Name: Reconstrução computacional de ilhotas pancreáticas como ferramenta de análise estrutural e funcional (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Aprenda a reconstruir arquiteturas de ilhotas pancreáticas usando algoritmos computacionais de alto desempenho. Este método permite analisar propriedades morfológicas e de conectividade celular através de simulações funcionais.

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G.J. Félix-Martínez agradece ao CONACYT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, México) e ao Departamento de Engenharia Elétrica da Universidad Autónoma Metropolitana (Cidade do México) pelo apoio dado a este projeto. Agradecemos ao Dr. Danh-Tai Hoang, ao Dr. Manami Hara e ao Dr. Junghyo Jo pelo excelente trabalho e generosidade em compartilhar as arquiteturas de ilhotas que tornaram esse trabalho possível com a comunidade de pesquisa.

NOTA: Um diagrama esquemático do protocolo é mostrado na Figura 1. Uma descrição passo a passo é dada da seguinte forma (consulte o Arquivo Suplementar 1 para obter detalhes sobre os painéis de controle usados em cada etapa do protocolo).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63351/63351fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama de fluxo. Um diagrama de fluxo descrevendo a ordem sequencial do protocolo conforme implementado no IsletLab. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63351/63351fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
1. Instalação do IsletLab no Linux
NOTA: Siga as instruções dadas nas seções 2 e 3 do Arquivo Suplementar 2 para instalar o IsletLab nas janelas ou macOS.
<ol><li>Abra um navegador de internet e vá para https://github.com/gjfelix/IsletLab. Baixe e extraia os arquivos do repositório do IsletLab. NOTA: O Arquivo Suplementar 3 inclui uma cópia da versão do IsletLab usada neste protocolo.</li>
	<li>Verifique se os compiladores GCC e NVCC estão instalados. Abra um terminal e digite os seguintes comandos: gcc --versão nvcc --versão Siga as instruções listadas na seção 1 do Arquivo Suplementar 2 se algum desses comandos não for reconhecido pelo sistema.</li>
	<li>Baixe e instale a plataforma de ciência de dados (ver Tabela de Materiais). Abra um terminal e vá para a pasta IsletLab.</li>
	<li>Crie um novo ambiente digitando o seguinte comando no terminal: conda env criar -f isletlabgui_v1.0.yml
</li>
	<li>Ativar o novo ambiente digitando: conda ativar isletlab_v1.0
</li>
	<li>Inicie o aplicativo IsletLab digitando o seguinte comando no terminal (ver Figura 2 para uma descrição da janela principal): píton isletlabgui_v1.0.py
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63351/63351fig02.jpg"> Figura 2: A interface de usuário do IsletLab. A interface é composta por três painéis principais: configuração (1), estatística (2) e gráficos (3) painéis. A barra de ferramentas gráfica (4) está localizada na parte inferior do painel gráfico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63351/63351fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. Reconstrução de ilhotas
<ol><li>Prepare os dados de entrada. Organize os dados de ilhotas de entrada (ou seja, tipos de células e coordenadas de três dimensões (3D) em um arquivo de quatro colunas em que a coluna 1 contém o tipo de célula (codificado como 11: ª célula, 12: β células, 13: δ células) e as colunas 2 a 4 contêm as coordenadas x, y e z, respectivamente (consulte um trecho de um arquivo de entrada na seção 5 do Arquivo Suplementar 2 ou no arquivo de teste de entrada incluído no repositório do IsletLab).</li>
	<li>Certifique-se de que o arquivo de entrada não inclua cabeçalhos de coluna. Use o arquivo de entrada de exemplo incluído no repositório DolletLab para seguir o protocolo, se necessário (Input_Islet_test.txt). NOTA: Os dados de entrada utilizados para desenvolver os algoritmos implementados no IsletLab foram obtidos experimentalmente conforme descrito em detalhes por Hoang et al.11,12 usando a coloração da DAPI para determinar as posições nucleares e a imunofluorescência para identificar os tipos celulares.</li>
	<li>Clique no botão 'Carregar ilhota inicial ' e selecione o arquivo contendo dados de entrada para gerar uma ilhota inicial, a representação 3D e as estatísticas correspondentes. Em caso de erro, a seguinte mensagem será exibida: 'Arquivo de isícula de carregamento de erro'. Para corrigir isso, repita o passo 2.1.</li>
	<li>Configure o processo de reconstrução. Clique no botão Configurações de Reconstrução e modifique os parâmetros de otimização (consulte as seções 4 e 5 do Arquivo Suplementar 2 para uma breve descrição do algoritmo e dos parâmetros mostrados na janela de configurações de reconstrução).</li>
	<li>Definir a temperatura inicial = 1, fator de iterações = 1, e fator de aceitação = 1. Clique no botão OK para salvar os valores dos parâmetros. NOTA: Como regra geral, um aumento no parâmetro de temperatura, bem como nas iterações e fatores de aceitação, produzirá melhores resultados de reconstrução em termos das células experimentais incluídas na ilhota reconstruída em detrimento de um aumento no tempo de computação.</li>
	<li>Clique no botão Reconstruir ilhotas para abrir a janela de registro de reconstrução (consulte a seção 6 do Arquivo Suplementar 2 para obter uma descrição das informações fornecidas no registro de reconstrução).</li>
	<li>Clique no botão Executar para iniciar o processo de reconstrução. Monitore o processo de otimização até que a mensagem: 'Por favor, feche esta janela para continuar' é exibida. Feche a janela de registro de reconstrução para gerar a representação visual da ilhota reconstruída e para calcular as estatísticas relacionadas (ver a coluna esquerda na Figura 3A-C).</li>
	<li>Avalie os resultados do processo de reconstrução analisando as estatísticas de otimização mostradas na guia final de ilhotas do painel estatístico. Particularmente, concentre-se em maximizar a porcentagem de células experimentais incluídas nas ilhotas reconstruídas (% de experimentais) ou equivalentemente, na minimização do número de sobreposições (também mostradas graficamente no enredo de convergência, coluna direita na Figura 3A-C).</li>
	<li>Se a % da estatística experimental for considerada baixa de acordo com os objetivos do usuário, reinicie o IsletLab como descrito na etapa 9.1 e aumente a temperatura inicial, fator de iterações e fator de aceitação nos ajustes de reconstrução e repita as etapas 2.1-2.4 até que os resultados satisfatórios sejam obtidos (&gt; 95% das células experimentais). Consulte as seções 5-7 do Arquivo Suplementar 2 para maior descrição do processo de reconstrução e dos resultados relacionados.</li>
</ol>3. Identificação de contatos célula a célula
<ol><li>Clique no botão Configurações de reconstrução e defina o parâmetro Tolerância de Contato para definir a tolerância de contato entre células e clique em OK para salvar os valores dos parâmetros. NOTA: O parâmetro de tolerância ao contato representa a distância máxima entre as células para ser considerado como em contato.</li>
	<li>Clique no botão Contatos célula-célula para identificar as células em contato próximo. Na guia contatos, verifique se há células em contato mostradas graficamente (linhas pretas) no painel gráfico e nas estatísticas correspondentes (ou seja, contatos total, homotípico e heterotípico e contatos β-β, δ-δ, β δ, β-δ) mostrados no painel de estatísticas (ver a coluna esquerda da Figura 4A-C).</li>
	<li>Aumente (diminua) o parâmetro de tolerância ao contato para aumentar (diminuir) o número de contatos célula-célula. Consulte a seção 8 do Arquivo Suplementar 2 para obter detalhes sobre a identificação de contatos célula-célula e os resultados associados.</li>
</ol>4. Construção da rede de ilhotas
<ol><li>Clique no botão Build Network para gerar a rede de ilhotas e para calcular as métricas de rede associadas (consulte a coluna direita na Figura 4A-C). NOTA: Uma descrição adicional dos resultados relacionados à rede de ilhotas geradas é dada na seção 9 do Arquivo Suplementar 2.</li>
</ol>5. Simulação funcional da ilhota reconstruída
<ol><li>Mude para a guia de simulação do painel de configuração da interface (Figura 5).</li>
	<li>Selecione o modo desejado de frequência intrínseca - Constante ou Aleatória - e clique no botão Configurar frequência intrínseca para definir a frequência dos osciladores (em Hz). Se for selecionada uma frequência intrínseca aleatória, defina a média e o desvio (em Hz) para gerar frequências aleatórias normalmente distribuídas (ver seção 11 do Arquivo Suplementar 2 para uma descrição dos parâmetros de simulação).</li>
	<li>Selecione o modo desejado da fase inicial - Constante ou Aleatório. Se uma fase inicial constante for selecionada, clique no botão Configurar fase inicial para definir a fase dos osciladores (em radians). Se a fase inicial aleatória for selecionada, o sistema atribuirá fases aleatórias entre 0 e 2π a todos os osciladores. NOTA: Se uma fase inicial constante for selecionada, todos os osciladores serão iniciados em fase.</li>
	<li>Clique no botão Configurar Interações para definir os parâmetros de interação célula-celular na janela de força de interação. Para obter uma descrição dos parâmetros de interação, consulte a seção 11 do Arquivo Suplementar 2.</li>
	<li>Configure a simulação definindo o tempo total de simulação (em s), etapa de tempo (em s) e fator de salvamento (números de etapas entre os pontos de dados salvos). Na simulação mostrada na Figura 5 o tempo total foi de 20000, com um passo de tempo de 0,1 s e um fator de salvamento de 500.</li>
	<li>Defina o número de blocos, threads e recursos de plataforma de computação disponíveis para realizar a simulação. Defina esses parâmetros de acordo com as características específicas da unidade de processamento gráfico (GPU) disponível. NOTA: No exemplo mostrado na Figura 5, foram utilizados 36 blocos e 64 threads por bloco (2304 núcleos de plataforma de computação) desde que foi utilizada uma GPU com 36 multiprocessadores e 64 núcleos de plataforma de computação por multiprocessadores. O valor do parâmetro de capacidade da plataforma de computação utilizado foi de 75, uma vez que a capacidade da plataforma de computação de hardware era 7.5 (ver seção 10 do Arquivo Suplementar 2 para obter detalhes sobre esses parâmetros).</li>
	<li>Clique no botão Executar simulação para abrir a janela de registro de simulação. Clique no botão Executar para iniciar a simulação e monitore o processo até que a legenda: 'Por favor, feche a janela para continuar' seja exibida. Consulte a seção 12 do Arquivo Suplementar 2 para obter detalhes sobre o registro de simulação.</li>
	<li>Feche a janela de registro de simulação para observar os resultados da simulação (ver Figura 5). Detalhes sobre os resultados da simulação são dados na seção 13 do Arquivo Suplementar 2.</li>
</ol>6. Salve o projeto (opcional)
<ol><li>Clique em Arquivar &gt; Projeto de Exportação na barra de menu. Selecione o diretório no qual o arquivo do projeto será salvo e clique no botão OK . NOTA: O nome do arquivo do projeto é determinado automaticamente com base no nome do arquivo de dados inicial. Se o projeto não for salvo, todos os resultados e arquivos relacionados serão excluídos automaticamente.</li>
	<li>Carregue um projeto exportado clicando em Arquivo &gt; Projeto de Carga.</li>
</ol>7. Salvar figuras (opcional)
<ol><li>Clique no Ícone salvar plot localizado na barra de ferramentas do plot para salvar a visualização atual em um arquivo de imagem. Repita esta etapa para todas as figuras criadas ao longo do protocolo. NOTA: As visualizações de gráficos e ilhotas podem ser modificadas usando os ícones disponíveis na barra de ferramentas de plot do painel gráfico.</li>
</ol>8. Projeto de carga (opcional)
<ol><li>Clique em Arquivar &gt; Carregar projeto no menu principal e selecione um arquivo de projeto salvo anteriormente, conforme descrito nas etapas 6.1-6.2. NOTA: Um projeto não será carregado corretamente se o arquivo do projeto tiver sido modificado externamente. Se um projeto for carregado com sucesso, apenas os recursos de simulação estarão disponíveis.</li>
</ol>9. Reinicie o processo de reconstrução e análise (opcional)
<ol><li>A qualquer momento o usuário pode selecionar Arquivo &gt; Reiniciar para descartar todos os resultados e iniciar uma nova reconstrução e análise.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, L., Pan, X., Zhang, Y. H., Huang, T., Cai, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Gene+Expression+Differences+between+Different+Pancreatic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Analysis of Gene Expression Differences between Different Pancreatic Cells.</a> ACS Omega. 4 (4), 6421-6435 (2019).</li>
<li>Longnecker, D. S., Gorelick, F., Thompson, E. D., Histology, Anatomy, Histology, and Fine Structure of the Pancreas. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLongnecker%2C+DS+%22The+Pancreas%22">The Pancreas</a>. Beger, H. G., Warshaw, A. L., Hruban, R. H., Buchler, M. W., Lerch, M. M., Neoptolemos, J. P., Shimosegawa, T., Whitcomb, D. C., GroB, C. , Wiley Online Library. (2018).</li>
<li>Liao, E. P., Brass, B., Abelev, Z., Poretsky, L. Endocrine Pancreas. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiao%2C+EP+%22Principles+of+Diabetes+Mellitus%22">Principles of Diabetes Mellitus</a>. Poretsky, L. , Springer. Cham. (2017).</li>
<li>Noguchi, G. M., Huising, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+the+inputs+that+shape+pancreatic+islet+hormone+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Integrating the inputs that shape pancreatic islet hormone release.</a> Nature Metabolism. 1, 1189-1201 (2019).</li>
<li>Pérez-Armendariz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+36%2C+a+key+element+in+pancreatic+beta+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Connexin 36, a key element in pancreatic beta cell function.</a> Neuropharmacology. 75, 557-566 (2013).</li>
<li>Briant, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B4-cells+and+%CE%B2-cells+are+electrically+coupled+and+regulate+%CE%B1-cell+activity+via+somatostatin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">δ-cells and β-cells are electrically coupled and regulate α-cell activity via somatostatin.</a> The Journal of Physiology. 596 (2), 197-215 (2018).</li>
<li>Arrojoe Drigo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+architecture+of+the+islet+of+Langerhans%3A+a+focused+cross-species+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment.</a> Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).</li>
<li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).</li>
<li>Folli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+of+Langerhans%27+cytoarchitecture+and+ultrastructure+in+normal+glucose+tolerance+and+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+Obesity+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet of Langerhans' cytoarchitecture and ultrastructure in normal glucose tolerance and in type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetes, Obesity & Metabolism. 20, Suppl 2 137-144 (2018).</li>
<li>Kilimnik, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+islet+composition+and+disproportionate+loss+of+large+islets+in+patients+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Altered islet composition and disproportionate loss of large islets in patients with type 2 diabetes.</a> PloS One. 6 (11), 27445(2011).</li>
<li>Hoang, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Conserved+Rule+for+Pancreatic+Islet+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A Conserved Rule for Pancreatic Islet Organization.</a> PloS One. 9 (10), 110384(2014).</li>
<li>Hoang, D. T., Hara, M., Jo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+Principles+of+Pancreatic+Islets%3A+Glucose-Dependent+Coordination+of+Hormone+Pulses%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Design Principles of Pancreatic Islets: Glucose-Dependent Coordination of Hormone Pulses.</a> PloS One. 11 (4), 0152446(2016).</li>
<li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li>
<li>Félix-Martinez, G. J., Godínez-Fernández, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+models+of+electrical+activity+of+the+pancreatic+%CE%B2-cell%3A+a+physiological+review%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Mathematical models of electrical activity of the pancreatic β-cell: a physiological review.</a> Islets. 6 (3), 949195(2014).</li>
<li>Félix-Martínez, G. J., González-Vélez, V., Godínez-Fernández, J. R., Gil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+models+of+the+human+pancreatic+%CE%B4-cell%3A+From+single+channels+to+the+firing+of+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Numerical+Methods+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological models of the human pancreatic δ-cell: From single channels to the firing of action potentials.</a> International Journal for Numerical Methods in Biomedical Engineering. 36 (2), 3296(2020).</li>
<li>Watts, M., Sherman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+pancreatic+%CE%B1-cell%3A+dual+mechanisms+of+glucose+suppression+of+glucagon+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Modeling the pancreatic α-cell: dual mechanisms of glucose suppression of glucagon secretion.</a> Biophysical Journal. 106 (3), 741-751 (2014).</li>
<li>Lei, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-cell+hubs+maintain+Ca2%2B+oscillations+in+human+and+mouse+islet+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Beta-cell hubs maintain Ca2+ oscillations in human and mouse islet simulations.</a> Islets. 10 (4), 151-167 (2018).</li>
<li>Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+glucagon+secretion%3A+the+%CE%B2%2F%CE%B1%2F%CE%B4+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 310 (8), 597-611 (2016).</li>
<li>Félix-Martínez, G. J., Mata, A., Godínez-Fernández, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstructing+human+pancreatic+islet+architectures+using+computational+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Reconstructing human pancreatic islet architectures using computational optimization.</a> Islets. 12 (6), 121-133 (2020).</li>
<li>Hellman, B., Salehi, A., Gylfe, E., Dansk, H., Grapengiesser, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+generates+coincident+insulin+and+somatostatin+pulses+and+antisynchronous+glucagon+pulses+from+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Glucose generates coincident insulin and somatostatin pulses and antisynchronous glucagon pulses from human pancreatic islets.</a> Endocrinology. 150 (12), 5334-5340 (2009).</li>
<li>Hellman, B., Salehi, A., Grapengiesser, E., Gylfe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+mouse+islets+respond+to+glucose+with+an+initial+peak+of+glucagon+release+followed+by+pulses+of+insulin+and+somatostatin+in+antisynchrony+with+glucagon%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Isolated mouse islets respond to glucose with an initial peak of glucagon release followed by pulses of insulin and somatostatin in antisynchrony with glucagon.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 417 (4), 1219-1223 (2012).</li>
<li>Félix-Martínez, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IsletLab%3A+an+application+to+reconstruct+and+analyze+islet+architectures%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">IsletLab: an application to reconstruct and analyze islet architectures.</a> Islets. 14 (1), 36-39 (2022).</li>
<li>Félix-Martínez, G. J., Godínez-Fernández, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+reconstructed+architectures+from+mice+and+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of reconstructed architectures from mice and human islets.</a> Islets. 14 (1), 23-35 (2022).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo acima descreve uma abordagem prática para reconstruir e analisar arquiteturas de ilhotas pancreáticas usando novos algoritmos computacionais. O principal objetivo deste trabalho é permitir que a comunidade de pesquisa de ilhotas obtenha métricas quantitativas para caracterizar as propriedades morfológicas e conectividade das arquiteturas de ilhotas pancreáticas e avaliar as possíveis implicações funcionais dessas propriedades através de simulações computacionais.
Embora os...

O pâncreas é dividido em regiões referidas como cabeça, pescoço, corpo e cauda, cada uma com estruturas, funções e posição anatômicadiferentes 1,2. Do ponto de vista funcional, o pâncreas pode ser dividido em sistemas endócrinos e exócrinos com o primeiro responsável pela secreção de hormônios criticamente envolvidos na regulação da homeostase glicemia, enquanto este último contribui para a digestão alimentar através da secreção de enzimas no duodeno1. As ilhotas pancreáticas constituem o tecido endócrino do pâncreas e são responsáveis pela secreção de glucagon, insulina e somatostatina, secretadas de células de β, e δ, respectivamente3. Além de seus mecanismos de regulação intrínseca, essas células são reguladas via comunicação elétrica direta (entre células β e prováveis β e δ células), e também por sinalização paracrina e autocririna 4,5,6. Ambos os mecanismos são altamente dependentes da arquitetura de ilhotas (ou seja, a composição e organização dos diferentes tipos de células dentro da ilhota)7,8. É importante ressaltar que a arquitetura de ilhotas é alterada na presença de diabetes, provavelmente perturbando a comunicação intraisleta como resultado 9,10.
O estudo das ilhotas pancreáticas envolve uma ampla gama de metodologias experimentais. Entre elas, o uso de técnicas de fluorescência para determinar o número, localização e tipo das diferentes células da ilhota permitiu estudar as propriedades estruturais e morfológicas das ilhotas pancreáticas 11,12,13 e obter uma melhor compreensão das implicações funcionais em saúde e doença. Como complemento, modelos computacionais de células pancreáticas 14,15,16 e, mais recentemente, ilhotas pancreáticas 12,17,18,19 foram utilizadas nas últimas décadas para avaliar aspectos difíceis ou até impossíveis de abordar experimentalmente.
Neste protocolo, buscamos preencher a lacuna entre o trabalho experimental e computacional, delineando uma metodologia para reconstruir arquiteturas de ilhotas, analisar suas propriedades morfológicas e conectividade por meio de métricas quantitativas e realizar simulações básicas para avaliar as implicações funcionais das propriedades ilhotas.
O protocolo descrito abaixo é baseado em algoritmos computacionais especificamente projetados para o estudo de ilhotas pancreáticas. Em resumo, na primeira etapa do protocolo, a arquitetura de ilhotas é reconstruída a partir de dados experimentais utilizando o algoritmo recentemente proposto por Félix-Martínez et al.19 em que posições nucleares obtidas através de 4′,6-diamidino-2-pheilndole (DAPI) coloração e tipos celulares identificados através de imunofluscência (como descrito em detalhes por Hoang et al.11,12 ) são processados em um procedimento de otimização iterativo. Isso leva à determinação do tamanho e posição ideais de cada célula e à obtenção de uma ilhota composta de células não sobrepostas. Em segundo lugar, com base na arquitetura reconstruída, os contatos célula-célula são identificados para determinar as propriedades de conectividade e gerar a rede de ilhotas correspondente que permite ao usuário obter métricas quantitativas para descrever melhor a arquitetura de ilhotas (detalhes sobre o algoritmo de reconstrução podem ser consultados no trabalho original sobre o assunto19). Finalmente, simulações funcionais básicas são realizadas utilizando-se a abordagem de modelagem proposta por Hoang et al.12 em que, com base na natureza pulsante da secreção hormonal observada experimentalmente20,21, cada célula é tratada como um oscilador e, portanto, a ilhota é representada como uma rede de osciladores acoplados seguindo as propriedades de conectividade da ilhota reconstruída.
Dada a complexidade computacional dos algoritmos utilizados neste protocolo, todas as etapas envolvidas foram implementadas em um aplicativo autônomo22 com o objetivo principal de abordar essas ferramentas computacionais para todos os leitores interessados, independentemente de seu nível de experiência no uso de software especializado ou linguagens de programação.

<table><tbody><tr>Placa <td></td><td></td><td>gráfica NVIDIA compatível com CUDA</td><td>Necessária para as simulações funcionais</td></tr><tr><td>IsletLab</td><td></td><td></td><td>https://github.com/gjfelix/IsletLab (Siga as instruções para baixar e instalar o aplicativo.)</td></tr></tbody></table>

reconstrução computacional de ilhotas pancreáticas como ferramenta de análise estrutural e funcional

Computational Reconstruction of Pancreatic Islets as a Tool for Structural and Functional Analysis

As propriedades estruturais das ilhotas pancreáticas são fundamentais para a resposta funcional das células secretantes de insulina, glucagon e somatostatina, devido às suas implicações na comunicação intraisleta via sinalização elétrica, paracrina e autocririna. Neste protocolo, a arquitetura tridimensional de uma ilhota pancreática é primeiro reconstruída a partir de dados experimentais usando um novo algoritmo computacional. Em seguida, são obtidas as propriedades morfológicas e de conectividade da ilhota reconstruída, como o número e percentuais dos diferentes tipos de células, volume celular e contatos célula-célula. Em seguida, a teoria da rede é usada para descrever as propriedades de conectividade da ilhota através de métricas derivadas da rede, como grau médio, coeficiente de cluster, densidade, diâmetro e eficiência. Finalmente, todas essas propriedades são avaliadas funcionalmente através de simulações computacionais usando um modelo de osciladores acoplados. No geral, descrevemos aqui um fluxo de trabalho passo a passo, implementado no IsletLab, um aplicativo multiplataforma desenvolvido especificamente para o estudo e simulação de ilhotas pancreáticas, para aplicar uma nova metodologia computacional para caracterizar e analisar ilhotas pancreáticas como um complemento ao trabalho experimental.

A reconstrução das ilhotas pancreáticas utilizando a metodologia proposta por Félix-Martínez et al.19 é altamente dependente dos parâmetros dados ao algoritmo de otimização (definido nos cenários de reconstrução). Um exemplo disso é mostrado visualmente na Figura 3, onde ilhotas reconstruídas obtidas usando diferentes conjuntos de parâmetros são mostradas. Primeiro, na Figura 3A, uma reconstrução que incluiu 86,6% das células incluídas no...

Neste protocolo, as ilhotas pancreáticas são reconstruídas e analisadas usando algoritmos computacionais implementados em uma aplicação multiplataforma dedicada.

Reconstrução computacional de ilhotas pancreáticas como ferramenta de análise estrutural e funcional

Structural properties of pancreatic islets are key for the functional response of insulin, glucagon, and somatostatin-secreting cells, due to their ...

Este protocolo é significativo porque descreve uma carga de trabalho computacional para reconstruir arquiteturas de ilhotas, analisar suas propriedades morfológicas e de conectividade e avaliar suas implicações funcionais através de simulações computacionais. A principal vantagem é que ele fornece uma maneira de implementar algoritmos de computação de alto desempenho para complementar o trabalho teórico e experimental no campo da pesquisa de ilhotas. Esta metodologia pode ser particularmente útil para comparar as propriedades morfológicas e de conectividade de ilhotas saudáveis e alteradas ou para comparar arquiteturas de ilhotas de diferentes espécies animais.Para começar, verifique se os compiladores GCC e NVCC estão instalados. Abra um terminal executando os comandos e siga as instruções fornecidas no texto se algum desses comandos não for reconhecido pelo sistema. Abra um terminal e vá para a pasta IsletLab.Crie um novo ambiente executando o comando no terminal. Ative o novo ambiente executando o comando. Inicie o aplicativo IsletLab executando o comando no terminal.Para preparar os dados de entrada, organize os dados de ilhotas de entrada em um arquivo de quatro colunas em que a primeira coluna é o tipo de célula e a segunda, terceira e quarta colunas são as coordenadas X, Y e Z das células de entrada, respectivamente, garantindo que o arquivo de entrada não inclua cabeçalhos de coluna. Clique no botão de ilhota inicial de carga e selecione o arquivo contendo dados de entrada para gerar uma ilhota inicial, a representação tridimensional e as estatísticas correspondentes. Para configurar o processo de reconstrução, clique no botão Configurações de Reconstrução e modifique os parâmetros de otimização.Clique no botão OK para salvar os valores dos parâmetros. Clique no botão Reconstruir a ilhota para abrir a janela Registro de Reconstrução. Clique no botão Executar para iniciar o processo de reconstrução.Avalie os resultados do processo de reconstrução analisando as estatísticas de otimização mostradas na guia Ilhotas Finais do painel estatístico, focando na maximização do percentual de células experimentais incluídas nas ilhotas reconstruídas ou, equivalentemente, na minimização do número de sobreposições. Se o percentual de estatísticas experimentais for considerado baixo de acordo com os objetivos do usuário, clique no menu Arquivo e selecione Reiniciar. Clique no botão Descarregar o botão ilhota inicial e selecione o arquivo contendo dados de entrada para gerar uma ilhota inicial.Em seguida, aumente a temperatura inicial, o fator Iterações e o fator de aceitação nos ajustes de Reconstrução e repita o processo de reconstrução de ilhotas descrito anteriormente até que os resultados satisfatórios sejam obtidos. Clique nas configurações de reconstrução e selecione Tolerância de contato para definir a tolerância de contato entre células. Clique em OK para salvar os valores do parâmetro.Clique no botão contatos célula a célula para identificar as células em contato próximo. Clique no botão Criar rede para gerar a rede de ilhotas e para calcular a matriz de rede associada. Mude para a guia Simulação do painel de configuração da interface.Selecione o modo desejado de frequência intrínseca, Constante ou Aleatória. Clique no botão configurar de frequência intrínseca para definir a frequência do oscilador em hertz. Selecione o modo desejado da fase inicial, Constante ou Aleatório.Clique no botão Configurar interações para definir os parâmetros de interação célula-celular na janela de força interação. Configure a simulação definindo o tempo total de simulação, etapa de tempo e fator de salvamento. Defina o número de blocos, threads e recursos de plataforma de computação disponíveis para realizar a simulação.Clique no botão Executar simulação para abrir a janela de registro de simulação. Clique no botão Executar para iniciar a simulação e monitore o processo até que a legenda Feche a janela para continuar. Em seguida, feche a janela de registro de simulação para observar os resultados da simulação.Clique em Arquivar e selecione o Projeto de Exportação na barra de menu. Selecione o diretório no qual o arquivo do projeto será salvo e clique no botão OK. Foi obtida a reconstrução de ilhotas utilizando conjuntos subótimos de parâmetros nos ambientes de reconstrução, incluindo 86,6% das células iniciais.O aumento da temperatura inicial, iteração e fatores de aceitação resultou em uma maior porcentagem de células iniciais como 93,37 e 99,15% nas ilhotas reconstruídas. Os lotes de convergência do processo de reconstrução foram obtidos, demonstrando a evolução das células sobrepostas em função da temperatura. A identificação dos contatos célula-célula das arquiteturas de ilhotas reconstruídas depende do valor do parâmetro de tolerância ao contato.Apenas 290 contatos célula-célula foram identificados pelo valor de um micrômetro, enquanto para dois micrômetros, o contexto total identificado aumentou para 636 e 731, respectivamente. O enredo da rede foi obtido que fornece uma representação visual dos contatos célula-célula que estão conectados juntos. Os resultados da simulação demonstraram que as células alfa e beta oscilam completamente fora de fase, enquanto as células delta oscilam fora da fase com células alfa e beta.O comportamento oscilatório da ilhota foi dominado pelas oscilações das células alfa com uma pequena contribuição da outra população celular. Foi obtido o gráfico do índice de sincronização de ilhlets que fornece a medida da coerência de fase das oscilações entre as células ilhotas e a variação da sincronicidade entre as células ilhotas ao longo do tempo. Todas as métricas derivadas e as simulações funcionais dependem do processo de reconstrução, por isso é fundamental alcançar o maior percentual de células iniciais nas ilhotas reconstruídas.Ilhotas reconstruídas obtidas a partir deste procedimento podem ser ainda mais utilizadas para desenvolver modelos computacionais mais realistas de ilhotas pancreáticas, incluindo uma descrição biofísica detalhada das células ilhotas.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Métodos assistidos por computador romance de grande escala de aquisição e análise de amostras de imunohistoquímica do pâncreas manchadas são descritos: (1) capturar Slice Virtual de toda a seção, (2) a análise em massa de dados em grande escala, (3) Reconstrução de 2D Slices Virtual ; (4) mapeamento 3D ilhéu, e (5) Análise Matemática.

Assistida por computador visualização de grande escala e Quantificação da Missa das ilhotas pancreáticas, distribuição de tamanho e Arquitetura

Este vídeo demonstra os procedimentos para caracterização de ilhotas pancreáticas humanas com hematoxilina e eosina (H &amp; E) e imuno-histoquímica (IHQ). Seções pancreáticas de cabeça, corpo e regiões da cauda estão manchadas por tanto H &amp; E e IHC para determinar a composição endócrino ilhéu (insulina, glucagon e polipeptídeo pancreático), a replicação celular (Ki67), e infiltrado inflamatório (H &amp; E, CD3). A região uncinado está localizado usando IHC para polipeptídeo pancreático.

Protocolos de coloração de ilhotas pancreáticas humanas

Aqui, apresentamos um passivo de protocolo para seções de pâncreas humano imagem em três dimensões (3D) usando otimizado métodos de compensação. Este manuscrito demonstra estes procedimentos para compensação de óptica passiva seguido por imunofluorescência múltiplas coloração para identificar os elementos-chave das redes neurais sensoriais e autonômicas, que inervam ilhotas humanas.

Imagens 3D de alta resolução da rede Neuro-insular pâncreas humano

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar insulina expressando 3D pancreatoids murino de progenitores pancreático flutuantes e10.5 dissociada e a mesênquima associada.

Geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando Pancreatoids do Mouse progenitoras pancreáticas em Vitro

Ex vivo estudos de ilhotas pancreáticas são importantes para a pesquisa da diabetes. Técnicas existentes para estudar ilhotas cultivadas em sua arquitetura nativa 3-dimensional são demorados, ineficientes e raramente usado. Este trabalho descreve um método novo, simples e eficiente para a geração de cortes de parafina de alta qualidade de todo cultos Ilhéus.

Ilhota pancreatic incorporação para cortes de parafina

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Análises de célula única Transcriptomic de células endócrinas no pâncreas de rato

Apresentamos a preparação de fatias agudas de tecido pancreático e seu uso em microscopia de escaneamento a laser confocal para estudar a dinâmica do cálcio simultaneamente em um grande número de células vivas, durante longos períodos de tempo, e com alta resolução espástica.

Microscopia confocal de varredura a laser da dinâmica do cálcio em fatias agudas de tecido pancreático do rato

Este protocolo descreve como gerar fatias de pâncreas humano de doadores de órgãos falecidos para estudar a função celular em condições quase fisiológicas. Essa abordagem inovadora permite a investigação de ilhotas normais e estruturalmente danificadas e a intrincada interação entre os compartimentos endócrino e exócrino.

Geração de fatias de tecido pancreático humano para estudar a fisiologia endócrina e exócrina do pâncreas

Neste artigo, apresentamos um método baseado em microfluídicos para o confinamento de partículas com base no fluxo hidrodinâmico. Demonstramos prendendo partículas estáveis ​​em um ponto de estagnação de fluidos utilizando um mecanismo de controle feedback, permitindo assim confinamento e micromanipulação de partículas arbitrário em um microdispositivo integrado.

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