Name: Estudando o tráfico de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de Drosophila usando proteínas marcadas pelo eGFP (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Aprenda a localizar proteínas de membrana em fotorreceptores de Drosophila usando eGFP e microscopia de imersão em água. Este método não invasivo permite estudar a degeneração retinana e as bases moleculares da cegueira hereditária humana.

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Gostaríamos de agradecer aos nossos pesquisadores estudantes ao longo dos anos. Em particular, Nina Meyer, Sibylle Mayer, Juliane Kaim e Laura Jaggy, cujos dados foram utilizados neste protocolo como resultados representativos. A pesquisa do nosso grupo aqui apresentada foi financiada por subvenções da Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) para Armin Huber.

<ol><li>Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+protein+trafficking+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration.+9%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration.</a> Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31(2014).</li>
<li>Schopf, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+trafficking+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells.</a> European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photoreceptor+array+of+the+dipteran+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The photoreceptor array of the dipteran retina.</a> Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).</li>
<li>Wang, T., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+and+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila.</a> Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).</li>
<li>Xiong, B., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+homeostasis+and+retinal+degeneration%3A+lessons+from+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly.</a> Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).</li>
<li>Bähner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-regulated+subcellular+translocation+of+Drosophila+TRPL+channels+induces+long-term+adaptation+and+modifies+the+light-induced+current%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current.</a> Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).</li>
<li>Cronin, M. A., Lieu, M. -H., Tsunoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+stages+of+light-dependent+TRPL-channel+translocation+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).</li>
<li>Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+translocation+of+the+eGFP-tagged+TRPL+channel+in+Drosophila+photoreceptors+requires+activation+of+the+phototransduction+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade.</a> Journal of Cell Science. 119, Pt 12 2592-2603 (2006).</li>
<li>Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+TRPL+ion+channel+shares+a+Rab-dependent+translocation+pathway+with+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).</li>
<li>Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+D+and+retromer+promote+recycling+of+TRPL+ion+channel+via+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum.</a> Traffic. , (2021).</li>
<li>Franceschini, N., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+ph%C3%A9nom%C3%A9nes+de+pseudopupille+dans+l%27oeil+compose+de+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Kybernetik%22%5BJournal%5D)">Les phénoménes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila.</a> Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).</li>
<li>Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+visualization+approach+for+identifying+mutations+that+affect+differentiation+and+organization+of+the+Drosophila+ommatidia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia.</a> Development. 128 (6), 815-826 (2001).</li>
<li>Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+fluorescent+proteins+for+functional+dissection+of+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).</li>
<li>Meyer, N. Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Karlsruhe+%28TH%29%22">University of Karlsruhe (TH)</a>. , Karlsruhe. (2005).</li>
<li>Meyer, N., Oberegelsbacher, C., Dürr, T. D., Schäfer, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eGFP-based+genetic+screen+for+defects+in+light-triggered+subcelluar+translocation+of+the+Drosophila+photoreceptor+channel+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL.</a> Fly. 2 (1), 36-46 (2008).</li>
<li>Zheng, L., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lola+regulates+cell+fate+by+antagonizing+Notch+induction+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye.</a> Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).</li>
<li>Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+cytoplasmic+DEAD+box+helicase+Dbp21E2+in+rhodopsin+maturation+and+photoreceptor+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).</li>
<li>Huang, Y., Xie, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fluorescence-based+genetic+screen+to+study+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila.</a> PloS One. 10 (12), 0144925(2015).</li>
<li>Zhao, H., Wang, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V-ATPase+V1+subunit+A1+is+required+for+rhodopsin+anterograde+trafficking+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).</li>
<li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+complex+proteins+are+required+for+rhodopsin+biosynthesis+and+photoreceptor+survival+in+Drosophila+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).</li>
<li>Zhao, H., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PE+homeostasis+rebalanced+through+mitochondria-ER+lipid+exchange+prevents+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 16 (10), 1009070(2020).</li>
<li>Cerny, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GTP-+and+phospholipid-binding+protein+TTD14+regulates+trafficking+of+the+TRPL+ion+channel+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells.</a> PLoS Genetics. 11 (10), 1005578(2015).</li>
<li>Richter, D. Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Karlsruhe+%28TH%29%22">University of Karlsruhe (TH)</a>. , Karlsruhe. (2007).</li>
<li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).</li>
<li>Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+phosphoinositides+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).</li>
<li>Chakrabarti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dPIP5K+dependent+pool+of+phosphatidylinositol+4%2C5+bisphosphate+%28PIP2%29+is+required+for+G-protein+coupled+signal+transduction+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors.</a> PLoS Genetics. 11 (1), 1004948(2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A aplicabilidade das proteínas de fluorescência e a simplicidade da triagem por imagem DPP e microscopia de imersão em água da retina tem sido comprovadamente bem sucedida por muitos grupos12. Estratégias semelhantes às apresentadas aqui têm sido utilizadas em diversas telas genéticas para detectar defeitos nos níveis de expressão de rodopsina, homeostase, organização da retina ou integridade celular com a ajuda de Rh1::eGFP 17,18,19,20,21.</sup...

Ao fornecer e remover proteínas de e para a membrana plasmática, o tráfico de proteínas de membrana nos neurônios controla o equipamento de membrana plasmática com receptores, bem como canais de íons e, como resultado, regula a função neuronal. A má regulação ou defeitos no tráfico de proteínas normalmente têm efeitos prejudiciais sobre as células e resultam em degeneração neuronal. Em humanos, isso pode causar doenças neurodegenerativas como Alzheimer e Mal de Parkinson ou Retinite pigmentosa1. Fotorreceptores no olho composto de Drosophila melanogaster tornaram-se um sistema modelo in vivo para estudar o tráfico de proteínas de membrana2. Isso não se deve apenas à versatilidade genética da Drosophila que permite telas genéticas eficazes, mas também porque todos os componentes essenciais da membrana fotorreceptora absorvente da luz são caracterizados em grande detalhe e técnicas microscópicas eficientes estão disponíveis que podem ser aplicadas ao olho mosca. Essas técnicas são o foco deste artigo.
Nas células fotorreceptoras de Drosophila, a membrana plasmática apical forma uma pilha densamente embalada de microvilli ao longo de um lado da célula, chamada rabdomero. Os rabdomeres das células fotorreceptoras R1-6 são dispostos em um padrão trapezoidal característico, enquanto as células fotorreceptoras R7 e R8 formam um único rabdomero no centro deste trapezoide3. O tráfico de proteínas de membrana é necessário para uma rotatividade regulamentada de proteínas de membrana rabdomeral, como a rodopsina e os canais de íons TRP ativados pela luz (potencial do receptor transitório) e TRPL (semelhante ao TRP) para garantir a quantidade adequada dessas proteínas de fototransdução no rabdomere. As proteínas da membrana fotorreceptora são sintetizadas no ânticulo endoplasmático e transportadas através do aparelho Golgi para o rabdomiô. Após a ativação da rodopsina pela luz, uma molécula de rodopsina pode ficar inativada pela absorção de um segundo fóton ou pode ser removida do rabdomero por endocitose mediada por clathrin. A rodopsina endocitada ou se degrada no lysosome ou é reciclada de volta ao rabdomere 4,5. O canal de íonS TRPL também é internalizado após a ativação da cascata de fototransdução e passa por uma translocação dependente da luz entre o rhabdomere (onde está localizado quando as moscas são mantidas no escuro) e um compartimento de armazenamento enriquecido em ER no corpo celular (para o qual é transportado dentro de várias horas após a iluminação)6,7, 8, 9,10 . Em contraste com a rodopsina endocitada, apenas pequenas quantidades de TRPL são degradadas através da via endolíssóica, e a maioria é armazenada intracelularmente em vez disso e reciclada de volta ao rabdomero após a adaptação escura6. Assim, o TRPL pode ser usado para analisar o tráfico de proteínas de membrana plasmática. As células fotorreceptoras de drosophila também são empregadas para estudar a degeneração neuronal. A degeneração celular fotorreceptora é frequentemente determinada pela avaliação da estrutura dos rabdomiados, que se desintegram como resultado dos processos degenerativos5.
Para estudar a localização subcelular de TRPL e rhodopsina em células fotorreceptoras ou degeneração celular fotorreceptora, dois métodos de microscopia de fluorescência que diferem em relação à velocidade e resolução da análise foram aplicados aqui. Um método muito rápido e não invasivo que pode ser usado para telas genéticas, mas com uma resolução espacial limitada é a detecção de fluorescência no pseudopupil profundo (DPP). O DPP é um fenômeno óptico de olhos compostos artrópodes cuja origem geométrica foi explicada em detalhes por Franceschini e Kirschfeld em 197111. Em suma, em vários planos ópticos abaixo da sobreposição de retina imagens de rabdomeros de ommatidia adjacentes podem ser observados. Em um plano focal através do centro da curvatura do olho, essas projeções sobrepostas formam uma imagem que se assemelha ao layout trapezoidal de rabdomeres em um único ommatidium apenas ordens de magnitude maior. Este fenômeno também pode ser observado independentemente da expressão exógena de proteínas de fluorescência (por exemplo, TRPL:::eGFP8), que, no entanto, tornam o DPP mais fácil de detectar (Figura 1A-A'')12. Um segundo método não invasivo é a microscopia de imersão hídrica que se baseia em proteínas fluorescentes marcadas por imagens após neutralizar o aparelho dicótrico dos olhos com água (Figura 1B-C'')12. Utilizando o método de imersão em água, a quantidade relativa de TRPL::eGFP nos rabdomers ou corpo celular pode ser avaliada quantitativamente para células fotorreceptoras individuais. Além disso, proteínas não translocantes marcadas por fluorescência podem ser utilizadas para avaliar a integridade rabdomeral e determinar o curso temporal de uma potencial degeneração de forma quantitativa, conforme descrito aqui.
Embora as gravações do DPP sejam de longe os métodos mais fáceis e rápidos de executar, a resolução espacial dos dados que eles geram é limitada. Além disso, existem inúmeras razões pelas quais um DPP pode estar ausente, que não são necessariamente perceptíveis pela própria imagem DPP. Uma vez que o DPP representa uma soma de várias ommatidia, as informações sobre células individuais são perdidas. Assim, a imagem DPP de baixa resolução serve a uma função importante na triagem de um grande número de moscas, mas geralmente deve ser seguida por gravações de maior resolução por meio de microscopia de imersão hídrica. Micrografos de imersão hídrica permitem interpretações sobre células individuais, defeitos de desenvolvimento, morfologia ocular, mislocalização proteica ou degeneração da retina, bem como quantificação desses efeitos. Este Protocolo descreve essas duas técnicas em detalhes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63375/63375fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral das variações de microscopia para o olho de Drosophila apresentadas neste Protocolo. Representações esquemáticas e micrografias exemplares de (A-A'') imagem de pseudopupil fluorescente (DPP), (B-B'') microscopia letal de imersão em água de rabdominais fluorescentes, e (C-C'') microscopia de gota de água não letal de rabdomeros fluorescentes. Barra de escala (A''): 100 μm. Barras de escala (B''-C''): 10 μm. O valor foi modificado a partir da referência13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63375/63375fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>CO2 almofada de mosca anestésica</td><td>Flystuff</td><td>59-172</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada de luz fria (KL 1500 LCD)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência com lâmpada UV, câmera, conjunto de filtros e software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 azul edição)</td> Tubo fluorescente <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Lumilux T8, L 30W / 840, 4000 K, G13) [1750 Lux, Ee470nm = 298 &micro; W cm-2, Ee590nm = 215 &micro; W cm-2] e [760 Lux, Ee470nm = 173 &micro; W cm-2, Ee590nm = 147 &micro; W cm-2]</td><td>Pipeta de</td> laboratório <td>Osram 4050300518039</td><td></td></tr><tr><td>(20-200 &micro; L)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Object slide</td><td>Roth</td><td>0656.1</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (94 mm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633102</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta (200 &micro; L)</td> <td>Labsolute</td><td>7695844</td><td></td></tr><tr><td>plasticina (Blu-Tack)</td> <td>Bostik</td><td>30811745</td><td></td></tr><tr><td>microscópio estéreo (SMZ445)</td> <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscópio estéreo com lâmpada UV, câmera, conjunto de filtro e software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)</td> <td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

estudando o tráfico de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de drosophila usando proteínas marcadas pelo egfp

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

O tráfico de proteínas de membrana regula a incorporação e remoção de receptores e canais de íons na membrana plasmática. Esse processo é fundamentalmente importante para a função celular e a integridade celular dos neurônios. As células fotorreceptoras de drosophila tornaram-se um modelo para estudar o tráfico de proteínas de membrana. Além da rodopsina, que após a iluminação torna-se internalizada a partir da membrana fotorreceptora e é degradada, o canal de íons de íons potencial-semelhante ao receptor transitório (TRPL) em Drosophila exibe uma translocação dependente da luz entre a membrana fotorreceptora rabdomeral (onde está localizada no escuro) e o corpo celular fotorreceptor (para o qual é transportado após a iluminação). Este transporte intracelular de TRPL pode ser estudado de forma simples e não invasiva expressando TRPL marcado pelo EGFP em células fotorreceptoras. A fluorescência eGFP pode então ser observada tanto no pseudopupil profundo quanto por microscopia de imersão hídrica. Esses métodos permitem a detecção de fluorescência no olho intacto e, portanto, são úteis para ensaios de alto rendimento e telas genéticas para mutantes de Drosophila defeituosos na translocação TRPL. Aqui, a preparação de moscas, as técnicas microscópicas, bem como os métodos de quantificação utilizados para estudar esta translocação acionada pela luz de TRPL são explicados em detalhes. Esses métodos podem ser aplicados também para estudos de tráfico em outras proteínas fotorreceptoras de Drosophila , por exemplo, rhodopsina. Além disso, utilizando proteínas rabdomerais marcadas pelo eGFP, esses métodos podem ser usados para avaliar a degeneração de células fotorreceptoras.

Foram geradas moscas transgênicas de Drosophila expressando uma proteína de fusão TRPL::eGFP sob o controle do promotor de rodopsina 1. Nestas moscas, TRPL::eGFP é expresso em células fotorreceptoras R1-6 do olho composto e exibe uma localização dependente da iluminação. Quando as moscas são mantidas no escuro, TRPL::eGFP é incorporada aos rabdomiôs externos. Após a iluminação por várias horas, o TRPL transloca-se no corpo celular onde é armazenado em um compartimento enriquecido com ER. ...

Aqui, métodos não invasivos são descritos para localização de proteínas de membrana fotorreceptora e avaliação da degeneração da retina no olho composto de Drosophila usando fluorescência eGFP.

Estudando o tráfico de proteínas de membrana em células fotorreceptoras de Drosophila usando proteínas marcadas pelo eGFP

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

Proteínas fotorreceptoras marcadas por GFP, como o canal de íonS TRPL GFP, permitem estudar o transporte de proteínas em neurônios usando técnicas não invasivas. Este método também pode ser usado para monitorar a degeneração do fotorreceptor. Assim, a base molecular de doenças hereditárias que resultam em cegueira em humanos pode ser estudada no olho de Drosophila.A localização celular de proteínas marcadas por GFP pode ser avaliada observando a fluorescência no pseudopupil profundo ou por microscopia de imersão na água. Ambos os métodos permitem a rápida determinação da localização de proteínas visuais e a observação de defeitos estruturais de rabdomeres devido à degeneração das células fotorreceptoras. Para obter imagens de alta qualidade, o aspecto mais importante é a orientação do olho mosca.Ao executar esta técnica, deve-se focar na ommatidia localizada ligeiramente em direção à periferia do olho. Demonstrarei o procedimento de imagem DPP, enquanto as duas técnicas que utilizam microscopia de imersão hídrica serão demonstradas pela minha colega, Dra. Para começar o pseudopupil profundo, ou DPP, imagem, anestesiar moscas de um a três dias de idade, e posicionar uma delas no centro do objetivo do microscópio em seu lado para que o olho esquerdo ou direito esteja voltado precisamente para o objetivo.Aumente a ampliação para caber o olho inteiro, e centralizar a ommatidia central do olho. Se possível, diminua a profundidade de campo do microscópio ajustando o diafragma de íris dupla para um ajuste raso. Em seguida, ligue a lâmpada UV do microscópio em intensidade máxima.Em seguida, selecione o conjunto de filtro de fluorescência do microscópio de acordo com a proteína de fluorescência expressa nos olhos, e defina o caminho leve em direção à câmera montada no microscópio. Usando o recurso de imagem ao vivo dentro do software, ajuste o brilho da imagem para uma configuração que detecta apenas sinais específicos do olho, elevando o tempo de exposição e ganhando valor. Reajustar o foco do microscópio no olho para gerar a imagem sobreposta do DPP.Em seguida, tire uma foto do DPP fluorescente. Para preparar uma mosca em uma variação letal, adere um pedaço de Plasticine em um slide de objeto e outro pedaço no centro de uma placa de Petri. Encha a placa de Petri com água destilada gelada e alguns flocos de gelo.Em seguida, coloque uma mosca anestesizada de gelo sob um microscópio estéreo em cima do slide de objeto revestido de plasticina. Vire a mosca de costas, e fure um pino de inseto pelo centro do tórax. Fixar o pino horizontalmente no slide do objeto revestido de plasticine e orientar o olho esquerdo ou direito da mosca para cima.Em seguida, fixar cuidadosamente o slide do objeto com seu lado livre de plasticine voltado para baixo na placa de Petri, impedindo a rotação da cabeça de mosca. Certifique-se de que o olho de mosca está coberto de água. Alternativamente, para preparar uma mosca em uma variação não letal, transfira a cabeça de mosca anestriizada por gelo primeiro em uma ponta de pipeta de 200 microliter, e empurre cuidadosamente a mosca em direção à ponta com ar comprimido.Em seguida, usando um bisturi, corte a ponta da pipeta bem na frente da cabeça, e usando pinças empurre cuidadosamente a mosca alguns milímetros para dentro da ponta pipeta. Corte a ponta da pipeta novamente, e empurre a mosca de volta para a ponta com o ar comprimido para que apenas a cabeça da mosca se saliente da ponta pipeta. Depois de aderir um pedaço de Plasticine em um slide de objeto, pressione a ponta da pipeta nele para que o olho esquerdo ou direito fique de frente para cima.Certifique-se de que o olho está orientado corretamente sob o microscópio. Para aquisição de imagens, selecione um objetivo de imersão em água. No caso de uma variação não letal, use uma pipeta de laboratório para aderir a uma grande gota de água gelada na parte inferior do objetivo de imersão hídrica.Coloque cuidadosamente o slide do objeto com a mosca preparada no estágio do microscópio. Em seguida, abaixe o objetivo de imersão em água manualmente até que entre em contato com a superfície da água ou o olho da mosca toque a gota. Em seguida, mude o caminho da luz em direção à câmera do microscópio e gere uma imagem ao vivo.Reajuste o foco para a câmera, e avalie a orientação do olho, considerando que o olho deve enfrentar o microscópio objetivo radialmente. Use o software de tabela de procuração para detectar a supersaturação. No caso de moscas não pigmentadas, ajuste o tempo de exposição de modo que os pixels mais brilhantes estejam logo abaixo do limite de saturação para cada imagem.Grave uma imagem e salve-a como um arquivo bruto para arquivar todos os metadados correspondentes da gravação. Em seguida, exporte a imagem em formato tif. Para quantificar a fluorescência relativa eGFP nos rabdomeros dos micrografos de imersão de água, ajuste as configurações do ImageJ clicando em Analisar, em seguida, definir medidas e verificar apenas a caixa para significar valor cinza.Importe a imagem do tif clicando em Arquivo e, em seguida, Abra. Escolha uma região representativa da imagem em foco e amplie-a para 200 a 300%, pressionando repetidamente o Controle e juntos. Em seguida, selecione a ferramenta Oval e, ao pressionar a tecla Shift, gere uma seleção circular na imagem significativamente menor que um rabdomero fluorescente.Em seguida, procure o tamanho exato exibido abaixo da barra de ferramentas na janela principal ImageJ. Para medir as intensidades de fluorescência dentro da seleção circular, mova o círculo para o primeiro rabdomero com as teclas de seta no teclado e clique em Analisar, em seguida, Mexa. Uma janela de resultado listando o valor cinza medido aparecerá.Continue com medições de rabdomeres de dois a seis, e também meça o sinal de fundo. No caso de moscas não pigmentadas, faça medições adicionais das áreas correspondentes do corpo celular. Meça a fluorescência de mais duas ommatidia, resultando em três réplicas técnicas.Marque a ommatidia analisada usando a ferramenta Lápis e salve esta imagem para documentação. Selecione e copie os valores cinzentos medidos da janela de resultado e cole-os em software de planilha para cálculos adicionais. Classifique os valores de intensidade de fluorescência de acordo com sua origem nas categorias rabdomere, corpo celular e fundo, e calcule a intensidade média de cada categoria.Em seguida, calcule a quantidade relativa de eGFP presente no rabdomere utilizando a primeira fórmula para olhos não pigmentados e a segunda para olhos pigmentados. Alternativamente, para quantificar a morfologia dos olhos pela fluorescência eGFP em micrografos de imersão em água, escolha três ommatidia adjacentes em uma região representativa da imagem que está em foco. Avalie os 18 rhabdomeres da seleção individualmente de acordo com sua intensidade eGFP, nitidez da borda e contraste com relação ao sinal de fundo circundante.Por fim, escorra os rabdomeros claramente visíveis com um valor de dois rabdomers visíveis semanais com um valor de um, e rabdomers ausentes com um valor de zero para gerar um índice de degeneração. Em moscas transgênicas de Drosophila expressando uma proteína de fusão eGFP TRPL, a fluorescência rabdomeral desaparece à luz devido à translocação do eGFP TRPL. Isso permite a realização de uma tela genética para identificar mutantes defeituosos na internalização do eGFP TRPL.Em moscas de controle, o eGFP TRPL transloca-se para fora dos rabdomers para o corpo celular após 16 horas de iluminação, resultando em uma diminuição significativa da fluorescência rabdomeral em comparação com o estado adaptado à escuridão. A segunda incubação escura eleva novamente a fluorescência rabdomeral em direção ao valor inicial. No entanto, na translocação TRPL defelocação mutante defetiva vps35MH20, o padrão de fluorescência não muda drasticamente após 16 horas de iluminação e uma adaptação escura subsequente por 24 horas.Este método de quantificação pode detectar um defeito de reciclagem estatisticamente altamente significativo. Moscas de olhos brancos permitem a detecção de sinais de fluorescência tanto do rhabdomere quanto do corpo celular. Em contraste, em moscas de olhos vermelhos, sinais de fluorescência só são detectáveis em rabdomers, mas não no corpo celular.Quanto à quantificação da degeneração da retina, a fluorescência eGFP TRP pode ser avaliada ao longo de várias semanas. Quando mantido em um ciclo escuro de 12 horas e luz por duas semanas, o índice de degeneração diminuiu em moscas mutantes, mas não em moscas de controle. Neste protocolo, é preciso diferenciar entre olhos pigmentados e não pigmentados.Uma vez que a pigmentação afeta o sinal fluorescente, a microscopia quantitativa de imersão em água tem sido otimizada para ambos os casos individualmente. As imagens DPP e a microscopia de imersão na água são métodos de alta produtividade com resolução limitada. Para investigar a localização subcelular, recomendamos microscopia de imunofluorescência em seções teciduais.Para uma análise detalhada de fenótipos degenerativos, a microscopia eletrônica pode ser realizada.

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Biology

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