Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido adiposo de rato para diferenciação em células produtoras de insulina
29 de agosto de 2022
Células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (Ad-MSCs) podem ser uma fonte potencial de MSCs que se diferenciam em células produtoras de insulina (IPCs). Neste protocolo, fornecemos passos detalhados para o isolamento e caracterização de Ad-MSCs epidímicas de ratos, seguidos de um protocolo simples e curto para a geração de IPCs a partir dos mesmos Ad-MSCs de ratos.
O objetivo geral deste protocolo é isolar e caracterizar tecido adiposo vermelho, células-tronco mesenquimais secas e diferenciá-las para células produtoras de insulina usando métodos simples. Células-tronco mesenquimais encontraram caminhos no campo da genética. Eles podem ser isolados de várias fontes, como medula óssea, tecido adiposo e tecido perinatal.
Eles aceitam excelentes características culturais. Eles são multipotentes e podem potencialmente tratar várias doenças. O tecido adiposo fornece uma rica fonte de células-tronco mesenquimais.
Estes MSCs adiposos podem ser isolados de lipo aspira facilmente com alto rendimento em comparação com outras fontes como medula óssea. E eles podem fornecer uma boa fonte para transplantes autólogos e aogênicos. Neste vídeo estão apresentando um protocolo simples para isolamento e caracterização de células-tronco mesenquimais adiposas de gordura epidídica de ratos.
Este procedimento é um método simples e altamente eficiente para o isolamento. Após o isolamento, suportaremos a diferenciação dessas células-tronco mesenquimais adiposas em células produtoras de insulina usando um protocolo simples e relativamente curto. Começaremos com o isolamento de células-tronco mesenquimais adiposas por digestão colágena de gordura epidídica para obter uma fração vascular mais forte.
Em seguida, as células-tronco mesenquimais serão caracterizadas por sua adesão plástica, bem como expressão de marcadores de CD e diferenciação em múltiplas linhagens mesodérmicas. Anestesiar o animal, depois eutanásia usando luxação cervical. Espirre todo o corpo com 70% de etanol e comece com excisão da pele e dos músculos na parte inferior do abdômen.
Em seguida, exponha os testículos com a gordura epidímica. Corte suavemente a gordura epidídica. Tenha cuidado para não cortar os vasos sanguíneos com as gorduras.
Em um armário de segurança biológica, corte o tecido adiposo em pequenos pedaços usando fórceps e bisturi. Transfira o tecido adiposo para tubo de centrífuga contendo 10 mililitros estéreis PBS. Comece a lavar inclinando o tubo falcão por 45 segundos.
Em seguida, mantenha o tubo em pé por cinco minutos para separar em duas camadas. Remova o PBS infraado usando uma seringa de 10 mililitros. Repita estas etapas de lavagem quatro a cinco vezes até que o PBS esteja limpo.
Após a lavagem, suspenda novamente o tecido adiposo em solução colágena e, em seguida, incubar no banho de água tremendo até que o tecido esteja quase homogêneo. Depois, o vórtice a mistura de tecido colágeno por 15 segundos, depois centrífuga depois por cinco minutos. Após a centrifugação, você terá três camadas.
Descarte cuidadosamente o sobrenante sobre a fração vascular estromica. Primeiro descarte a camada de óleo na parte superior cuidadosamente, seguido pela camada de ecos sem perturbar a pelota de fração vascular estromida. Suspenda a fração vascular stromal em BSA estéril e re-centrífuga por cinco minutos.
Centrifugação inteira, coloque mídia DMEM F-12 completa em frasco quadrado de 25 centímetros. Após a centrifugação, descarte o supernasciente e suspenda a pelota vascular estromica em toda a mídia DMEM F-12. E transferir para o frasco de cultura.
Coloque em incubadora de dióxido de carbono de 37 graus 5%. No dia seguinte, remova células nãoectadas e substitua a mídia por mídia fresca. A partir do próximo dia de isolamento, as células semelhantes ao fibroblasto começarão a aparecer.
Em seguida, gradualmente, com o passar do tempo, eles aumentarão em número e tamanho. Ao passar, as células se tornarão mais homogêneas. Essas células exibem todos os critérios de caracterização de células-tronco mesenquimais.
Estas células foram diferenciadas para células produtoras de insulina usando este protocolo simples contendo nicotinamida beta mercaptoetanol e Exendin-4. Ao longo dos passos de diferenciação, as células começam a perder sua forma fibroblástica e eu acho que aglomerado como morfologia. Quando as células produtoras de insulina usadas mostram uma coloração de dissimundo vermelha positiva, então as células produtoras de insulina expressam vários marcadores de células beta como Pdx-1, mafA e insulina.
Além disso, as células produtoras de insulina induzidas secretam níveis mais altos de insulina no supernante quando desafiados com maior concentração de glicose. Fornecemos um protocolo detalhado e passo a passo para o isolamento e caracterização das células-tronco mesenquimais adiposas. Também fornecemos aqui um protocolo relativamente curto, simples e eficiente para diferenciação de células-tronco mesenquimais adiposas em células produtoras de insulina.
Isso fornece uma porta de entrada para o pesquisador entrar no campo das células-tronco mesenquimais e estudar sua diferenciação em células produtoras de insulina.
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Visão Geral
Este protocolo descreve o isolamento e a caracterização de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo (Ad-MSCs) a partir de tecido epididimal de rato, seguido de sua diferenciação em células produtoras de insulina (IPCs). Os métodos apresentados são simples e foram projetados para facilitar a aplicação em ambiente laboratorial.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia de Células-Tronco
- Medicina Regenerativa
- Endocrinologia
Contexto
- As células-tronco mesenquimais (MSCs) podem ser derivadas de vários tecidos, incluindo o tecido adiposo.
- O tecido adiposo é uma fonte rica em MSCs com características de cultura favoráveis.
- As MSCs têm a capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares, incluindo células produtoras de insulina.
- Compreender o processo de diferenciação pode auxiliar no desenvolvimento de terapias para o diabetes.
Objetivo do Estudo
- Isolar e caracterizar Ad-MSCs epididimárias de rato.
- Desenvolver um protocolo para diferenciar essas células em IPCs.
- Fornecer um método confiável para pesquisas futuras em medicina regenerativa.
Métodos Utilizados
- Isolamento de MSCs derivadas de tecido adiposo de gordura epididimal de rato.
- Caracterização das MSCs isoladas utilizando marcadores padrão.
- Indução da diferenciação em células produtoras de insulina.
- Avaliação da funcionalidade das células produtoras de insulina após diferenciação.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de CMA-Ad com marcadores superficiais característicos.
- Demonstração da diferenciação de CMA-Ad em CIPs.
- A avaliação funcional mostrou que as CIPs são capazes de secreção de insulina.
- O protocolo fornece um método reprodutível para gerar CIPs a partir de CMA-Ad.
Conclusões
- Os Ad-MSCs são uma fonte viável para gerar células produtoras de insulina.
- O protocolo pode facilitar pesquisas adicionais sobre o tratamento do diabetes.
- Estudos futuros podem explorar o potencial terapêutico dessas CIPs.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo (Ad-MSCs) oferecem uma fonte renovável e eticamente não problemática para a geração de células produtoras de insulina (IPCs) na pesquisa sobre diabetes. O protocolo fornece um método simples e reprodutível para o isolamento e caracterização de Ad-MSCs a partir de gordura epididimal de rato, seguido pela diferenciação em IPCs utilizando sinais bioquímicos definidos. Essa abordagem apoia a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas na descoberta precoce de terapias para doenças metabólicas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar a multipotência das CMM e o comprometimento da linhagem com o destino de células beta pancreáticas.
- Valor Operacional: Fornece uma fonte padronizada de CMM-Ad com expressão confirmada de CD90, CD73 e CD105 para experimentação reprodutível.
- Valor Científico: Apoia a validação funcional de CIP por meio da secreção de insulina estimulada por glicose (SISG) e coloração com ditiona, confirmando funcionalidade semelhante à de células beta.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera CIPs que expressam fatores de transcrição-chave de células beta (Pdx-1, MafA, NKX6.1, Ins1) para uso em ensaios de triagem de compostos.
- Valor Operacional: Permite a produção escalonável de CIPs a partir de Ad-MSCs para avaliação em alto rendimento da dinâmica de secreção de insulina.
- Valor Científico: Facilita a padronização de ensaios por meio de protocolos de diferenciação consistentes utilizando HG-DMEM, β-mercaptoetanol, nicotinamida e exendina-4.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Demonstra relevância translacional ao produzir CIPs que respondem a desafios de glicose com aumento da secreção de insulina.
- Valor Operacional: Apoia a continuidade pré-clínica ao fornecer uma fonte renovável de células para testes de resposta à dose e eficácia em modelos de diabetes.
- Valor Científico: Reduz o risco biológico ao confirmar a multipotência por meio da diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica antes da indução em CIPs.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a identificação de compostos líderes e a avaliação pré-clínica, especialmente para terapêuticas contra o diabetes que visam o reposicionamento ou a função das células beta.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre a plasticidade e a especificação de linhagem das CMM utilizando estímulos definidos de diferenciação.
- Triagem: Permite a produção de CIPs prontas para ensaios com resultados quantificáveis, como níveis de secreção de insulina e expressão de marcadores.
- Análises: Fornece pontos finais mensuráveis, incluindo SSIG, coloração com ditionina e qPCR para marcadores de células beta, a fim de comparar condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta a geração de CIPs in vitro à validação pré-clínica por meio de ensaios funcionais de liberação de insulina.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para gerar CIPs a partir de fontes adiposas em múltiplos projetos e linhagens celulares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na geração de CIPs por meio da caracterização multilinagem e validação funcional.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade do isolamento e diferenciação de CMM-Ad em diferentes laboratórios.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avançar/não avançar no desenvolvimento precoce de terapias para diabetes ao validar modelos celulares da função de células beta.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de abordagens baseadas em células-tronco para intervenções em doenças metabólicas.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em cultura de células-tronco, técnicas de diferenciação e citometria de fluxo para imunofenotipagem.
- Requer acesso a centrífugas, cabines de segurança biológica, incubadoras e equipamentos para ensaios de secreção de insulina estimulada por glicose.
- Exige padronização dos procedimentos de digestão, lavagem e semeadura para garantir um rendimento consistente da fração vascular estromal.
- Requer adaptação do tempo de diferenciação e das concentrações dos reagentes ao ser aplicado a diferentes depósitos adiposos ou espécies.
- Limitado pela necessidade de utilizar células entre as passagens 3 e 5 para assegurar homogeneidade e multipotência antes da indução da diferenciação.
