Name: Geração e Expansão das Linhas tumorais primárias e malignas do mesotelioma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprenda a gerar e expandir linhas tumorais primárias de mesotelioma pleural a partir de tecido cirúrgico. Este protocolo padronizado reduz a contaminação por fibroblastos e permite estudar interações tumor-imunidade in vitro.

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Gostaríamos de reconhecer Raquel Laza-Briviesca por sua contribuição para iniciar este protocolo e os Drs. Boris Sepesi, Reza Mehran e David Rice por colaboração em coleções de tecidos. Não há financiamento adicional associado a este trabalho.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Institution Review Board (IRB) do Centro de Câncer Anderson da Universidade do Texas MD Anderson. Isso diz respeito aos tumores mpm ressecção cirúrgica e padrão removidos após o consentimento informado.
1. Preparação de mídia de digestão de tumores e outras mídias associadas
<ol><li>Para preparar a mídia de digestão tumoral, adicione 5 mL de 100% Pen/Strep (Penicillin/Streptomycin) a 500 mL de estéril Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 médio em uma capa de fluxo laminar.<ol>
<li>Transfira o filtro estéril médio para 500 mL, 0,22 μm poliethersulfone (PES) para filtragem a vácuo. NOTA: As etapas de filtragem e aspiração devem ser realizadas com uma pressão padrão de vácuo de 75-150 torr.</li>
		<li>Rotule e atue o meio de digestão do tumor e armazene-o a 4 °C. NOTA: O médio pode ser armazenado por 1 mês a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para preparar o coquetel enzimático de digestão do tumor, adicionar 2,5 mL de 3% de colagenase tipo 1, 1 mL de 1,5 mg/mL de higina, 20 μL de 250.000 unidades/mL DNAse 1 a 16,5 mL de meio de digestão em um tubo cônico de 50 mL em um capô de fluxo laminar a 1. NOTA: O volume total do coquetel enzimático de digestão do tumor é de 20 mL; no entanto, apenas 10 mL é necessário por amostra de tumor. Como tal, o coquetel restante pode ser armazenado a -20 °C até que seja necessário. Não recongele alíquotas.</li>
	<li>Para preparar o meio tumoral completo, adicione 5 mL de 100% Pen/Strep e 50 mL de soro bovino fetal (FBS) a 500 mL de RPMI 1640 estéril em uma capa de fluxo laminar.<ol>
<li>Transfira o médio para um filtro estéril pes de 500 mL e 0,22 μm para filtração a vácuo.</li>
		<li>Rotule e data o meio tumor completo e armazene-o a 4 °C. NOTA: O médio pode ser armazenado por 1 mês a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para preparar o meio de soro reduzido para a fome, adicione 5 mL de 100% De Caneta/Estreptococos e 5 mL de FBS a 500 mL de RPMI 1640 estéril em uma capa de fluxo laminar.<ol>
<li>Transfira o médio para um filtro estéril pes de 500 mL e 0,22 μm para filtração a vácuo.</li>
		<li>Rotule e data o meio de soro reduzido e armazene-o a 4 °C. NOTA: O médio pode ser armazenado por 1 mês a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para preparar o meio de congelamento, adicione 5 mL de sulfóxido de dimetil (DMSO) a 45 mL de FBS em uma capa de fluxo laminar.<ol>
<li>Transfira o médio para um filtro estéril pes de 50 mL e 0,22 μm para filtração a vácuo.</li>
		<li>Rotule e data cinco tubos cônicos de 15 mL.</li>
		<li>Transfira 10 mL de meio de congelamento para cada tubo e armazene os tubos a -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para preparar o meio sem antibióticos para o teste de mycoplasma, adicione 50 mL de FBS a 500 mL de RPMI 1640 estéril em uma capa de fluxo laminar.<ol>
<li>Transfira o médio para um filtro estéril pes de 50 mL e 0,22 μm para filtração a vácuo.</li>
		<li>Rotule e data o meio sem antibióticos e armazene-o a 4 °C. NOTA: O médio pode ser armazenado por 1 mês a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para preparar o tampão de triagem celular ativado pela fluorescência (FACS) para análise fenotípica, adicione 16,6 mL de albumina de soro bovino estéril a 500 mL de salina estéril tamponada de fosfato (PBS) em um capô de fluxo laminar.<ol>
<li>Rotule e data o buffer FACS e armazene-o a 4 °C. NOTA: O tampão FACS não requer esterilização do filtro, desde que ambos os componentes estejam armazenados estéreis. O buffer FACS pode ser armazenado antes da abertura por 6 meses a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Digestão do tecido tumoral
<ol><li>Transfira 10 mL de coquetel enzimático de digestão tumoral da etapa 1.2 para um tubo de dissociação.</li>
	<li>Transfira o pedaço do tecido tumoral para uma tampa de placa estéril de 6 poços usando um bisturi estéril. NOTA: A quantidade de meio transferido com o tecido tumoral é suficiente para o processamento.<ol>
<li>Remova todos os tecidos gordurosos, tecido necrosado e/ou coágulos sanguíneos usando um novo bisturi estéril e fórceps. NOTA: O tecido gorduroso é normalmente amarelado na aparência e semisólida. O tecido necrosado é mais escuro que o tecido circundante na aparência e muito macio; tanto o tecido gorduroso quanto o necrosado se desfazão facilmente. O tecido sangrento parece vermelho brilhante e pode liberar sangue para o meio quando manipulado. Uma vez removido, o tecido tumoral resultante deve manter a forma e ser pálido ou rosa, dependendo do tipo de tecido.</li>
		<li>Corte todo o tecido tumoral em 1 mm3 pequenos fragmentos. Para garantir que o tecido não seque, adicione 500 μL de solução de sal balanceado estéril de 1x Hank 's (HBSS) ao tecido tumoral.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfira fragmentos tumorais para o tubo de dissociação contendo 10 mL de coquetel enzimático de digestão tumoral (passo 2.1). Feche o tubo firmemente, coloque-o lado da tampa para baixo sobre o dissociador de tecido, e adicione o aparelho de aquecedor aplicando-o como uma manga sobre o tubo de dissociação e pressionando para clicar no lugar. NOTA: A capacidade máxima para cada tubo é de 4 g de tumor e volume de 10 mL.</li>
	<li>Selecione a configuração pré-programada no 37C_h_TDK_1 dissociador. Verifique o status após 10 minutos para garantir que não haja erro de entupimento conforme indicado pela luz vermelha piscando. NOTA: Este programa processa a 1.865 rpm por 1h com temperatura em 37 °C. NOTA: Se ocorrer entupimento, remova o tubo de dissociação e gire-o manualmente para desalojar qualquer tecido preso na tampa; em seguida, substitua o tubo sobre o dissociador e retome o programa.</li>
	<li>Após a digestão de 1 h, remova o tubo de dissociação e coloque-o em uma coifa de fluxo laminar. Filtre o tumor digerido colocando um coador de células de 70 μm em cima de um tubo cônico de 50 mL e tubos do tumor digerido usando uma pipeta de 10 mL no filtro. Se o filtro obstruír, mude para um novo filtro.<ol>
<li>Enxágüe o tubo de dissociação com 10 mL de mídia de digestão de tumores frescos e passe a lavagem através do filtro.</li>
		<li>Remova o filtro de 70 μm e descarte-o.</li>
		<li>Leve o volume total para 40 mL com meio de digestão tumoral.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar a 500 × g por 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Usando uma pipeta aspirando de 2 mL presa a uma fonte de vácuo, aspire o supernatante sem perturbar a pelota, e resuspenque as células usando 10 mL de meio tumor completo estéril.</li>
	<li>Repita o passo 2.6.</li>
	<li>Aspire o supernante como descrito na etapa 2.7. Resuspenque as células em 3 mL de meio tumor completo estéril e transfira a suspensão celular para um poço de uma placa estéril de 6 poços.</li>
	<li>Mantenha a placa em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2.</li>
	<li>Após 24 horas, transfira o meio usado do tumor digerido em bem 1 para um novo poço (bem 2) na mesma placa de 6-bem. Adicione 3 mL de tumor completo estéril ao poço 1.</li>
	<li>Transfira o meio usado dos poços 1 e 2 e combine em bem 3 na mesma placa de 6-bem 24 horas após a etapa 2.11. Adicione 3 mL de meio tumor completo estéril nos poços 1 e 2.</li>
	<li>Aspire o médio de todos os 3 poços e pipeta 3 mL de meio tumor completo em cada poço 48 h após a etapa 2.12.</li>
</ol>3. Geração de linha celular tumoral primária
<ol><li>Usando um microscópio de fase invertida, determine a porcentagem de contaminação do fibroblasto na cultura de passagem precoce. NOTA: Os fibroblastos são geralmente longos e irregulares e têm uma membrana celular mal definida. Eles parecem magros ou planos em uma escala Z.<ol>
<li>Se a contaminação do fibroblasto for superior a 20% das células da cultura de passagem precoce, continue a cultivar após substituir o meio completo por meio de soro reduzido.</li>
		<li>Repita a substituição com meio de soro reduzido na etapa 3.1.1 duas vezes por semana durante 3-4 semanas.</li>
		<li>Quando a cultura atingir 80% de confluência, passagem as células dividindo 50:50 em 2 novos poços de uma placa de 6 poços. Continue a passar 50:50 em mídia de soro reduzido uma vez que as células atingem 80% de confluência.</li>
		<li>Repita o passo 3.1.3 por até 4 semanas, passando em frascos de cultura maiores conforme necessário, dividindo 50:50 quando a cultura atinge 80% de confluência. Se a população de fibroblasto não for reduzida a 10% ou menos, continue a etapa 3.2 para tentar o método diferenciado de trippsinização para remover a contaminação do fibroblasto. Caso contrário, prossiga para a etapa 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para enriquecer para as células tumorais, enxágue suavemente o poço com 1x PBS para remover o soro médio contendo.<ol>
<li>Adicione trippsina da seguinte forma: 1 mL por bem se em uma placa de 6 poços, 2 mL para um frasco T25, 3 mL para um frasco T75.</li>
		<li>Coloque a placa de 6 poços ou o frasco em uma incubadora a 37 °C por 1 min. Remova a placa ou o frasco da incubadora e verifique a adesão das células usando um microscópio invertido. Se as células estiverem parcialmente levantando ou flutuando, remova suavemente as células suspensas e tente apenas. Coloque as células em um tubo cônico de 15 mL contendo um volume igual ou maior de meio tumor completo. NOTA: Esta coleta parcial de células baseadas em propriedades de adesão é a primeira de múltiplas frações.</li>
		<li>Repita as etapas 3.2.1 e 3.2.2 até que todas as células sejam levantadas, ou haja 4 frações removidas.</li>
		<li>Centrifugar todas as frações independentes a 500 × g por 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspire o supernante conforme descrito na etapa 2.7, e resuspenque as células usando 5 mL de meio estéril e reduzido de soro.</li>
		<li>Coloque as células em um frasco T25 para cada fração e coloque os frascos em uma incubadora a 37 °C.</li>
		<li>Avalie a cultura após 48 horas para determinar qual fração é enriquecida para células tumorais versus fibroblastos. Descarte frascos ricos em fibroblastos. Se a contaminação do fibroblasto for <10%, continue a expansão em meio tumor completo e prossiga para a etapa 4. Se a contaminação do fibroblasto for de 10 a 30%, a repetição das etapas 3.1.2-3.1.4. Se a contaminação do fibroblasto for superior a 30%, repetimos as etapas 3.2-3.2.7.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se poucos ou nenhum fibroblastos forem detectados dentro da cultura de passagem precoce, continuem a passar as células em meio tumor completo, dividindo 50:50 uma vez que as células são 80% confluentes em sua placa de 6 poços ou frasco.</li>
</ol>4. Expansão da linha celular tumoral primária de passagem precoce
<ol><li>Uma vez que a cultura tumoral primária contenha 10% ou menos de contaminação por fibroblasto, aspire o meio e substitua-o por meio tumor completo estéril duas vezes por semana. NOTA: O volume médio ideal para um T25 é de 5 mL; T75 tem 12 mL; T150 é de 25 mL.<ol>
<li>Passar a cultura 50:50 em frascos maiores conforme necessário, uma vez que atinge 80% de confluência na placa ou frasco. NOTA: A cultura pode precisar ser passagem em uma proporção maior dependendo do seu crescimento. Ajuste para que a cultura atinja 80% de confluência a cada 3-5 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passagem até a cultura está na passagem 4 ou superior. Uma vez que a cultura é 80% confluente em um mínimo de dois frascos T75, continue a passo 5.</li>
</ol>5. Caracterização e banco da linha celular tumoral primária estabelecida
<ol><li>Criopreserve um frasco T75 como um congelamento de passagem antecipada. Para o teste de mycoplasma dos frascos T75 restantes, continue a etapa 5.2.<ol>
<li>Para criopreservação de células de passagem precoce, descongele 1 tubo de meio de congelamento aliquoted preparado na etapa 1.5.</li>
		<li>Colete as células por experimentação, primeiro lavando a placa com 1x PBS como descrito na etapa 3.2 e adicionando trippsina conforme descrito na etapa 3.2.1.</li>
		<li>Coloque o frasco em uma incubadora a 37 °C por 3 min. Remova o frasco da incubadora e verifique a adesão das células usando um microscópio invertido. Se as células estiverem levantando ou flutuando, remova suavemente as células suspensas e a trippsina. Coloque as células em um tubo cônico de 15 mL contendo um volume igual ou maior de meio tumor completo. NOTA: Se as células permanecerem aderentes após 3 min, coloque o frasco de volta na incubadora por mais 2 minutos.</li>
		<li>Misture bem o tubo por tubos suavemente e remova 20 μL para contar.</li>
		<li>Centrifugar o tubo a 500 × g por 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Enquanto as células estão girando, conte usando um protocolo de contagem específico de laboratório, como azul trypan ou iodeto de acridina laranja/propídio (AO/PI).</li>
		<li>Resuspengue as células após a centrifugação em meio de congelamento com um mínimo de 2 × 106 células/1 mL meio de congelamento.</li>
		<li>Transfira 1 mL da suspensão celular da etapa 5.1.7 para criovials de 1,5 mL pré-rotulados.</li>
		<li>Coloque os criovias em uma câmara de congelamento de taxa controlada e transfira-as imediatamente para -80 °C.</li>
		<li>Armazene as células a -80 °C por até 1 semana antes de transferi-las para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.</li>
	</ol></li>
	<li>Divida um frasco T75 às 50:50 para o teste de mycoplasma. Alterar o meio médio para o meio sem antibióticos preparado na etapa 1.6.<ol>
<li>Depois de 72 h, descongele o reagente de detecção de mycoplasma, substrato e controles em temperatura ambiente por 15 minutos antes do teste.</li>
		<li>Colete 1 mL do supernaente de cada cultura a ser testado e coloque-o em um tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Pelota qualquer célula suspensa por centrifugação do supernante a 500 × g por 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Carregue 100 μL de supernacantes de amostra e controles em uma placa branca de 96 poços. Adicione 100 μL de reagente de detecção de mycoplasma a cada amostra e controle.</li>
		<li>Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.</li>
		<li>Coloque a placa em um leitor de placas e leia a luminescência (Leitura A, ou seja, primeira leitura). NOTA: O protocolo do fabricante do kit mycoplasma indica manter as configurações padrão nos leitores de placas multifuncionais. A leitura é definida no ponto final da Luminescência com um tempo de integração de 1 s e ganho de 135. O leitor de placas usa uma rotina de escala automática para otimizar o sinal de ganho para cada experimento. O tempo de integração de 1 s é padrão padrão. Ambas as configurações são usadas para ajustar a intensidade do sinal luminescente interpretado pelo leitor de placas e podem precisar ser ajustadas dependendo do leitor de placas individuais.</li>
		<li>Remova a placa do leitor de placas e adicione 100 μL do substrato de detecção de mycoplasma a cada amostra e aos controles.</li>
		<li>Incubar por 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Coloque a placa no leitor de placas e leia a luminescência (Leitura B, ou seja, segunda Leitura).</li>
		<li>Para determinar a positividade do micoplasma, determine a razão da leitura B com a leitura A. NOTA: As razões de positividade do mycoplasma são descritas no protocolo do fabricante do kit mycoplasma. As leituras A e B são adquiridas com as mesmas configurações e simplesmente refletem a ordem de leitura.<ol>
<li>Considere uma razão < 1 para ser mycoplasma negativo.</li>
			<li>Considere uma razão de 1-1.2 para ser inconclusiva e repetir o passo 5.2.</li>
			<li>Considere uma razão > 1,2 para ser mycoplasma-positiva e monitorar essa cultura; acabar com a cultura, se necessário.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Caracterização da citometria de fluxo das células tumorais mycoplasma-negativa<ol>
<li>Desalojar as células tumorais usando tampão de dissociação celular.</li>
		<li>Conte as células e resuspenda as células a 1 × 106/mL no buffer FACS a partir da etapa 1.7.</li>
		<li>Remova 100 μL de suspensão celular em tubos individuais para coloração superficial.</li>
		<li>Centrifugar a 500 × g por 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspire os receptores supernacantantes e bloqueiem os receptores Fc incubando as células em 500 μL de soro de cabra de 5% no tampão FACS à temperatura ambiente por 10 minutos.</li>
		<li>Adicione 2 mL de tampão FACS e centrifule a suspensão a 500 × g por 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspire o supernasciente e adicione a mistura de manchas de superfície de anticorpos (Tabela 1) e tampão FACS de modo que o volume final seja de 100 μL. Cubra as amostras e manche-as no gelo por 30 minutos.</li>
		<li>Repita o passo 5.3.6.</li>
		<li>Aspire o supernasal e fixe as células resuscupando em 200 μL de 1% de paraformaldeído (PFA) mais 0,25% EtOH. Incubar em temperatura ambiente por 20 minutos com as amostras protegidas da luz.</li>
		<li>Repita o passo 5.3.6. Resuspende as células em 200 μL de tampão FACS para aquisição usando um citômetro de fluxo apropriado. NOTA: Espera-se que as células tumorais de mesotelioma sejam positivas para a mesotelina e a N-cadherina. Alguns também podem expressar CD90.</li>
	</ol></li>
	<li>Expanda em meio e banco tumor completo, conforme descrito nas etapas 4.1 e 5.1, respectivamente.</li>
</ol>

<ol><li>Guzman-Casta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+factors+for+progression-free+and+overall+survival+in+malignant+pleural+mesothelioma%5BTitle%5D)+AND+%22Thoracic+Cancer%22%5BJournal%5D)">Prognostic factors for progression-free and overall survival in malignant pleural mesothelioma.</a> Thoracic Cancer. 12 (7), 1014-1022 (2021).</li>
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</ol>

Ch é membro da SAB for Briacell Therapeutics e da Mesothelioma Applied Research Foundation. Todos os outros autores não têm nada a revelar.

Embora este protocolo seja simples, existem alguns passos críticos que devem ser seguidos de perto. O congelamento da passagem precoce é importante para preservar a capacidade de repetir o processo de enriquecimento tumoral-células, se inicialmente mal sucedido. A capacidade de avaliar a contaminação fibroblástica pelo olho para decidir a técnica correta de divisão e fome da mídia é vital para evitar o crescimento excessivo do fibroblasto na cultura. Além disso, o método diferencial de trippsinização requer uma observaçã...

O mesotelioma pleural maligno (MPM) é um tumor raro altamente associado à exposição ao amianto. Embora as abordagens baseadas em imunoterapia tenham mostrado resultados encorajadores, há uma escassez de opções de tratamento disponíveis para os pacientes que desenvolvem essa doença, e a taxa geral de sobrevivência de 5 anos é baixade 1,2. Esforços estão em andamento em várias instituições para entender melhor essa doença e identificar novos alvos terapêuticos que possam melhorar os resultados dos pacientes. Embora existam vários modelos de camundongos de mesotelioma, o acesso às células tumorais primárias do mesotelioma é mais limitado3. A expansão in vitro das células tumorais primárias do mesotelioma forneceria um valioso sistema modelo que pode ser utilizado para estudar diretamente as células tumorais e sua interação com células imunes autólogas, como linfócitos infiltrados em tumores. Embora tenha havido relatos sobre a expansão das linhas primárias de células tumorais de mesotelioma, estas são poucas e não fornecem um procedimento padrão de operação (SOP) detalhado. Além disso, poucas linhas de celular estão disponíveis a partir de fontes comerciais, como a American Type Culture Collection (ATCC). Embora a disponibilidade de linhas tumorais primárias seja limitada, foi demonstrado que as células tumorais podem ser expandidas a partir de derrames pleurais e diretamente do tecido tumoral 4,5. Além disso, linhas de células tumorais expandidas têm sido demonstradas para preservar o perfil molecular do tumor original 4,5,6.
Nosso laboratório está estudando o microambiente tumor-imune do MPM e desenvolveu um método para expandir as linhas primárias de células tumorais mpm a partir de casos ressecados cirurgicamente. Este método é adaptado de nossa experiência no estabelecimento de linhas celulares tumorais de melanoma metastático primário. O objetivo deste trabalho é fornecer uma abordagem detalhada e prática para a expansão da linha de tumores mesotelioma primário usando um sistema modelo 2D e perfil fenotípico subsequente. Dado o sucesso recente das estratégias de bloqueio de checkpoint visando CTLA4 e PD-1 na configuração de primeira linha2, a capacidade de gerar muitas linhas tumorais primárias poderia promover a compreensão de ambos os mecanismos intrínsecos de resistência tumorais, bem como fornecer um importante sistema de modelo para avaliar o reconhecimento de células T, aprofundando assim nossa compreensão da resposta imune no MPM.
A maior limitação deste protocolo é que cada tumor contém um microambiente diferente, e há um alto grau de variabilidade do sucesso de expansão. Além disso, este método seleciona para células tumorais que podem se expandir em um sistema de cultura 2D. Outros métodos que envolvem a produção de uma cultura esferoide ou organoide 3D poderiam fornecer uma abordagem alternativa que pode permitir uma maior taxa de sucesso de expansão ou resultar na capacidade de derivar linhas celulares que são incapazes de se expandir em um sistema 2D tradicional. Tais culturas 3D têm sido demonstradas como úteis para a geração de tipos de tumores que são difíceis de expandir, por exemplo, o câncer de pâncreas7.

<table><tbody><tr><td>Pipetas sorológicas de 10 mL</td><td>BD Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 15 mL BD</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>pipetas de aspiração de 2 mL</td><td>BD Falcon</td><td>357558</td><td></td></tr><tr><td>pipetas sorológicas de 5 mL</td><td>BD Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>tubos cônicos de 50 mL BD</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>microplacas de 6 poços, cultura de tecidos tratado</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td>Uma mistura de protease-colagenase considerada mais eficaz na preservação de epítopos para citometria de fluxo.</td></tr><tr><td>anti-CD325 (N-caderina) PE</td><td>Invitrogen</td><td>12-3259-42</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD90 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>561558</td><td></td></tr><tr><td>anti-mesotelina APC</td><td>Miltenyi</td><td>130-118-096</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino 30%</td> <td>Sigma</td><td>A8577-1L</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de dissociação celular, sem enzimas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13151014</td><td></td></tr><tr><td>Cell coador (70 &micro; m)</td> <td>Greiner Bio-One</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga com adaptadores</td><td></td><td></td><td></td>de 15 mL e 50 mL</tr><tr><td>Colagenase Tipo 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0130</td><td>Dissolva 1,5 g de Colgenase tipo I em 100 mL de DMEM estéril e alíquota em volumes de 5 mL. Rotule bem e armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Câmara de congelamento de taxa controlada</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-350-50</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td></td></tr><tr><td>CulturPlate-96</td><td>Packard Instrument Company</td><td>6005680</td><td>Microplaca branca e opaca de 96 poços.</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I (de pâncreas bovino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>Aliquot at 50 &mu; L, rotule bem e armazene a -20 ° C. Após o descongelamento, mantenha a 4 & C por até 1 mês.</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 prova</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubos-filtro superior</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal</td><td>bovino Gemini-Bio</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C-tubes</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Octo-dissociador com aparelho aquecedor</td><td>Miltenyi</td><td>130-096-427</td><td>Inclui mangas de aparelhos aquecedores especializados usados para aplicar calor aos tubos C durante a dissocação.</td></tr><tr><td>Soro de cabra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>Alíquota e armazenar a -20 °C.</td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hank, 500 mL</td><td>de Corning</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td>Dissolva 0,15 g de Hialuronidase em 100 mlL de DMEM estéril e distribua em alíquotas de 1,0 mL. Rotule bem e armazene a -20 ° C.</td></tr><tr>Microscópio <td></td><td></td><td></td><td>de fase invertida</td></tr><tr>Capuz <td></td><td></td><td></td><td>de fluxo laminar</td></tr><tr><td>Corante amarelo vivo/morto Pontas</td> de micropipetador <td>Life Technologies</td><td>L-34968</td><td></td></tr><tr><td>, 20 &micro; L</td><td>ART</td><td>2149P</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor, 0.5-20 &micro; L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mycoalert conjunto de controle de ensaio</td><td>Lonza</td><td>LT07-518</td><td>Alíquota controles positivos e armazenar a -20 °C.</td></tr><tr><td>Kit de detecção de micoplasma Mycoalert Plus</td><td>Lonza</td><td>LT07-710</td><td>Reagente e substrato de alíquota e armazene a -20 ° C. Guarde o tampão e a alíquota restantes para controle negativo e armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Paraformaldeído 16%</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>15710</td><td>Prepare o estoque filtrando através de um filtro de seringa de PVDF (Millex cat. no. SLVV033RS) e alíquota sob uma hotte. Armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina 10,000 U/mL</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Auxiliar</td><td></td><td></td><td></td>de pipeta</tr><tr><td>Leitor de placas com capacidades luminescentes</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td>qualquer leitor de placas com estas especificações pode ser usado</td></tr><tr><td>Mídia RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Andwin</td><td>2975#21</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de filtração a vácuo estéril Stericup Quick Release-GP, 0.22 &micro; m PES Express PLUS, 500 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>filtro Steriflip-GP, 0,22 &micro; m PES Express PLUS, 50 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>pinça estéril Frascos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-000-157</td><td></td></tr><tr><td>T25, frascos</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>T75 tratados com cultura de tecidos,</td> solução de azul de tripano <td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr> tratada com cultura de tecidos <tr><td>0,4%</td> <td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 0,05% </td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>ViaStain solução de laranja de acridina/iodeto de propídio (AO/PI)</td><td>Nexcelom</td><td>CS2-0106-5ML</td><td></td></tr></tbody></table>

geração e expansão das linhas tumorais primárias e malignas do mesotelioma

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

As metodologias atuais para a expansão das linhas primárias de células tumorais de tipos raros de tumores estão em falta. Este protocolo descreve métodos para expandir as células tumorais primárias a partir de mesotelioma pleural ressecado cirurgicamente e maligno (MPM), fornecendo uma visão geral completa do processo desde a digestão até o enriquecimento, expansão, criopreservação e caracterização fenotípica. Além disso, este protocolo introduz conceitos para a geração de tumores que podem ser úteis para vários tipos de tumores, como a trippsinização diferencial e o impacto dos métodos de dissociação na detecção de marcadores de superfície celular para caracterização fenotípica. A maior limitação deste estudo é a seleção de células tumorais que se expandirão em um sistema de cultura bidimensional (2D). Variações neste protocolo, incluindo sistemas de cultura tridimensional (3D), suplementos de mídia, revestimento de placas para melhorar a adesão e métodos alternativos de desagregação, poderiam melhorar essa técnica e a taxa de sucesso geral do estabelecimento de uma linha de tumor. No geral, este protocolo fornece um método base para estabelecer e caracterizar células tumorais a partir deste tumor raro.

Para determinar a contaminação do fibroblasto das culturas de passagem precoce, as células são avaliadas usando um microscópio de fase invertida para identificar a frequência de fibroblastos em relação às outras células aderentes presentes. A Figura 1 mostra exemplos de aumento da contaminação do fibroblasto de 80% (Figura 1A), 50% (Figura 1B) e 30% (Figura 1C), em comparação com uma cultura sem contami...

O objetivo deste artigo método é demonstrar uma metodologia robusta e reprodutível para o enriquecimento, geração e expansão das linhas celulares tumorais primárias a partir de mesotelioma pleural ressecado cirurgicamente.

Geração e Expansão das Linhas tumorais primárias e malignas do mesotelioma

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

Este protocolo fornece uma base para a expansão das células tumorais que, por sua vez, permite um estudo aprofundado da função celular tumoral e estados genômicos. Além disso, fornece um sistema de modelo in vitro para avaliar o impacto do tumor na resposta imune. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um protocolo baseado para estabelecer linhas de tumores mesotélios a partir do tecido do paciente.No momento, não há um protocolo padronizado para este sistema de modelos. O aspecto mais difícil desta técnica é a presença de contaminação do fibroblasto em culturas de passagem precoce. É fundamental ter uma compreensão sólida dos fibroblastos versus morfologia das células tumorais para determinar se as tentativas de fome do fibroblasto estão funcionando.Comece transferindo 10 mililitros de tumor digerindo coquetel enzimático para um tubo de dissociação. Transfira o pedaço de tecido tumoral para uma tampa de placa estéril de seis poços usando um bisturi estéril. Remova todos os tecidos necróticos gordurosos e coágulos sanguíneos usando um novo bisturi estéril e fórceps.Corte todo o tecido tumoral em um pequeno fragmento cúbico. Para garantir que o tecido não seque, adicione 500 microliters da solução de Sal Balanceado estéril hank, ou HBSS, ao tecido tumoral. Transfira fragmentos tumorais para o tubo de dissociação contendo 10 mililitros de coquetel enzimático de digestão tumoral.Feche o tubo firmemente. Coloque-o de lado para baixo sobre o dissociador do tecido e forneça calor ao dissociador. Selecione a configuração pré-programada no dissociador para a configuração do kit de dissociação do tumor humano de 37 graus Celsius e verifique o estado após 10 minutos para garantir que nenhum erro de entupimento seja indicado pela luz vermelha piscando.Após uma hora, remova o tubo de dissociação e coloque-o em um capô de fluxo laminar. Filtre o tumor digerido colocando um coador de células de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros e tubos do tumor digerido usando uma pipeta de 10 mililitros no filtro. Se o filtro obstruír, mude para um novo filtro.Enxágüe o tubo de dissociação com 10 mililitros de mídia de digestão de tumores frescos e lave através do filtro. Remova e descarte o filtro. Leve o volume total para 40 mililitros com o meio de digestão do tumor.Centrifugar a 500 x g por cinco minutos em temperatura ambiente. Usando uma pipeta aspiradora de dois mililitros presa a uma fonte de vácuo, aspire o supernaente sem perturbar a pelota e resuspenque as células usando 10 mililitros de meio tumor estéril. Então, novamente, centrifugar os tubos e aspirar o supernante como demonstrado.Em seguida, resuspenque as células em três mililitros de meio tumor estéril e transfira a suspensão celular para um poço de uma placa estéril de seis poços. Mantenha a placa em uma incubadora a 37 graus com 5% de dióxido de carbono. Após 24 horas, transfira o meio usado do tumor digerido em um poço para um novo poço na mesma placa de seis poços, em seguida, adicione três mililitros de tumor estéril médio para bem um.Usando um microscópio de fase invertida, determine a porcentagem de contaminação de fibroblastos na cultura de passagem precoce. Se a contaminação dos fibroblastos for superior a 20% das células na cultura de passagem precoce, continue a cultivar após substituir o meio tumoral pelo meio sérico reduzido. Se a população de fibroblasto não for reduzida a 10% ou menos, enxágue suavemente o poço com PBS para remover o soro médio contendo.Adicione um mililitro de trippsina por poço em uma placa de seis poços. Coloque a placa de seis poços ou o frasco em uma incubadora a 37 graus Celsius por um minuto. Remova a placa ou o frasco da incubadora e verifique a adesão das células usando um microscópio invertido.Quando as células estiverem parcialmente levantando ou flutuando, remova suavemente as células suspensas e tente apenas. Coloque as células em um tubo cônico de 15 mililitros contendo um volume igual ou maior de meio tumor completo. Repita o trypsinizante até que haja três a quatro frações removidas.Centrifugar todas as frações independentes a 500 x g durante cinco minutos em temperatura ambiente. Usando uma pipeta aspiradora de dois mililitros presa a uma fonte de vácuo, aspire o supernatante sem perturbar a pelota. Resuspend as células usando cinco mililitros de meio sérico reduzido estéril.Plaque as células em um frasco T-25 para cada fração e coloque os frascos em uma incubadora a 37 graus Celsius. Para criopreservação de células de passagem precoce, descongele um tubo de meio de congelamento aliquoted. Colete as células por experimentação, primeiro lavando a placa com PBS e adicionando trippsina como demonstrado anteriormente.Coloque o frasco em uma incubadora a 37 graus Celsius por três minutos. Remova o frasco da incubadora e verifique a adesão das células usando um microscópio invertido. Se as células estiverem levantando ou flutuando, remova suavemente as células suspensas e a trippsina.Coloque as células em um tubo cônico de 15 mililitros contendo um volume igual ou maior de meio tumor completo. Misture o conteúdo do tubo por pipetar suavemente. Remova 20 microliters de suspensão celular para contagem.Em seguida, centrifufique a suspensão restante da célula a 500 x g por cinco minutos em temperatura ambiente. Quando as células estiverem girando, conte usando um protocolo de contagem específico de laboratório, como azul trypan ou iodeto de laranja/propídio de acridina. Resuspengue as células após a centrifugação em meio congelado com um mínimo de 5 x 10 para a sexta células por mililitro de meio congelado e transfira um mililitro desta suspensão celular para 1,5 mililitro pré-rotulado de criovials.Coloque os criovias em uma câmara de congelamento de taxa controlada e transfira-os imediatamente para menos 80 graus Celsius. O número mostra uma contaminação crescente de fibras de 80%50% e 30% em comparação com uma cultura sem contaminação por fibroblastos. Esta figura mostra a coloração representativa da superfície da citometria de fluxo de quatro linhas primárias de tumores de mesotelioma, MESO171, MESO176, NCIH2452, MS TO-211H e uma linha de tumor de melanoma, MEL526 como controle negativo.Estas linhas de celular podem expressar tanto mesothelin quanto N-cadherin. A importância de testar o impacto do descolamento enzimático na expressão do marcador de proteína superficial também é mostrada como tanto a trippsina quanto a mistura de colagenase protease resultou na perda da expressão superficial de N-cadherin, enquanto o CD90 não foi impactado. Passos importantes incluem o processamento adequado do tumor, incluindo a remoção de sangue e gordura antes da digestão, identificar a contaminação do fibroblasto e determinar como limitar o crescimento excessivo do fibroblasto é vital.Um método importante após este procedimento inclui ensaios de linfócito citotóxico para testar a capacidade das células T autólogas de reconhecer células tumorais derivadas do paciente. Esta técnica identificará novos receptores de células T anti-tumores que podem ser de importância terapêutica. Além disso, nos permitirá estudar a interação entre tumor e tumor emparelhado infiltrando linfócitos e disfunção imunológica.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

O ensaio de depuração mesotelial descrito aqui leva vantagem das células marcadas com fluorescência e de microscopia de lapso de tempo de vídeo para visualizar e medir quantitativamente as interações de esferóides de câncer de ovário multicelulares e monocamadas de células mesoteliais. Este ensaio modela os passos iniciais da metástase do câncer de ovário.

Ensaio in vitro de Apuramento mesotelial que os modelos dos primeiros passos da metástase do câncer de ovário

Este vídeo demonstra um método para gerar um modelo de disseminação pleural em camundongos injetando suspensão de células de câncer de pulmão na cavidade torácica de um camundongo imunodeficiente.

Estabelecendo um modelo de camundongo de câncer de pulmão disseminado pleural

O objetivo deste protocolo é estudar a tumorigênese mamária. Com esta técnica, os tumores mamários de camundongos são removidos e as células primárias são preparadas a partir dos tumores. Um protocolo de extração pulmonar está incluído para estudar metástases pulmonares. Além disso, outro protocolo para análise de fibroblastos embrionários de camundongo do embrião de camundongo está incluído.

Tumor primário e isolamento de células MEF para o Estudo de metástases pulmonares

A geração de um modelo de rato ortotópico de mesotelioma pleural maligno por implantação de II-45 células de mesotelioma na cavidade pleural de ratos imuno-competentes é apresentado. Um método de citometria de fluxo para analisar sete subconjuntos de células imunitárias em animais a partir destes uma amostra de sangue de 25 uL é também descrito.

Orthotopic Implantação e Acompanhamento Peripheral Imune celular no Modelo II-45 Rat Singênico mesotelioma

Apresentamos aqui um método de cultura de células para a indução de transições mesenquimais-epiteliais (MET) em células de sarcoma com base na expressão ectópica combinado de microARN-200 e os membros da família grainyhead-like 2 (GRHL2). Este método é adequado para a melhor compreensão do impacto biológico de plasticidade fenotípica sobre a agressividade e tratamentos do cancro.

A indução de transições mesenquimais-epiteliais em células de sarcoma

O objetivo deste artigo é fornecer uma descrição detalhada do protocolo para o ensaio de metástase pulmonar (PuMA). Este modelo permite aos pesquisadores estudar o crescimento de células metastáticas osteossarcoma (OS) no tecido pulmonar, usando um widefield fluorescência ou microscópio confocal de varredura a laser.

Considerações práticas em estudar a colonização de pulmão metastático em osteossarcoma usando o ensaio de metástase pulmonar

Nós descrevemos um método para melhorar significativamente a enxertia ortotópico de células de câncer de pulmão aos pulmões murino pelo pré-condicionamento das vias aéreas com lesão. Esta abordagem também pode ser aplicada para estudar interações do estroma dentro do microambiente pulmonar, disseminação metastática, co-morbidades do câncer pulmonar, e gerar mais eficiência paciente derivada xenografts.

Pré-condicionamento das vias aéreas de ratos com bleomicina aumenta a eficiência da enxertia de célula de câncer pulmão ortotópico

O seguinte protocolo incide sobre o estabelecimento de uma cultura primária de sarcoma de tecidos moles paciente-derivado (STS). Este modelo pode nos ajudar a compreender melhor o fundo molecular e perfil farmacológico destas malignidades raras e poderia representar um ponto de partida para novas pesquisas que visam melhorar a gestão do STS.

Estabelecimento de uma cultura primária de Sarcoma macio do tecido derivado de paciente

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar um modelo de pele de esferoide melanoma de organotypic 3D que recapitula os dois a arquitetura e complexidade multicelular de um órgão/tumor na vivo , mas ao mesmo tempo acomoda sistemática experimental intervenção.

Um modelo de pele Melanoma de Organotypic 3D esferoide

O protocolo atual descreve métodos para estabelecer modelos paciente-derivados do xenograft (PDX) e linhas de célula cancerosas preliminares das amostras cirúrgicas do cancro gastric. Os métodos fornecem uma ferramenta útil para o desenvolvimento de drogas e pesquisa de biologia do câncer.

Estabelecimento de modelos de xenoenxertos derivados de câncer gástrico e linhas celulares primárias

Este artigo descreve a geração de um modelo de camundongo ortotópico de mesotelioma pleural humano a implantação de células mesotelioma H2052/484 na cavidade pleural de camundongos atímicos imunocomprometidos. O monitoramento longitudinal do desenvolvimento de tumores intrapleural foi avaliado por imagens multimodais não invasivas [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron e imagens de tomografia computadorizada.

Implantação e monitoramento por PET/CT de um modelo ortotópico de mesotelioma pleural humano em camundongos atímicos

Aprenda a gerar e expandir linhas tumorais primárias de mesotelioma pleural a partir de tecido cirúrgico. Este protocolo padronizado reduz a contaminação por fibroblastos e permite estudar interações tumor-imunidade in vitro.

Geração e Expansão das Linhas tumorais primárias e malignas do mesotelioma

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