Entrega de drogas baseada em bomba osmótica para pesquisa de remyelination in vivo sobre o sistema nervoso central

A desmielinização ocorre em múltiplas doenças do sistema nervoso central. Uma técnica confiável de entrega de medicamentos in vivo é necessária para remyeliar testes de drogas. Este protocolo descreve um método baseado em bomba osmótica que permite a entrega de drogas a longo prazo diretamente no parenchyma cerebral e melhora a biodisponibilidade da droga, com ampla aplicação em pesquisas de remyelination.

A bomba osmótica é de grande valor para a pesquisa da regeneração da mielina, especialmente para aquelas drogas com uma meia-vida curta, má permeabilidade da barreira hematoencefálica, e de vários efeitos colaterais periféricos. A bomba osmótica pode contornar a barreira hemencefálica e entregar drogas diretamente ao corpus calosum, o que efetivamente melhora a biodisponibilidade de drogas, especialmente para algumas drogas com uma meia-vida curta. Para começar, fixe a cabeça de um rato anestesiado no aparelho estereotaxico com uma barra de dente e barras de ouvido.

Cubra o corpo animal, exceto o local cirúrgico. Usando um bisturi, faça uma incisão média de um centímetro de comprimento da pele da base do pescoço até entre os olhos para expor o crânio. Usando um cotonete contendo 30% de peróxido de hidrogênio, limpe suavemente a superfície do crânio para visualizar as estruturas cranianas.

Ajuste a altura da barra de dente e as barras de ouvido para colocar o ponto lambda e bregma na mesma altura. Coloque a ponta de uma agulha de seringa de 10 microliter e 33 de calibre 33 suavemente no ponto de bregma, e reinicie as coordenadas X, Y e Z a zero. Mova a seringa para o local da injeção.

Faça lentamente um pequeno orifício de rebarba através do crânio no local da injeção sem penetrar a dura dura com um bitola de 26 microliter e uma agulha de seringa de 0,45 milímetros. Insira lentamente a agulha da seringa microliter no tecido cerebral através do buraco até que uma certa profundidade seja atingida. Injete 1,5 microlitres de 1%de lisecitina a uma velocidade de 0,5 microliters por minuto.

Espere cinco minutos antes de retirar a seringa, e costure a pele com suturas cirúrgicas 5-0. Coloque o rato que passou por cirurgia sozinho em uma gaiola, e monitore o rato diariamente após a operação. Conecte três espaçadores de ajuste de profundidade à agulha da cânula de infusão cerebral com adesivo de tecido para alcançar uma profundidade de injeção de 1,5 milímetros que está perto do caloso.

Encha a bomba osmótica anexando a agulha da seringa com um pacote de bomba a uma seringa de um mililitro e aspire a droga. Segure a bomba em uma posição vertical. Insira a seringa na abertura na parte superior da bomba e injete lentamente a droga sem criar uma bolha de ar.

Puxe lentamente a seringa enquanto o líquido flui para fora da abertura. Usando tesoura ou alicate, remova a flange branca do regulador de fluxo. Insira o moderador de fluxo na bomba.

Para determinar se há bolhas na bomba osmótica, pese a bomba osmótica separadamente, antes e depois do enchimento. Corte o cateter ao comprimento necessário de acordo com o tamanho do animal. Coloque o cateter na cânula de infusão cerebral.

Encha o cateter com drogas usando a seringa sem introduzir ar. Conecte o cateter ao moderador de fluxo de modo que cubra cerca de quatro milímetros do moderador de fluxo exposto. Mergulhe as bombas preenchidas em salina estéril de 0,9% ou PBS a 37 graus Celsius por pelo menos quatro a seis horas.

Prefira estender-se durante a noite após a implementação. Fixar os ratos no aparelho estereotaxico novamente. Abra a incisão cirúrgica previamente costurada e expanda a incisão até as omoplatas.

Separe a pele do tecido conjuntivo subcutâneo na escápula, usando alicate hemostático ou pinça para abrir uma cavidade, e coloque a bomba osmótica na cavidade. Com um cotonete, limpe suavemente e exponha o orifício do pino na superfície do crânio criado ao estabelecer o modelo de desmielinização. Insira a cânula de infusão cerebral através do orifício perpendicularmente e fixe-a no crânio com adesivo tecidual.

Tire a guia removível acima da cânula de infusão cerebral com um par de tesouras. Costure a incisão ou anexe-a com adesivo tecidual. Coloque o animal em uma gaiola sozinho após a cirurgia.

Após a realização da implementação, a coloração da DAPI revelou que o orifício no tecido cerebral está logo acima da matéria branca, indicando a implementação bem sucedida da cânula de infusão cerebral da bomba osmótica. O experimento de hibridização in situ foi realizado com uma sonda MAG de marcador oligodendrocyto maduro foi usada para rotular oligodendrocytes recém-diferenciados. Os resultados mostraram que o tratamento UM206 produziu mais células MAG positivas na região desmielinizada do que o grupo controle.

A microscopia eletrônica de transmissão da região desmielinizada mostrou que o número de axônios mielinados foi aumentado no grupo de tratamento UM206 em comparação com o grupo controle, sugerindo que o UM206 induziu um maior nível de remielinização. Ao preparar a bomba osmótica, tenha cuidado para não introduzir nenhuma bolha no sistema.