínas de ligação foram removidas por eluição.Frações contendo FAHD1 suínos foram identificadas pela análise de manchas ocidentais, agrupadas e concentradas. As amostras de proteína foram purificadas pela SEC e identificadas pela análise de manchas ocidentais. O rendimento da proteína fahd1 suína foi de cerca de um miligrama com um nível de 80% de pureza.A análise da mancha ocidental detectou a proteína FAHD1 do camundongo no fluxo, juntamente com outras proteínas. O fluxo foi aplicado para a cromatografia de exclusão de tamanho. As frações contendo FAHD1 foram agrupadas, concentradas e aplicadas à análise SDS-PAGE.No entanto, o rendimento da proteína não foi muito alto. A atividade enzimática específica do fahd1 suíno aumenta com o nível de pureza ao aumentar a quantidade relativa de FAHD1 por proteína total. Maiores concentrações de sulfato de amônio causam o efeito sorriso, que pode ser resolvido na menor tensão.Mais proteínas foram encontradas no liseto e sobrenasce na concentração de 15%. No entanto, em concentrações mais elevadas, as amostras podem precipitar-se e não podem ser detectadas. O protocolo aqui apresentado requer que a proteína seja solucionável.As condições ideais para precipitação e pH ou ajuste de tamanho para cromatografia precisam ser testadas e definidas. O estudo da função enzimática, a investigação da estrutura proteica e o desenvolvimento de anticorpos são muito apoiados quando se tem proteína extraída do tecido em vez de extraída de bactérias.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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