Name: Explorando o metabolismo de energia mitocondrial de spheróides microtissue 3D únicos usando análise de fluxo extracelular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Explore o metabolismo energético mitocondrial em esferoides 3D de células cancerígenas usando análise de fluxo extracelular Seahorse. Este protocolo oferece um modelo fisiológico superior para pesquisa em câncer e descoberta de medicamentos.

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N.J.C foi apoiado por um Prêmio BBSRC MIBTP CASE com a Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Principais descobertas e saídas Este artigo fornece um protocolo detalhado para sondar o metabolismo de energia mitocondrial de esferoides 3D únicos usando uma série de linhas celulares derivadas do câncer com o XFe96 XF Analyzer. Um método é desenvolvido e descrito para o rápido cultivo de Esferoides celulares A549, HepG2/C3A, MCF7 e SK-OV-3 usando tecnologias repelentes celulares para agregação forçada. Este protocolo aborda muitas considerações sobre a sondagem do metabolismo esferoide com a tecnol...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/63346">Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis</a>. The Representative Results section was updated.
Figure 5 was updated from:
<img alt="Oxygen consumption rate (OCR) graphs with oligomycin effects on A549, HepG2/C3A, MCF-7, SK-OV-3 cells." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63346/63346fig05.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63346/63346fig05large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Oligomycin effect on OCR in cancer cell lines; comparison graph; metabolic activity analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63346/63346fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63346/63346fig5v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63346">Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis</a>. The Representative Results&#160;section was&#160;updated.

Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis

Os avanços em modelos in vitro em pesquisa biológica progrediram rapidamente nos últimos 20 anos. Tais modelos agora incluem modalidades organ-on-a-chip, organoides e esferoides microtissue 3D, todos os quais se tornaram um foco comum para melhorar a tradução entre estudos in vitro e in vivo. O uso de modelos in vitro avançados, particularmente esferoides, abrange diversos campos de pesquisa, incluindo engenharia de tecidos, pesquisa de células-tronco, câncer e biologia de doenças 1,2,3,4,5,6,7, e testes de segurança, incluindo toxicologia genética 8,9,10, toxicologia de nanomateriais11, 12,13,14, e testes de segurança e eficácia de medicamentos 8,15,16,17,18,19.
A morfologia celular normal é fundamental para o fenótipo biológico e a atividade. A colheita de células em esferoides microtissue 3D permite que as células adotem uma morfologia, função fenotípica e arquitetura, mais semelhantes às observadas in vivo , mas difíceis de capturar com técnicas clássicas de cultura celular monocamada. Tanto in vivo quanto in vitro, a função celular é diretamente impactada pelo microambiente celular, que não se limita à comunicação e programação celular (por exemplo, formações de junção celular-célula, oportunidades de formação de nichos celulares); exposição celular a hormônios e fatores de crescimento nos ambientes imediatos (por exemplo, exposição à citocina celular como parte de uma resposta inflamatória); composição de matrizes físicas e químicas (por exemplo, se as células são cultivadas em plástico de cultura tecidual rígida ou um ambiente de tecido elástico); e, mais importante, como o metabolismo celular é impactado pela nutrição e acesso ao oxigênio, bem como pelo processamento de resíduos metabólicos, como o ácido láctico.
A análise do fluxo metabólico é uma maneira poderosa de examinar o metabolismo celular dentro de sistemas in vitro definidos. Especificamente, a tecnologia XF permite a análise de mudanças ao vivo e em tempo real nos bioenergésicos celulares de células e tecidos intactos. Dado que muitos eventos metabólicos intracelulares ocorrem dentro da ordem de segundos a minutos, abordagens funcionais em tempo real são primordiais para entender mudanças em tempo real no fluxo metabólico celular em células intactas e tecidos in vitro.
Este artigo fornece protocolos para o cultivo das linhas celulares derivadas do câncer A549 (adenocarcinoma pulmonar), HepG2/C3A (carcinoma hepatocelular), MCF-7 (adenocarcinoma mamário) e SK-OV-3 (adenocarcinoma ovariano) como modelos esferoides in vitro 3D usando abordagens de agregação forçada (Figura 1). Ele também (i) descreve em detalhes como sondar o metabolismo de energia mitocondrial de esferoides 3D únicos usando o analisador Agilent XFe96 XF, (ii) destaca maneiras de otimizar os ensaios XF usando spheroids 3D únicos, e (iii) discute considerações e limitações importantes de sondagem do metabolismo esferoide 3D usando essa abordagem. Mais importante, este artigo descreve como são coletados conjuntos de dados que permitem o cálculo da taxa de consumo de oxigênio (OCR) para determinar a fosforilação oxidativa e, portanto, a função mitocondrial em esferoides celulares. Embora não seja analisada para este protocolo, a taxa de acidificação extracelular (ECAR) é outro parâmetro que é medido ao lado de dados OCR em experimentos XF. No entanto, o ECAR é muitas vezes mal ou incorretamente interpretado a partir de conjuntos de dados XF. Nós fornecemos um comentário sobre as limitações de cálculo do ECAR seguindo abordagens básicas do fabricante de tecnologia.

<table><tbody><tr><td>A549</td><td>ECACC&</td><td>nbsp;#86012804</td><td>Linha celular de carcinoma de pulmão</td></tr><tr><td>Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>103576-100</td><td>Meio de ensaio XF com HEPES 1 mM, sem vermelho de fenol, bicarbonato de sódio, glicose, L-glutamina e piruvato de sódio</td></tr><tr><td>Analisador de fluxo extracelular Agilent Seahorse XFe96</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>-</td><td>Instrumento para medir as taxas de consumo de oxigénio esferóide em esferóides únicos</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Merck Life Science</td><td>A8674</td><td>Inibidor do complexo respiratório III mitocondrial</td></tr><tr><td>BAM15</td><td>TOCRIS bio-techne</td><td>5737</td><td>Desacoplador de protnóforo mitocondrial</td></tr><tr><td>Microplaca de parede preta</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655076</td><td>Para ensaios</td></tr> <tr><td>baseados em fluorescênciaMicroplacas de superfície repelente de células CELLSTAR 96 U Greiner</td><td>Bio-One</td><td>650970</td><td>Microplacas para geração de esferóides</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Ensaio de Viabilidade Celular 3D</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>Ensaio para a determinação da viabilidade celular em esferóides de microtecidos 3D</td></tr><tr><td>Cultrex Poly-D-Lysine</td><td>R& D Systems, uma marca biotechne</td><td>3439-100-01</td><td>Adesivo de células moleculares para revestimento de microplacas esferóides XFe96 para facilitar a fixação de esferóides</td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose</td><td>Merck Life Sciences</td><td>G8270</td><td>Suplemento para crescimento de cultura celular e meio de ensaio XF</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11885084</td><td>Meio de cultura para esferóides HepG2/C3A</td></tr><tr><td>EVOS XL Core Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMEX1000</td><td>Microscópio de imagem de contraste de fase</td></tr><tr><td>EZ-PCR Kit de teste de micoplasma</td><td>Biological Industries</td><td>20-700-20</td><td>Triagem de micoplasma em culturas de células</td></tr><tr><td>FIJI é apenas imagem J</td><td></td><td></td><td>Análise de imagens coletadas</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Merck Life Science</td><td>F7524</td><td>Suplemento para meio de cultura celular</td></tr><tr><td>HepG2/C3A</td><td>ATCC</td><td>#CRL-10741</td><td>Linha celular de carcinoma hepático, um derivado clonal da linha celular HepG2 original</td></tr><tr><td>Lactato-Glo</td><td>Promega</td><td>J5021</td><td>Ensaio para medição de lactato dentro do meio de cultura esférico</td></tr><tr><td>L-glutamina (solução de 200 mM)</td><td>Merk Life Sciences</td><td>G7513</td><td>Suplemento para crescimento de cultura celular e meio de ensaio XF</td></tr><tr><td>M50 Microscópio estéreo</td><td>Leica Microsytems</td><td>LEICAM50</td><td>microscópio de dissecção estéreo; usado para manuseio de esferídeos</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ECACC</td> <td># 86012803</td><td>Linha celular de adenocarcinoma de mama</td></tr><tr><td>Oligomicina de Streptomyces diastatochromogenes</td><td>Merck Life Science</td><td>O4876</td><td>Inibidor de ATP sintase</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Antibióticos adicionados ao meio de cultura celular</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Initrogen</td><td>P7589</td><td>Análise de dsDNA em espehroids</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Merck Life Science</td><td>R8875</td><td>Inibidor do Complexo Respiratório Mitocondrial</td></tr><tr><td>I RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875091</td><td>Meio de cultura para A549, MCF7 e SK-OV-3 esferoides</td></tr><tr><td>Seahorse Analytics</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>Construir 421</td><td>https://seahorseanalytics.agilent.com</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>102905-100</td><td>Cada Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contém: 6 Microplacas de Esferoides Seahorse XFe96 (102978-100), 6 cartuchos de sensor XFe96 e 1 frasco de Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000)</td></tr><tr><td>Pipeta sorológica: 5, 10 e 25 mL</td><td>Consumíveis de</td><td>760107 606107; 607107;</td> para <td>cultura de células</td></tr><tr><td>SK-OV-3</td><td>ECACC</td><td>#HTB-77</td><td>Linha</td></tr> <tr><td>celular de adenocarcinoma ovarianoPiruvato de sódio (solução 100 mM)</td><td>Merck Life Science</td><td>S8636</td><td>Suplemento para crescimento de cultura celular e meio de ensaio XF</td></tr><tr><td>T75 cm2 frasco de cultura de células</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td>Frascos tratados para cultura de tecidos para manutenção de culturas de células</td></tr><tr><td>TrypLExpress</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>Reagente de dissociação celular</td></tr><tr><td>Software controlador de ondas</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Ponteira de orifício largo</td><td>STARLAB International GmbH</td><td>E1011-8400</td><td>Ponteiras de pipeta com abertura larga para manuseamento de esferóides</td></tr></tbody></table>

explorando o metabolismo de energia mitocondrial de spheróides microtissue 3d únicos usando análise de fluxo extracelular

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Agregados celulares tridimensionais (3D), denominados esferoides, tornaram-se a vanguarda da cultura celular in vitro nos últimos anos. Em contraste com as células cultivadas como monocamadas bidimensionais e unicelulares (cultura 2D), a cultura celular esfóide promove, regula e suporta arquitetura fisiológica celular e características que existem in vivo, incluindo a expressão de proteínas de matriz extracelular, sinalização celular, expressão genética, produção de proteínas, diferenciação e proliferação. A importância da cultura 3D tem sido reconhecida em muitas áreas de pesquisa, incluindo oncologia, diabetes, biologia de células-tronco e engenharia de tecidos. Na última década, métodos aprimorados foram desenvolvidos para produzir esferoides e avaliar sua função metabólica e destino.
Analisadores de fluxo extracelular (XF) têm sido usados para explorar a função mitocondrial em microtissues 3D, como esferoides usando uma placa de captura de ilhotas XF24 ou uma microplaca esferoide XFe96. No entanto, protocolos distintos e a otimização da sondagem do metabolismo de energia mitocondrial em esferoides usando a tecnologia XF não foram descritos em detalhes. Este artigo fornece protocolos detalhados para sondar o metabolismo de energia mitocondrial em esferoides 3D únicos usando microplapes esferoides com o analisador XFe96 XF. Usando diferentes linhas de células cancerígenas, a tecnologia XF é demonstrada ser capaz de distinguir entre a respiração celular em esferoides 3D não apenas de tamanhos diferentes, mas também diferentes volumes, números celulares, conteúdo de DNA e tipo.
As concentrações compostas de efeito mitocondrial ideal de oligomicina, BAM15, rotenona e antimicina A são usadas para sondar parâmetros específicos do metabolismo de energia mitocondrial em esferoides 3D. Este artigo também discute métodos para normalizar dados obtidos a partir de esferoides e aborda muitas considerações que devem ser consideradas ao explorar o metabolismo esferoide usando a tecnologia XF. Este protocolo ajudará a impulsionar a pesquisa em modelos esferoides in vitro avançados.

Para obter spheróides bem formados e compactos, cada linha celular foi otimizada individualmente para a densidade de semeadura e duração do cultivo (Figura 3). As linhas celulares A549, HepG2/C3A e SK-OV-3 inicialmente formaram agregados soltos que não progrediram para esferoides redondos com perímetros claramente definidos até depois de 7 dias na cultura. Por outro lado, as células MCF-7 podem formar esferoides dentro de 3 dias. Houve uma clara correlação entre a densidade inicial de semead...

Esses protocolos ajudarão os usuários a sondar o metabolismo de energia mitocondrial em esferoides derivados de células cancerígenas 3D usando a análise de fluxo extracelular do Seahorse.

Explorando o metabolismo de energia mitocondrial de spheróides microtissue 3D únicos usando análise de fluxo extracelular

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Nosso protocolo permite que os pesquisadores testem o metabolismo de energia mitocondrial e esferoides sem emendas para permitir comparações entre várias linhas celulares diferentes, números de células e fenótipos, bem como tratamentos medicamentosos em uma pesquisa de descoberta de drogas e câncer de campo. Nosso trabalho apresenta um protocolo detalhado para explorar o metabolismo de energia mitocondrial usando esferoides 3D fornecendo o modelo fisiológico superior em comparação com experimentos de monocamadas celulares. Observações biológicas podem estar extrapolando de um esferoides vítreos para tumores in vivo e identificar caminhos que podem atingir o metabolismo tumoral esferoide.Por exemplo, o consumo de carboidratos durante o crescimento dos esferoides. Todos os dados do instrumento de fluxo extracelular 96 são muito sensíveis. O posicionamento de esferoides in vitro dentro da placa de ensaio é primordial para obter dados precisos no nível único de esferoide.Verifique a viabilidade esferoide usando um microscópio de luz invertida com contraste de fase na ampliação de 4x para garantir estrutura eferóide intacta, morfologia e uniformidade geral entre as amostras. Para hidratar o cartucho do sensor, alíquotar aproximadamente 20 mililitros do calibrante em um tubo cônico. Coloque o tubo cônico contendo o calibrante em uma incubadora de dióxido de carbono 37 graus Celsius durante a noite.Tire o conteúdo do kit de ensaio. Coloque o cartucho do sensor de cabeça para baixo ao lado da placa do utilitário. Pipeta 200 microliters de água dupla estéril destilada em cada poço da placa de utilidade usando uma pipeta P300 multicanal.Coloque o cartucho do sensor em cima da placa de utilidade. Verifique se o nível de água em cada poço é alto o suficiente para submergir as sondas do sensor. Transfira o cartucho de sensor montado para uma incubadora de dióxido de carbono 37 graus Celsius e deixe-o durante a noite.Para revestir a microplaca de ensaio esferoide, adicione 30 microliters de 0,1 miligramas por solução de poli-d-lysina mililitro por poço de microplaca esferoide usando uma técnica séptica. Aspire a solução de cada poço da microplacão esferoide, inverta a placa e bata-a firmemente no papel de tecido para remover qualquer solução residual. Lave cada poço da placa com 200 microliters de água dupla destilada estéril.Após a lavagem final, inverta a microplacão e bata-a firmemente no papel de tecido para remover qualquer água residual. Deixe a placa secar por 30 minutos antes do uso futuro. Prepare o meio XF RPMI como descrito no manuscrito.Pré-aquecimento o ensaio XF RPMI suplementado médio a 37 graus Celsius uma hora antes do ensaio. E pré-aquecimento o ensaio esferoide revestido microplaca em uma incubadora de dióxido de carbono 37 graus Celsius. Retire o tubo cônico contendo o calibrante e o cartucho do sensor da incubadora de ar.Remova o cartucho do sensor da placa do utilitário e coloque-o de cabeça para baixo na superfície de trabalho. Usando uma pipeta multicanal P300, aspire a água da placa de utilidade e descarte-a. Adicione 200 microliters do calibrante pré-armado a cada poço da placa de utilidade.Coloque o cartucho do sensor na placa do utilitário garantindo que os sensores estejam bem submersos no calibrante. Transfira o cartucho de sensor montado para a incubadora não-carbono, 37 graus Celsius até estar pronto para carregar as soluções de injeção da porta. Retire a placa de cultura esferoide da incubadora e observe os esferoides sob o microscópio para garantir sua integridade antes das etapas de transferência de esferoides.Carregue 180 microliters de ensaio pré-guerra em cada poço da placa esferoide, incluindo quaisquer poços de correção de fundo. Encha parcialmente uma placa de Petri de sete centímetros com três mililitros do meio de ensaio. Transfira os esferoides da placa de cultura 96 para uma placa de Petri, usando uma pipeta multicanal carregada com pontas de pipeta de orifício largo, e volume definido para 10 a 50 microliters.Defina o volume de um único pipettor de canal equipado com uma ponta de pipeta de orifício largo para 20 microliters e aspire cuidadosamente um único esferoide. Coloque a ponta diretamente no centro de cada poço deste microplato de ensaio e permita que a ação capilar retire o esferoide da ponta pipeta. Confirme a evolução sob o microscópio, inserindo o conteúdo do pipettor na placa de Petri.Uma vez que todos esses esferoides tenham sido transferidos para a microplaca de ensaio esferoide, transfira a placa para uma incubadora de dióxido de carbono 37 graus Celsius por um mínimo de uma hora. Prepare as concentrações de estoque de trabalho de cada composto como descrito no manuscrito, usando um meio de ensaio XF RPMI totalmente complementado. Dispensei 20 microliters da solução de funcionamento de cada composto em todas as portas correspondentes usando uma pipeta multicanal P100 calibrada.Prepare o analisador para carregar o cartucho do sensor. Para obter esferoides compactos bem formados, cada linha celular foi otimizada individualmente para a densidade de semeadura e duração do cultivo. Em estratégias otimizadas de semeadura, o volume de spheroid para SK-OV-3 foi em torno de 5,46 x 10 para os sete micrômetros cúbicos e para A549, foi de 1,45 x 10 a oito micrômetros cúbicos.Todos os tipos de esferoides tinham uma correlação linear entre a densidade inicial de semeadura e o volume esferoide. A simetria esferoide perfeita teve uma circularidade de 1,0 e um desvio de 1,0 indicou perda de circularidade. Para todos os tipos de esferoides, a taxa de consumo de oxigênio aumentou com o tamanho do esferoide e foi linearmente correlacionada com o volume esferoide com o maior em spheroids MCF-7 e o menor em spheroids SK-OV-3.Os spheróides MCF-7 não responderam ao controle do veículo durante todo o experimento. A taxa de consumo de oxigênio nos esferoides MCF-7 foi reduzida com oligomicina após cinco ciclos de medição após a primeira injeção de 0,5 microgramas por mililitro. Em resposta ao BAM15, a taxa de consumo de oxigênio foi aumentada antes da segunda injeção.Enquanto a combinação de Rotenone mais Antimicina A baixou-o. Um protocolo para sondar com precisão a respiração mitocondrial basal. Respiração de fosforilação aDP, respiração de vazamento, eficiência de acoplamento, capacidade respiratória máxima e capacidade respiratória sobressalente foi desenvolvida usando esferoides 3D derivados do câncer.Todos os compostos respiratórios produziram os perfis de taxa de consumo de oxigênio cinético esperados para os compostos selecionados revelando uma taxa média de respiração basal estável média de 20 a 30 picomoles de oxigênio por minuto, por poço. Localização de esferoides dentro da microplacão e número do ciclo de medição após a injeção composta para garantir que as taxas de respiração sejam estáveis entre as adições compostas. Ao explorar a capacidade respiratória mitocondrial com desacopladores, não só é a chave de concentração, mas também sua capacidade de descoplar a respiração na presença de oligomicina, que é tipicamente adicionada antes de desacoplador em experimentos que sondam o metabolismo de energia mitocondrial.

exploring-mitochondrial-energy-metabolism-single-3d-microtissue

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

A descrição de um método para caracterização da função mitocondrial em células é fornecido. O perfil mitocondrial gerado fornece quatro parâmetros da função mitocondrial, que pode ser medido em um experimento: taxa de respiração basal, ATP-linked respiração, vazamento de prótons, e capacidade de reserva.

Experimento Perfil bioenergética usando células C2C12 mioblastos

Este protocolo descreve a técnica para realizar o ensaio de fluxo extracelular em esferoides 3D gerados a partir da co-cultura de células cancerígenas pancreáticas (Patu8902) e fibroblastos pancreáticos ativados (PS1) para medir as duas principais vias produtoras de energia, glicólise e respiração mitocondrial.

Ensaio de Fluxo Extracelular em Esferoides 3D: Um Método para Medir a Atividade Metabólica de Esferoides de Tumores Pancreáticos

Aqui, um método é descrito para a preparação de co-cultura 3-dimensional (3D) esferoide de células de câncer no pâncreas e fibroblastos, seguidos por medição das funções metabólicas, usando um analisador de fluxo extracelular.

Preparação e ensaio metabólico de 3-dimensional Spheroid co culturas de células de câncer no pâncreas e fibroblastos

Esta técnica descreve a gravação em tempo real do consumo de oxigênio e taxas de acidificação do extracelular nos tecidos da retina explantados rato, usando um analisador de fluxo extracelular.

Medição do metabolismo energético, no tecido da retina explantado, usando análise de fluxo extracelular

O objetivo do presente protocolo é ilustrar como usar rato neonatal cardiomyocytes como um sistema modelo para examinar como vários fatores podem alterar o consumo de oxigênio no coração.

Analisando a taxa de consumo de oxigênio em Mouse culto principal Cardiomyocytes Neonatal utilizando um analisador de fluxo extracelular

Neste trabalho, descrevemos um protocolo modificado para testar o flux de substrato respiratório mitocondrial usando perfringolysina recombinante O em combinação com respirometria à base de microplato. Com este protocolo, mostramos como a metformina afeta a respiração mitocondrial de duas linhas diferentes de células tumorais.

Medindo flux de substrato mitocondrial em células o-permeabilizadas de permeabilized recombinante

O método aqui apresentado resume protocolos otimizados para avaliação de bioenergésicos celulares em haste hematopoiéticas não aderentes e células progenitoras primitivas (HSPCs) utilizando o analisador de fluxo extracelular para medir a taxa de acidificação extracelular (ECAR) e a taxa de consumo de oxigênio (OCR) dos HSPCs em tempo real.

Avaliação de Bioenergésicos Celulares em Tronco Hematopoiético de Camundongos e Células Progenitoras Primitivas usando o Analisador de Fluxo Extracelular

Descrevemos protocolos stepwise medindo a respiração mitocondrial de neutrófilos humanos e camundongos e células HL60 usando o analisador de fluxo extracelular metabólico.

Mensuração em Tempo Real do Perfil Bioenergético Mitocondrial de Neutrófilos

Aqui, descrevemos em detalhes métodos para extrair macrófagos da medula óssea, baço e coração infartado e, posteriormente, avaliar o fluxo metabólico em células vivas.

Análise do fluxo metabólico ex vivo em macrófagos esplênicos e cardíacos e monócitos da medula óssea

Aqui, estabelecemos uma plataforma de perfil metabólico integrando esferóides de glioma tridimensionais (3D) e normalização baseada em imagem por meio de análise de fluxo extracelular. Essa abordagem permite uma avaliação mais precisa das respostas metabólicas do tumor aos tratamentos medicamentosos e fornece informações sobre os possíveis mecanismos de resistência.

Avanços no perfil metabólico de esferoides tridimensionais de tumores cerebrais para triagem de drogas

Este protocolo descreve uma forma econômica de realizar um teste de esforço de glicólise para quantificar a reprogramação metabólica em micróglias primárias de camundongo. Após o isolamento e estimulação inflamatória, a taxa de acidificação extracelular (ECAR) é medida usando reagentes recém-preparados e ajustados pelo pH, seguida pela normalização proteica para permitir uma avaliação precisa e reprodutível das mudanças glicolíticas.

Investigando a glicólise na microglia primária usando ensaio de fluxo extracelular

Explore o metabolismo energético mitocondrial em esferoides 3D de células cancerígenas usando análise de fluxo extracelular Seahorse. Este protocolo oferece um modelo fisiológico superior para pesquisa em câncer e descoberta de medicamentos.

Explorando o metabolismo de energia mitocondrial de spheróides microtissue 3D únicos usando análise de fluxo extracelular

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