Técnica modificada para o uso de corações murinos neonatais na preparação de Langendorff

Esta abordagem estabelece de forma confiável a perfusão retrógrada do coração de rato ex vivo neonatal em menos de três minutos. Reduzindo assim a idade mais jovem possível de estudo de várias semanas para 10 dias pós-natais. Este modelo isolado perfusado retrógrado permite o estudo do coração neonatal durante um período crítico de desenvolvimento cardíaco em espécies geneticamente modificáveis e de baixo custo.

Enquanto este modelo se presta ao estudo de respostas fisiológicas e farmacológicas à isquemia-reperfusão no coração neonatal. Também pode ser utilizado para isolamento cardiomiócito. Para fabricar a cânula aórtica do rato recém-nascido use uma tesoura afiada para cortar a ponta e cortar a ponta de uma agulha de aço inoxidável calibre 26, tomando cuidado para não amassar ou restringir o diâmetro do lúmen da agulha.

Em seguida, suavize a borda de corte para remover quaisquer rebarbas raspando suavemente a extremidade embarbada na parte superior do banco de laboratório usando um movimento de ida e volta. Em seguida, conecte a cânula fabricada ao aparelho Langendorff e avalie o fluxo e a resistência. Meça as taxas de fluxo através da cânula coletando e medindo a quantidade de buffer durante um intervalo de um minuto.

Para quantificar o diferencial de pressão através da cânula enquanto o buffer Krebs-Heneseleit está fluindo, meça a pressão no sistema com e sem a cânula anexada. Em seguida, calcule a resistência à cânula usando a seguinte fórmula. Em seguida, remova a cânula de 26 bitola do aparelho Langendorff e conecte uma tubulação de alta pressão ao local de cannula no aparelho.

Em seguida, conecte a cânula aórtica à extremidade distal da tubulação e de ar a tubulação e a cânula com tampão oxigenado, garantindo que todas as bolhas sejam removidas. Para evitar a formação de microtromicas coronárias, administre uma injeção intraperitoneal de heparina a um filhote de rato de 10 dias usando uma agulha de calibre 26 em uma seringa de um mililitro. Deixe vários minutos para a heparina circular antes de prosseguir com a injeção de qualquer anestésico.

Em seguida, coloque o rato anestesiado na posição supina e proteja os membros imediatamente após a perda de consciência. Comece a colher assim que o animal não responder ao dedo do dedo do fogo enquanto o animal respira espontaneamente durante a dissecação inicial. O uso de tesouras dissecando retas faz uma incisão subxifóide transversal através da largura dos animais expondo a cavidade abdominal.

Peça a um assistente para agarrar o processo xifoide com fórceps, em seguida, cortar a caixa torácica bilateralmente ao longo da linha axilar média na direção cefálica e refletir o esterno e costelas cranialmente para expor os órgãos torácicos. Depois de identificar o diafragma superiormente, inciso completamente a porção anterior. Identifique a veia cava inferior infradiafragmática acima do fígado e transecte-a com uma tesoura iris curva, mantendo um leve interior em tensão cefálica no segmento proximal com fórceps de Íris.

Em seguida, corte posteriormente ao longo da superfície interior da coluna usando uma tesoura iris curva enquanto puxa a veia cava inferior para cima e para fora da cavidade torácica. À medida que o coração é mobilizado, angule a tesoura anteriormente e corte os grandes vasos superiormente para remover completamente o coração e os pulmões. Submerse imediatamente o espécime em tampão krebs-henseleit frio ou soro fisiológico.

O coração deve parar de bater em segundos. Coloque um pedaço de papel toalha no fundo de uma placa de Petri rasa para fornecer atrito para estabilizar o coração durante a cannulação. Umedeça a toalha de papel com tampão Krebs-Henseleit frio para evitar que o coração aduque a ele.

Coloque a placa de Petri preparada sob o microscópio de dissecação e ajuste o foco. Agora, coloque a cânula aórtica presa à tubulação de extensão de alta pressão sob o microscópio dissecando, juntamente com uma sutura de seda 5-0 vagamente amarrada ao redor de seu hub. Depois de colocar os órgãos torácicos excisados na placa de Petri, identifique o timo por seu brilho branco e dois lóbulos e oriente o espécime de tal forma que o timo seja anterior e superior.

Em seguida, usando fórceps separam sem rodeios os lóbulos do timo expondo os grandes vasos. Em seguida, identifique a aorta localizando características distintas de ramificação do arco aórtico e transecte-a apenas proximal à decolagem da artéria subclávia usando uma tesoura fina e afiada. Agora segure suavemente a aorta transectada usando fórceps finos curvos estilo joalheiro e cuidadosamente cannula a aorta com uma agulha sem medida de 26, tomando cuidado para não danificar a válvula aórtica.

Usando fórceps curvados finos, segure a aorta ao redor da cânula e inicie a perfusão retrógrada para limitar o tempo isquêmico. Peça ao assistente para agarrar as extremidades da sutura frouxamente amarrada e prender cuidadosamente a aorta ao redor da cânula. Aperte a sutura acima ou abaixo das fórceps curvas finas, em seguida, aperte a sutura e confirme a adequação do fluxo coronário.

Desconecte a tubulação de alta pressão do aparelho Langendorff, segure o cubo da cânula e desconecte a agulha cega da tubulação de extensão de alta pressão. Em seguida, conecte rapidamente o cubo da cânula ao aparelho. Uma vez que o coração está pendurado no aparelho Langendorff na posição usual, uma perfusão adequada é confirmada.

Corte cuidadosamente o pulmão, timo e excesso de tecido. Em seguida, incisar o átrio direito para permitir que o efluente do seio coronário escorra livremente. Faça um pequeno nó no final de uma sutura de seda 5-0, em seguida, furar um pequeno pedaço de filme de parafina com a agulha e deslizar a parafina até a extremidade atada.

Passe cuidadosamente a agulha através do ápice do ventrículo e puxe a sutura através do coração até que o filme de parafina esteja confortável contra a parede lateral do ventrículo. Passe a agulha através da abertura da jaqueta de aquecimento cheia de água do aparelho Langendorff para que o coração possa ser envolto e aquecido. Em seguida, conecte a agulha ao transdutor de força evitando o gotejamento do seio coronário.

Ajuste a sutura para aplicar de um a dois gramas de tensão basal, conforme indicado pela tensão diastólica ou rastreamento de intenção nadir. Em seguida, coloque eletrodos de superfície nos polos superiores e inferiores do coração para registrar o eletrocardiograma. Por fim, prove o efluente do seio coronário para análise utilizando um cateter intravenoso de 24 bitolas.

Eletrodos de superfície foram usados para registrar um eletrocardiograma contínuo, o que permitiu determinar a taxa e o ritmo intrínsecos. Todos os corações adequadamente perfundidos batem espontaneamente no ritmo sinusal. Esta estratégia de perfusão atendeu às necessidades metabólicas do coração do camundongo recém-nascido, dada a produção insignificante de lactato e baixa extração de oxigênio e consumo de glicose.

As médias de variável fisiológica, como a média da frequência cardíaca intrínseca e as pressões médias observadas de perfusão aórtica observada também foram registradas e calculadas. Alguns critérios de exclusão, como o tempo necessário para iniciar a reperfusão, a duração da arritmia e a pressão de perfusão aórtica devem ser considerados para garantir a consistência da preparação neonatal. Após o estabelecimento da perfusão, podem ocorrer intervenções como entrega de medicamentos, indução de lesão por isquemia-reperfusão, alterações de metabólitos ou entrega de agentes enzimáticos para isolamento cardiomiócito.