Comparação de métodos para isolar fungos entomopatômicos de amostras de solo
6 de janeiro de 2022
Colônias fúngicas entomopatômicas são isoladas de amostras de solo tropical usando isca tenebrio , isca de Galleria , bem como meio artificial seletivo, ou seja, ágar de dextrose de batata enriquecido com extrato de levedura suplementado com clorofenicol, tiaabzolendae e ciclohexmida (meio CTC).
O isolamento de fungos entomopatômicos é significativo para o desenvolvimento de um biopesticida e pode ser útil para estudar a diversidade, a distribuição e a ecologia desse grupo em particular. O uso de iscas de insetos para isolar fungos entomopatômicos é considerado um método de baixo custo e altamente eficiente. clorofenicol, thiabendazole, cicloheximida, mídia artificial não usa dodine e requer menos espaço no processo de amostra do solo.
As etapas críticas incluem investigar placas de CTC após uma e duas semanas para evitar que outros fungos se estreitam e fungos entomopatômicos em desenvolvimento e, em seguida, identifiquem colônias de fungos entomopatômicos com base em sua macrofófologia e micro morfologia. Comece coletando 800 gramas de solo a uma profundidade de 10 centímetros usando uma pequena pá. Armazene as amostras em sacos de polipropileno à temperatura ambiente até o início do experimento.
Pequenas raízes também podem ser coletadas, uma vez que fungos entomopatômicos são conhecidos por terem competência de rizosfera. Para o isolamento de fungos que utilizam clorofenicol, thiabendazol, cicloheximida ou meio artificial seletivo CTC, pesam 0,35 gramas da amostra do solo com ou sem raízes. Coloque esta amostra em um microtubo de 1,5 mililitro.
Enquanto trabalha em um armário de biossegurança, adicione um mililitro de 0,01 volume por cento de polioxyetileno sorbitan monoolenato aquose suspensão aquosa ao microtubo contendo solo e vórtice do tubo por 30 segundos. Quando feito remova e pipeta 50 microliters do supernatante no centro das placas de Petri com meio CTC. Em seguida, use uma espátula drigalski estéril de um diâmetro de seis milímetros para dispersar homogêneamente as suspensões na superfície do meio.
Incubar as placas em câmaras climáticas a 25 graus Celsius e um mínimo de 80% de umidade relativa no escuro. Após sete, 14 e 21 dias de incubação, observe as placas para o crescimento das colônias fúngicas. Para isolar os fungos usando superfície desinfetada Galleria mellonella e Tenebrio molitor larvas de estágio tardio como iscas de insetos.
Mergulhe a larva em hipoclorito de sódio de 0,5% por um minuto para esterilização. Em seguida, lave as larvas duas vezes com água estéril. Monte as iscas em potes plásticos com 10 pequenos orifícios de 10 milímetros de diâmetro na tampa contendo 250 gramas do solo coletado.
Homogeneize o solo a cada dois dias para permitir o máximo contato das larvas com o solo e analisar os vasos diariamente, buscando insetos mortos. Depois de remover insetos mortos da panela, esterilize superficialmente insetos com hipoclorito de sódio de 0,5% por um minuto. Para favorecer a micose, coloque os insetos estéreis em uma câmara úmida a 80% de umidade relativa e 25 graus Celsius por sete dias.
Na micose, retire a conidia da superfície do inseto e com a ajuda do laço microbiológico, coloque a conidia no meio de ágar de dextrose de batata contendo 0,05% clorofenicol ou meio PDAC sob um microscópio estereoscópico. Como alternativa, coloque toda a larva infectada no meio PDAC. E incubar as placas de cultura em uma câmara climática, como explicado anteriormente.
Após 14 dias de incubação, identifique as espécies de EPF analisando as características macrofóicas das culturas fúngicas nas placas descritas no manuscrito. Em seguida, transfira a conidia aérea para deslizar culturas por três dias a 80% de umidade relativa e 25 graus Celsius. Após três dias, colori o slide com azul lactofenol para observar as características microscópicas.
Sob um microscópio óptico, observe as estruturas fúngicas como arranjo, conidioforos, forma e tamanho de conidia em 400 vezes e confirme a identificação do EPF. No estudo, 51 cepas de EPF das espécies Metarhizium e Beaveria foram isoladas de 524 amostras de solo. A análise representativa mostra as características micromorfológicas de alguns isolados das espécies de Metarhizium e Beaveria.
A ocorrência de EPF nas 24 amostras de solo foi estudada utilizando-se três diferentes métodos de isolamento. A isca galleria mellonella mostrou-se mais eficiente no isolamento, seguida pela isca molitor de Tenebrio e meio CTC. As mesmas 24 amostras de solo não mostraram recuperação das espécies de Beaveria, mas apenas Metarhizium.
As coisas mais importantes a se lembrar são transferir a conidia aérea para deslizar a camada observando as características do microscópio e confirmando a identificação de fungos entomopatômicos usando teclas morfológicas. Métodos adicionais incluem o uso de outras mídias artificiais seletivas com produtos químicos específicos para reduzir o crescimento de contaminantes como dodine. Buscar novos isolados fúngicos com excelentes traços de biocontrole é crucial para aumentar a eficácia dos fungos no controle artrópode-praga e explorar mais questões no campo da patologia invertebrada.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este estudo investiga o isolamento de fungos entomopatogênicos de solos tropicais utilizando iscas de insetos, destacando a eficiência de diversos métodos. O isolamento tem como objetivo aprimorar o entendimento da diversidade fúngica e contribuir para o desenvolvimento de bioinseticidas.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Fungos entomopatogênicos
- Microbiologia do solo
- Desenvolvimento de biopesticidas
Antecedentes
- Métodos de baixo custo para o isolamento de fungos entomopatogênicos.
- Importância da avaliação de amostras de solo para estudos ecológicos.
- Utilização de meios seletivos para o isolamento eficaz de fungos.
Métodos Utilizados
- Isolamento de fungos utilizando iscas de insetos (Galleria mellonella e Tenebrio molitor).
- Uso de meios artificiais seletivos (meio CTC, ágar dextrose batata).
- Observação microscópica para identificação de espécies fúngicas.
Resultados Principais
- 51 cepas de espécies de Metarhizium e Beauveria isoladas de 524 amostras de solo.
- O isca Galleria mellonella demonstrou a maior eficiência para o isolamento fúngico.
- Nenhuma recuperação de espécies de Beauveria das amostras testadas.
Conclusões
- O estudo demonstra efetivamente métodos para o isolamento de fungos entomopatogênicos.
- Os resultados contribuem para a pesquisa em biocontrole e aplicações agrícolas potenciais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de fungos entomopatogênicos do solo é uma etapa fundamental na descoberta de biopesticidas, na qual a eficiência do método impacta diretamente a validação de alvos e a identificação de candidatos promissores. A comparação entre iscas de insetos e meios seletivos permite reduzir os riscos no triagem inicial de candidatos antifúngicos, melhorando o rendimento de isolamento e diminuindo os falsos negativos. Isso aumenta a confiança preditiva na seleção de alvos para programas de controle de pragas artrópodes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da biodiversidade fúngica em ecossistemas do solo para identificar novas linhagens de Metarhizium e Beauveria com potencial bioatividade.
- Valor Operacional: Métodos de isca com insetos (Galleria mellonella, Tenebrio molitor) proporcionam maior eficiência de isolamento do que o meio CTC, aumentando o acesso a organismos-alvo para caracterização subsequente.
- Valor Translacional: As linhagens isoladas permitem a redução de riscos mecanicistas ao associar a virulência fenotípica à identidade genética por meio de identificação morfológica e molecular.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece isolados fúngicos validados para o desenvolvimento de ensaios direcionados à patogenicidade em artrópodes e especificidade de hospedeiro.
- Valor Operacional: Protocolos padronizados de isolamento utilizando iscas inseto melhoram a reprodutibilidade e a escalabilidade na recuperação fúngica entre diferentes lotes de amostras de solo.
- Prontidão para Ensaios: Permite o preparo de culturas puras para a colheita de conídios e confirmação morfológica em lâmina, apoiando entradas consistentes para triagem fenotípica.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Sistema Relevante para Doenças: Cepas isoladas de EPF servem como modelos pré-clínicos para avaliar a virulência contra pragas de insetos, alinhando-se ao desenvolvimento de produtos de biocontrole.
- Confiança Preditiva: A identificação molecular de isolados no nível de espécie fortalece a confiança no alvo e apoia a seleção de cepas para estudos de formulação.
- Continuidade: Protocolos de isolamento estabelecidos permitem o monitoramento longitudinal da presença fúngica em solos agrícolas, contribuindo para estratégias de manejo de resistência e rotação de cepas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método de isolamento se insere em fluxos de trabalho de descoberta inicial, nos quais cepas de FPE recuperadas avançam para triagem fenotípica quanto à virulência e especificidade de hospedeiro, contribuindo para a identificação de candidatas promissoras em pipelines de biopesticidas.
- Biologia da Descoberta: Apoia testes de hipóteses sobre ecologia e patogenicidade fúngica ao permitir a recuperação de EFP de matrizes complexas de solo.
- Triagem: Gera preparações padronizadas de fungos para ensaios de virulência em alto rendimento utilizando hospedeiros insetos.
- Análises: Os resultados de identificação morfológica e molecular fornecem dados qualitativos e quantitativos para comparação e seleção de linhagens.
- Pesquisa Translacional: Conecta o isolamento ambiental à avaliação pré-clínica por meio de mecanismos de virulência conservados em Metarhizium e Beauveria.
- Reutilização Empresarial: O protocolo de isolamento utilizando iscas insetos pode ser padronizado entre diferentes locais e tipos de solo, permitindo o armazenamento escalável de linhagens fúngicas para campanhas futuras de triagem.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a diversidade de alvos e reduz a ambiguidade mecanicista na seleção de alvos de fungos entomopatogênicos (EPF) para o desenvolvimento de bioinseticidas.
- Valor Operacional: Métodos de isca para insetos oferecem maior produtividade e menor variabilidade técnica em comparação com meios seletivos, melhorando as taxas de sucesso no isolamento.
- Valor Estratégico: Permite decisões mais assertivas de avanço ou interrupção na priorização de cepas, aumentando o acesso a isolados virulentos provenientes de amostras ambientais.
- Impacto no Portfólio: Apoia o avanço com ajuste de risco ao ampliar o conjunto de cepas de EPF caracterizadas, com morfologia e identidade confirmadas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manejo de insetos, na morfologia fúngica e na técnica asséptica para a preparação da isca e colheita de conídios.
- Exige câmaras de incubação com clima controlado, mantendo 25°C e 80% de umidade para o crescimento fúngico e indução de micoses.
- A padronização entre equipes exige esterilização consistente da isca, homogeneização do solo e cronogramas padronizados para o processamento pós-micose.
- A adaptação a diferentes tipos de solo pode exigir ajustes no tempo de exposição da isca e no volume de solo, com base na prevalência nativa de FPEs.
- As limitações incluem a dependência da viabilidade larval e das condições ambientais que afetam o sucesso da micoses, conforme observado na dependência do protocolo em câmaras úmidas e etapas de esterilização superficial.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:07
Soil Sampling and Isolation Methods for Entomopathogenic Fungi (EPF)
4:29
Identification of Entomopathogenic Fungi (EPF): Metarhizium and Beauveria Species
5:21
Results: Micromorphological Characteristics and Occurrence of Entomopathogenic Fungi in Various Soil Samples
6:16
Conclusion
