Isolamento das Mitocôndrias do Músculo Esquelético do Rato para Ensaios Respirométricos
10 de fevereiro de 2022
Aqui, descrevemos um método detalhado para o isolamento das mitocôndrias do músculo esquelético do camundongo e a análise subsequente da respiração pela Taxa de Consumo de Oxigênio (OCR) usando assins respirométricos à base de microplacas. Este gasoduto pode ser aplicado para estudar os efeitos de múltiplas intervenções ambientais ou genéticas no metabolismo mitocondrial.
Esta palavra descreve a análise de respiração no processamento de mitocôndrias do músculo esquelético do rato. Este protocolo reduz consideravelmente o tempo de purificação e permite que várias amostras sejam processadas simultaneamente. Mitocôndrias de animais de qualquer oito sexo de fundo united podem ser mutiladas usando este protocolo permitindo o estudo da respiração em uma ampla variedade de condições experimentais.
Este método é adequado para todas as áreas de pesquisa onde a função mitocôndria é relevante, incluindo envelhecimento, testes de drogas, câncer ou desenvolvimento. Pode até ser adaptado a outros tecidos e organismos também. Certifique-se de que todos os materiais estão frios colocando tudo no gelo durante o procedimento para proteger mitocôndrias de danos.
Coloque três 50 béquers mililitros por amostra no gelo e adicione 10 mililitros de PBS no béquer um, 10 mililitros de 10 mililitros EDTA PBS no béquer dois, e quatro mililitros IB1 no béquer três. Pulverize o membro traseiro direito de um rato eutanizado com 70% de etanol para evitar que a pele se desça e tape o membro na placa de dissecção da rolha e, em seguida, fita o membro do antedo esquerdo. Faça uma incisão com um bisturi descartável estéril através da pele do joelho aos dedos dos dois.
Segure a pele com fórceps dentadas ao nível do tornozelo e corte-a com uma tesoura fina ao redor do tornozelo. Alivie a pele da musculatura subjacente com pinças finas de ponta em uma mão enquanto puxa-a para cima com fórceps dentados na outra mão. Disseque todos os músculos esqueléticos do tornozelo ao joelho e remova todo o tecido conjuntivo sobre o músculo anterior da tíbia usando pinças finas e tesouras.
Encontre os quatro tendões distais do músculo extensor digitorum longus e selá-los perto de suas inserções nos dedos dos dedos. Localize o tendão distal anterior tibialis e corte-o perto de sua inserção abaixo do tornozelo. Puxe os tendões tibialis anterior e extensor digitorum longus acima do tornozelo para liberar as pontas soltas.
Segure as pontas soltas dos tendões e alivie os músculos para longe do resto da musculatura nos ossos puxando-os para cima. Corte os tendões proximais desses músculos o mais próximo possível da rótula. Vire o rato de cabeça para baixo para prosseguir com extração muscular gastrocnemius e soleus.
Segure o bolso formado entre os bíceps, femoris e gastrocnemius e separe esses músculos usando uma tesoura fina para visualizar o tendão gastrocnemius proximal. Segure e corte cuidadosamente o tendão de Aquiles distal com uma tesoura fina. Corte o tendão gastrocnemius proximal liberando-o com o soleus subjacente.
Disseca cuidadosamente os músculos restantes e recue o mouse na posição inicial para dissecar o músculo quadríceps. Descarte o tecido adiposo e insira pinças finas entre o quadríceps e o fêmur para separar o músculo do osso. Segure os tendões musculares do quadríceps distal e corte o tendão o mais próximo possível da rótula.
Puxe os quadríceps para cima e liberte-os com uma tesoura fina na inserção proximal. Repita o mesmo para o membro traseiro esquerdo. Enxágüe todos os músculos no béquer um, depois dois, seguido por béquer três.
Finalmente, pique todos os músculos em béquer três com uma tesoura afiada no gelo. Transfira a suspensão para um tubo C, feche-a firmemente e coloque-a de cabeça para baixo na manga do homogeneizador. Divida a homogeneidade em dois tubos de micro centrífugas pré-refrigerados de 2 mililitros e centrífuga por 10 minutos.
Em seguida, transfira o supernatante para novos tubos pré-refrigerados e centrífuga por mais 10 minutos. Combine a pelota em 500 microliters de IB2 Transfira o supernascer para um novo tubo de micro centrífuga pré-refrigerado de 2 mililitros e rotule-o como supernatante número dois, ou SN2. Suspender novamente a última pelota mitocondrial em 200 microliters de tampão de suspensão re.
Reserve rapidamente 10 microliters para quantificação de proteínas e adicione imediatamente 10 microliters de 10% FFA BSA à suspensão mitocondrial restante para evitar danos. Centrifugar a suspensão mitocondrial concentrada a 10.500 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Suspender novamente a pelota mitocondrial em 100 microliters de 1X acoplamento médio com BSA, 1X medidor de ensaio de fluxo de elétrons com BSA, ou 1X meio de oxidação beta com BSA, dependendo do protocolo a ser realizado.
Diluir esta amostra mitocondrial concentrada para 0,2 microgramas por microliter utilizando o meio de ensaio correspondente. Semente 50 microliters da suspensão por poço em uma micro placa pré-refrigerada de 24 poços no gelo. Nos poços de correção de fundo, adicione apenas o meio de ensaio correspondente.
Armazene a suspensão mitocondrial restante a menos 80 graus Celsius para determinação de pureza de fragmentação. Gire a micro placa na centrífuga pré-refrigerada por 20 minutos. Enquanto isso, aqueça o ensaio restante médio a 37 graus Celsius.
Após a centrifugação, deixe a micro placa no banco por cinco minutos para equilibrar. Adicione 450 microliters do meio de ensaio quente por poço lentamente e cuidadosamente para evitar o descolamento das mitocôndrias. Coloque a micro placa imediatamente no instrumento de medição de consumo de oxigênio sem a tampa e inicie o programa de medição.
Certifique-se de que o primeiro passo é uma incubação de 10 minutos para permitir que a micro placa aqueça. Uma vez terminado o experimento, remova o cartucho e a micro placa, desligue o instrumento e inicie a análise. Perfis gerais de proteínas das diferentes frações obtidas através de centrífugas seriais mostraram populações proteicas distintas nas frações isoladas.
A presença de todo o conteúdo mitocondrial é evidente pelos fortes sinais de marcadores da membrana mitocondrial externa e interna e proteínas associadas a nucleóides. A fração N representa núcleos e material não rompido. A maioria dos marcadores de tiquelum endoplasmático, membrana plasmática ou citoplasma nas frações SN1 ou SN2 destacam a alta pureza obtida durante o isolamento.
Observou-se aumento no consumo de oxigênio após a adição de ADP nos ensaios de acoplamento e oxidação beta. Após a adição de cianeto-cianeto-p-trifluortotoxy, o consumo de oxigênio atingiu seu nível mais alto. Uma baixa relação de controle respiratório garante a integridade das mitocôndrias isoladas.
O ensaio de fluxo de elétrons examinou a atividade da cadeia de transporte de elétrons se complexa individualmente ou em combinação através da injeção de substratos e inibidores específicos. Mitocôndrias isolando são extremamente sensíveis. Portanto, todas as etapas após a mitigação do tecido precisam ser realizadas com diligência e cuidado para preservar sua viabilidade.
Ensaios experimentais podem ser elogiados com uma análise semática determinística das moléculas-chave das mitocôndrias ou com o estudo da montagem de complexos respirométricos usando eletroforese de gel de poliacrilamida nativa azul.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo aperfeiçoado para o isolamento de mitocôndrias de músculo esquelético de camundongo, seguido pela análise da respiração por meio de avaliações da Taxa de Consumo de Oxigênio (OCR). Este método permite o processamento simultâneo de múltiplas amostras e é aplicável ao estudo do metabolismo mitocondrial sob diversas condições experimentais.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Metabolismo mitocondrial
- Análise da respiração
- Intervenções ambientais e genéticas
Contexto
- Importância das mitocôndrias na regulação da energia celular
- Relevância da função mitocondrial no envelhecimento, testes de fármacos, câncer e desenvolvimento
- Necessidade de protocolos eficientes na pesquisa mitocondrial
Métodos Utilizados
- Ensaios respiratórios baseados em microplacas
- Músculo esquelético de camundongo como sistema biológico
- Protocolo de isolamento com tempo mínimo de purificação
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de frações mitocondriais de alta pureza
- Aumento do consumo de oxigênio observado após a adição de ADP
- Perfis proteicos distintos nas frações mitocondriais isoladas, validando o método
Conclusões
- Este estudo estabelece um protocolo eficiente para o isolamento mitocondrial e análise da respiração.
- Implicações significativas para áreas de pesquisa voltadas para a função mitocondrial e o metabolismo.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a avaliação direta da bioenergética mitocondrial em tecido muscular esquelético fisiologicamente relevante, abordando uma limitação fundamental dos modelos de células cultivadas que podem não refletir as condições in vivo. Ao fornecer um método escalonável para o isolamento de mitocôndrias de alta pureza a partir de tecido de camundongo, ele apoia a desmistificação mecanicista na validação de alvos e nos estudos pré-clínicos de doenças metabólicas, envelhecimento e resposta a fármacos. A abordagem aumenta a confiança preditiva ao vincular a função mitocondrial à fisiologia específica do tecido, orientando decisões de avançar/não avançar nos estágios iniciais de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação funcional de alvos mitocondriais no contexto nativo do tecido, esclarecendo a atividade das vias e o engajamento do alvo.
- Valor Operacional: Apoia a verificação de hipóteses com leituras quantitativas do consumo de oxigênio que refletem a fisiologia mitocondrial específica do tecido.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiabilidade em estudos de modulação de alvos ao reduzir artefatos associados à adaptação em cultura celular.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera medições quantitativas de OCR reprodutíveis, adequadas para a padronização de ensaios em diferentes condições experimentais.
- Valor Operacional: Permite o processamento paralelo de múltiplas amostras, aumentando a produtividade em triagens de compostos e comparações de genótipos.
- Prontidão para Ensaios: Produz mitocôndrias isoladas compatíveis com meios de ensaio de acoplamento, fluxo de elétrons e beta-oxidação, permitindo um design experimental flexível.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Valor Científico: Facilita o estudo da resposta mitocondrial ao envelhecimento, ao sexo, a modificações genéticas e a intervenções farmacológicas em um sistema relevante para doenças.
- Valor Operacional: Permite a análise longitudinal da função mitocondrial ao longo de variáveis experimentais utilizando um protocolo consistente de isolamento.
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas científicas à validação pré-clínica ao manter a integridade mitocondrial específica do tecido.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses sobre alvos até a otimização de compostos líderes, fornecendo dados funcionais sobre mitocôndrias que orientam as decisões de progressão de compostos.
- Biologia de Descoberta: Apoia a desmistificação mecanicista ao validar alvos mitocondriais em músculo esquelético fisiologicamente relevante.
- Triagem: Permite o desenvolvimento de ensaios com preparações mitocondriais padronizadas e de alta pureza, adequadas para formatos respirométricos em multi-poços.
- Análise: Fornece medidas quantitativas de OCR e razões de controle respiratório que permitem comparação objetiva dos estados mitocondriais entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta estudos iniciais de modulação de alvos a desfechos pré-clínicos por meio da preservação da função mitocondrial em tecido nativo.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma de isolamento reutilizável, aplicável em diversas áreas terapêuticas, incluindo metabolismo, neurodegeneração e oncologia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece dados com alta confiabilidade quanto ao alvo, reduzindo a ambiguidade mecanicista em estudos da função mitocondrial.
- Valor Operacional: Aumenta a reprodutibilidade e a escalabilidade por meio do processamento padronizado de tecidos e manipulação simultânea de múltiplas amostras.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir decisões precoces de prosseguimento ou interrupção com base nas respostas mitocondriais específicas de tecidos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de compostos que visam vias mitocondriais em doenças metabólicas e no envelhecimento.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em dissecação de tecidos, isolamento de mitocôndrias e manipulação de ensaios respirométricos.
- Depende do acesso a equipamentos de homogeneização, centrífugas e instrumentação para medição do consumo de oxigênio.
- Necessita da manutenção da cadeia fria durante todo o isolamento para preservar a integridade e função mitocondrial.
- Exige padronização dos protocolos de dissecação e picagem muscular entre operadores e laboratórios.
- Limitado pela necessidade de tecido fresco como material de entrada, o que restringe a armazenagem de amostras e a flexibilidade no processamento em lotes.
