Quantificação de espécies reativas de oxigênio usando 2′,7′-Sonda diacetato de diclorofluoresceína e flução-citometria em células gliais Müller
13 de maio de 2022
Aqui, propomos um protocolo sistematizado, acessível e reprodutível para detectar espécies de oxigênio reativa celular (ROS) usando uma sonda diacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFH-DA) em células gliais Müller (MGCs). Este método quantifica os níveis ros celulares totais com um citómetro de fluxo. Este protocolo é muito fácil de usar, adequado e reprodutível.
Existem vários métodos para medir a produção de ROS, ou estresse oxidativo nas células. Entre estes, a sonda diacetato de 2'7'dichlororescein é uma das técnicas mais utilizadas para medir diretamente o estado de redox. Esta sonda é lipofílica e não fluorescente. A difusão desta sonda através da membrana celular permite que o decote de esteras intracelular nas duas ligações éster, produzindo um produto relativamente polar e imune à membrana celular. Essas moléculas não fluorescentes acumulam-se intracelularmente, e a oxidação subsequente pela ROS produz o produto altamente fluorescente diclorofluoresceína. A oxidação da sonda é o produto da ação de múltiplos tipos de ROS. Que pode ser detectado por citometria de fluxo ou microscopia confocal. Neste artigo, usamos uma sonda diacetato de diclorofluoresceína para medir e quantificar ros por citometria de fluxo. Transfira placas de 6 poços para um capô de fluxo laminar da incubadora. Aspire o supernatante. E lave as células uma vez com PBS. Adicione 2 mL de DMEM de baixo soro por poço. E incubar a placa de 6 poços por duas horas na incubadora. Trate as células com o antioxidante por seis horas. Trate as células com o indutor ROS, A ou B, por 30 minutos. Aspire o supernatante. E lave a célula três vezes com PBS para remover todos os estímulos. Desligue a luz do capô de fluxo laminar e trabalhe na escuridão. Adicione 1 mL de sonda diacetato de diclorofluoresceína em DMEM sem vermelho fenol. Adicione 1 mL de DMEM sem fenol vermelho às células de controle de autofluorescência de controle. Incubar a placa de 6 poços por 30 minutos na incubadora. Transfira as placas no gelo para o laboratório. Lave as células três vezes com 2 mL de PBS frio por poço. Adicione 0,5 mL de tampão de desprendimento a frio a cada poço. Colher as células gentilmente tubos para cima e para baixo usando uma pipeta P1000. Colete-os no tubo de 1,5 mL rotulado. E centrifuá-los a 600 x g por cinco minutos a 4 C.Descarte o supernatante cuidadosamente, e dissocia suavemente a pelota com toques. Adicione 1 mL de tampão FACS para lavar as células em cada tubo rotulado. Se for necessário, use vórtice na menor intensidade para a dissociação completa da pelota. Centrifuá-los a 600 x g por cinco minutos a 4 C.Repita esta etapa duas vezes mais. Três lavagens no total. Pelotas de células resuspend em 200 L de buffer FACS. Dissociar suavemente completamente a pelota em cada tubo usando vórtice. E transfira para 5 mL rotulados para tubos de citómetro de fluxo. Mantenha os tubos no gelo até analisar o citômetro de fluxo. Usando o software de citometria de fluxo, crie um novo experimento. Clique no espécime e abrirá uma lista de tubos. Clique duas vezes e renomeie-os. Coloque o tubo de controle de autofluorescência no braço aspirador, movendo a base cuidadosamente apenas para a esquerda. Clique em Adquirir dados e, em seguida, registo dados e selecione a condição de parada desejada. Desenhe um portão ao redor das células de interesse, excluindo células mortas e detritos. Remova o tubo. Clique no Next Tube e execute a amostra de controle basal. Clique em Adquirir Dados e, em seguida, em Gravar Dados.Abra o software. Adicione as amostras usando o botão Adicionar amostras de ação. Clique em Adicionar amostra.Selecione a pasta Data Experimental e clique em Escolher.Clique duas vezes na primeira amostra em seu espaço de trabalho, controle de autofluorescência neste caso. Desenhe um portão de polígono para isolar a célula de interesse, excluindo células mortas e detritos. Mude o enredo para um histograma. Clique duas vezes dentro do M
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para detectar os níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) celulares utilizando a sonda 2′,7′-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA) em células gliais de Müller (MGCs). O método foi desenvolvido para ser acessível, reprodutível e quantificar ROS por citometria de fluxo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Estresse Oxidativo
- Neurociência
Contexto
- As espécies reativas de oxigênio (ROS) desempenham um papel fundamental em diversos processos celulares.
- A medição de ROS é essencial para compreender o estresse oxidativo em células.
- A sonda DCFH-DA é um método amplamente utilizado para detectar ROS.
- O protocolo enfatiza reprodutibilidade e facilidade de uso.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo claro para detectar ESP em células gliais de Müller.
- Permitir a quantificação do estresse oxidativo em células neuronais.
- Facilitar a pesquisa sobre o papel dos ESP na função glial e na neurobiologia.
Métodos Utilizados
- O cultivo celular de células gliais de Müller foi realizado para criar o modelo biológico.
- As células foram tratadas com antioxidantes e indutores de ESP para avaliar os níveis de ESP.
- A sonda DCFH-DA foi utilizada para detecção de ESP e quantificada por citometria de fluxo.
- Os passos críticos incluíram lavar as células com PBS e controlar a exposição à luz durante os ensaios.
Resultados Principais
- O protocolo mediu efetivamente os níveis celulares de ERO em células gliais de Müller.
- A citometria de fluxo forneceu uma análise quantitativa do acúmulo de ERO.
- Os resultados confirmaram a viabilidade do uso da sonda DCFH-DA sob as condições especificadas.
Conclusões
- Este estudo estabelece um método confiável para avaliar o estresse oxidativo em células gliais.
- O protocolo simplifica a medição de ESP, aumentando a acessibilidade para pesquisadores.
- Os achados têm implicações para a compreensão do estresse oxidativo em neurobiologia e possíveis alvos terapêuticos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A mensuração quantitativa de espécies reativas de oxigênio (ERO) em células gliais de Müller utilizando DCFH-DA e citometria de fluxo permite uma avaliação robusta dos mecanismos de estresse oxidativo relevantes para modelos de doenças neurodegenerativas e retinianas. Essa capacidade sustenta a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas na modulação de vias antioxidantes. A quantificação confiável de ERO orienta decisões sobre o portfólio de moléculas candidatas que visam a homeostase redox em sistemas relevantes para doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da ativação da via antioxidante e da modulação redox em modelos de células gliais.
- Apóia a validação funcional de alvos envolvidos no estresse oxidativo e nos mecanismos de defesa celular.
- Oferece desvio mecanicista de riscos para intervenções candidatas que afetam os níveis de ERO.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Facilita a preparação de sistemas celulares validados para triagem de compostos contra desfechos de estresse oxidativo.
- Fornece leituras quantitativas padronizadas de ESP adequadas para reprodutibilidade do ensaio e comparação entre estudos.
- Permite avaliação confiável dos efeitos de compostos antioxidantes ou pró-oxidantes em um formato escalonável.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com modelos relevantes para doenças envolvendo patologias retinianas por estresse oxidativo, como a retinopatia diabética.
- Apoia a continuidade translacional ao vincular a modulação de ERO in vitro a estratégias pré-clínicas de biomarcadores.
- Informa o avanço ajustado ao risco de candidatos a antioxidantes com base em resultados celulares quantitativos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este fluxo de trabalho de quantificação de ESP posiciona-se na fase inicial de descoberta até a identificação de compostos líderes, apoiando tanto a verificação de hipóteses quanto a integração com triagens subsequentes.
- Biologia da Descoberta: Fornece evidências quantitativas do envolvimento de vias redox e da resposta celular a agressões oxidativas.
- Triagem: Fornece medições reprodutíveis de ERO com base em citometria de fluxo para triagem de compostos.
- Análises: Permite a comparação estatística dos níveis de ERO entre diferentes condições experimentais utilizando a intensidade geométrica média da fluorescência.
- Pesquisa Translacional: Conecta a modulação do estresse oxidativo in vitro a desfechos relevantes para doenças em modelos retinianos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma padronizada de ensaio de ERO adaptável a diversos tipos celulares e agentes moduladores do estado redox.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na descoberta direcionada a alvos redox e reduz a ambiguidade mecanicista.
- Valor Operacional: Fornece quantificação padronizada, escalonável e reprodutível de espécies reativas de oxigênio (ROS) para fluxos de trabalho entre equipes.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir com moduladores de vias antioxidantes e aumenta a eficiência do capital.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos que visam mecanismos de estresse oxidativo.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência na operação de citometria de fluxo e na análise de dados.
- Necessita de acesso a instrumentação de citometria de fluxo e software de análise compatível.
- Exige padronização entre equipes nos protocolos de seleção de populações celulares (gating) e quantificação de fluorescência.
- Adaptável a outros modelos celulares mediante otimização do protocolo para carregamento da sonda e controles.
- Depende de um manuseio rigoroso das amostras para minimizar a variabilidade do ensaio e artefatos induzidos pela luz.
