Quantificando o transporte de ferro através da placenta de camundongo in vivo usando isótopos de ferro não radioativos

Este protocolo é significativo porque permite que os pesquisadores rastreiem e quantifiquem a distribuição de ferro in vivo sem a necessidade de radioatividade. Como vários isótopos estáveis de ferro podem ser detectados simultaneamente dentro da mesma amostra, essa técnica pode ser usada para entender a absorção, regulação e distribuição de ferro de diferentes fontes. Para começar, adicione 12 ácidos clorídricos normais ao ferro-58 no frasco de vidro fornecido pelo vendedor e substitua a tampa frouxamente.

Para dissolver o ferro, aqueça a solução a 60 graus Celsius por uma hora. Se ainda não estiver dissolvido, deixe a solução durante a noite à temperatura ambiente no exaustor para se dissolver. Em seguida, para gerar a solução de cloreto férrico, oxide qualquer cloreto ferroso restante, aquecendo a solução a 60 graus Celsius com a tampa desligada para facilitar a oxidação.

Adicione um microlitro de peróxido de hidrogênio a 35% por 50 microlitros da solução para facilitar ainda mais a oxidação. Deixar a solução de cloreto férrico no exaustor a 60 graus Celsius com a tampa afastada para evaporar a amostra. Em seguida, reconstitua o cloreto férrico para 100 milimoles com água ultrapura.

Calcule a quantidade de água necessária com base no peso inicial do metal. Em seguida, prepare um mililitro de nitrilotriacetato férrico incubando a solução de cloreto férrico preparada com nitrilotriacetato na proporção molar de um para cinco na presença de 20 milimolares de bicarbonato de sódio por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, dissolver 500 miligramas de apotransferrina em quatro mililitros de transferência e tampão de carga, e adicionar quatro mililitros desta solução de apotransferrina à solução de nitrilotriacetato férrico preparada no tubo de 15 mililitros.

Para permitir a carga máxima do nitrilotriacetato férrico na apotransferrina, verifique se a solução está a pH 7,5 e ajuste o pH, se necessário, com bicarbonato de sódio ou ácido clorídrico. Incubar a mistura durante 2 horas e meia à temperatura ambiente. Em seguida, remova o excesso de nitrilotriacetato férrico não ligado e liberado nitrilotriacetato transferindo a solução de transferrina de ferro-58 para uma coluna de corte de peso molecular e centrifugando a coluna.

Após centrifugação, lavar a coluna duas vezes, adicionando 10 mililitros de tampão de carregamento de transferrina e centrifugando a coluna. Em seguida, lave a coluna com 10 mililitros de solução salina e centrífuga novamente. Finalmente, esterilize a solução de transferrina de ferro-58 usando um filtro de seringa de 0,22 mícron e armazene a quatro graus Celsius até que esteja pronta para uso.

Prepare uma solução de transferrina de ferro 58 de 35 miligramas por mililitro em solução salina. Em seguida, coloque uma rata grávida anestesiada em uma almofada de aquecimento e injete lenta e cuidadosamente a solução de transferrina de ferro-58 no seio retroorbital. Seis horas após a injeção, eutanasie o rato e remova cuidadosamente o útero usando pinça estéril e tesoura de dissecação.

Corte uma unidade placentária fetal composta por um único feto e placenta no saco amniótico cercado por uma porção do útero. Em seguida, corte cuidadosamente o útero e o saco amniótico sem perturbar o feto e a placenta. Em seguida, descasque o saco amniótico e remova o feto e a placenta.

Depois de cortar o cordão umbilical, limpe o feto e a placenta em uma limpeza para remover o excesso de líquido amniótico e registre o peso de toda a placenta. Corte cada placenta ao meio com uma lâmina de barbear. Coloque cada metade em um tubo de dois mililitros e congele em nitrogênio líquido.

Para coletar os fígados embrionários, sacrifique o embrião e fixe o embrião para estabilização, deixando o abdômen exposto. Usando tesoura de dissecação fazer uma pequena incisão onde o cordão umbilical foi anexado. Insira uma extremidade da tesoura de dissecção na incisão e execute um corte plano médio de 1/4 de polegada em direção ao plano coronal.

Em seguida, realize cortes planos transversais para expor o fígado fetal. Usando fórceps, remova o fígado fetal e registre o peso de todo o fígado embrionário. Coloque todo o fígado embrionário em um tubo de dois mililitros e congele-o em nitrogênio líquido.

Armazene os tecidos indefinidamente a menos 80 graus Celsius. Para quantificar o ferro não-heme na placenta e nos fígados fetais, descongele as metades placentárias e os fígados fetais inteiros. Em seguida, pese as metades placentárias.

Adicione 400 microlitros de solução de precipitação de proteína às amostras de tecido e homogeneize o tecido usando um homogeneizador elétrico. Incubar as amostras a 100 graus Celsius durante uma hora. Em seguida, esfrie-os à temperatura ambiente em água por dois minutos.

Abra as tampas para liberar a pressão. Em seguida, feche os tubos novamente. Depois de centrifugar a amostra para pellet os detritos de tecido, transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo marcado para análise ICP-MS.

Em seguida, para quantificar o ferro heme, registre o peso do pellet obtido após a centrifugação. Em seguida, digera os pellets em 10 mililitros de ácido nítrico concentrado a 70%, suplementado com um mililitro de peróxido de hidrogênio a 30%. Aqueça as amostras a 200 graus Celsius por 15 minutos antes de enviá-las para análise ICP-MS.

A medição da ICP-MS permitiu a detecção de dois isótopos de ferro diferentes. O isótopo de ferro mais abundante, o ferro-56, reflete alterações iônicas crônicas nos tecidos. Outro isótopo, o ferro-58, reflete mudanças agudas na distribuição do ferro injetado.

A medição de ferro-56 confirmou que os fígados embrionários de gestações deficientes em ferro diminuíram as reservas de ferro em comparação com aqueles em gestações repletas de ferro. A medição de ferro-58 confirmou que, em gestações deficientes em ferro, menos ferro foi transferido para o fígado embrionário durante seis horas do que em gestações repletas de ferro. Ao realizar o procedimento, lembre-se de registrar o peso dos tecidos.

Estes pesos são necessários para calcular as concentrações de ferro. Como o ferro-58 não requer precauções especiais de manuseio e descarte, o tecido não processado pode ser usado para outras análises, incluindo, mas não limitado a, western blotting, ou qPCR.